Name: Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę sztucznego karmienia kleszczy przez silikonową membranę w komorze drukowanej 3D. System umożliwia badania nad przenoszeniem chorób przez wektory przy minimalnych objętościach krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za sumienną pracę studentów i pracowników studiów licencjackich, Kary Golden, Sydney Ingham oraz Omaymy Jaddou Najma, którzy pomagali przy karmieniu kleszczy oraz przy ustawianiu komory i błony dla kleszczy.

Eksperymenty z karmieniem kleszczy przeprowadzono przy użyciu komercyjnie dostępnej zdefibrinowanej krwi bydła (Hemostat Laboratories, CA, USA) oraz defibrinowanej ludzkiej krwi (Bioivt, CA, USA), która pobiera i przetwarza krew zgodnie z protokołami i wytycznymi zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Institutional Review Board (IRB). W badaniu nie użyto żywych kręgowców do karmienia kleszczy. Wszystkie kleszcze używane w tym protokole zostały zakupione w ośrodku hodowli kleszczy Oklahoma State University. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Komory do karmienia kleszczy
<ol>
	<li>Projektuj komory za pomocą darmowego oprogramowania do projektowania 3D, aby pasowały do szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm. Rozmiary drukowanych części (Rysunek 1A) przedstawiają się następująco: korpus komory (część i) 25 mm (średnica wewnętrzna) x 20 mm (wysoka), z grubością ścianki 3 mm u podstawy i 6 mm grubością ścianki przy pierścieniu pokrywy (część ii), 30 mm (średnica wewnętrzna) x 5 mm (wysoka) i 3,5 mm grubość ścianki oraz pierścień zewnętrzny (część iii), 31 mm (średnica wewnętrzna) x 5 mm (wysoka) oraz 3 mm grubość ścianki. UWAGA: Pierścień pokrywy zawiera cztery okrągłe otwory o średnicy 3 mm x 2 mm (wysokość) na górze, aby umieścić magnesy. Górna część komory ma również otwory o tej samej wielkości do mocowania magnesów (Rysunek 1B). Projekt modelu 3D powinien być zapisany jako plik .stl , najczęściej stosowany format druku 3D. Pliki zawierające trójwymiarowy projekt używany w tym protokole będą udostępniane na życzenie.</li>
	<li>Komory drukarskie z użyciem 10-calowej drukarki 3D LCD 14K z szarymi lub białymi żywicami fotopolimerowymi (Rysunek 1A) lub innej wysokiej rozdzielczości drukarki/usług 3D, która drukuje modele 3D z pliku .stl. UWAGA: Protokół ten wykorzystywał usługi drukarskie oraz żywice Uniwersytetu Arizony. Użycie żywic o wysokiej rozdzielczości zapewnia tworzenie szczegółowych i trwałych komór.</li>
	<li>Używając rękawiczek, upewnij się, że na częściach nie ma pozostałości żywicy przed montażem, myjąc ją i, jeśli to konieczne, delikatnie szlifując drobnym papierem ściernym (180 do 200 grit). Upewnij się, że płaskie dno części i (rysunek 1A) jest gładkie. Zapewnia to prawidłowe przyleganie membrany silikonowej, zmniejszając ryzyko przecieku.</li>
	<li>Wszystkie suche elementy wystaw na działanie światła UV przez 10 minut, aby zapewnić pełną polimeryzację żywicy. UWAGA: Większość firm druku 3D używających toksycznych żywic do druku używa światła UV do utwardzania żywicy (utwardzając modele i usuwając toksyczność żywicy); jednak czasami pozostaje "nie w pełni wytwardzona". Model niew całkowicie utwardzony pozostanie lekko lepki w dotyku i może zawierać niepolaryzowaną żywicę, która może być toksyczna lub powodować podrażnienia podczas manipulacji. Dodatkowa ekspozycja na światło UV zapewni całkowite utwardzenie żywicy.</li>
	<li>Przyklej okrągłe magnesy 3 mm x 2 mm do szczelin na górze komór i pierścieni pokryw, używając przezroczystego kleju epoksydowego. Pozwól wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej (20–25 °C/minimum 16 h). Upewnij się, że bieguny magnesów są skierowane w jednym kierunku, aby odpowiadały przyciąganiu biegunów na magnesach w górnej części pierścienia pokrywy (Rysunek 1A, część ii).</li>
	<li>Złóż wszystkie elementy modelu, aby zapewnić prawidłowe dopasowanie wszystkich elementów, jak pokazano na rysunku 1A–C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie błony
<ol>
	<li>Umieść kawałek folii o wymiarach 30 cm x 30 cm na czystej powierzchni i upewnij się, że jest wolna od pognieceń, rozciągając ją na płaskiej powierzchni i zabezpieczając krawędzie taśmą (rysunek 2Ai).</li>
	<li>Połóż 4–5 pojedynczych arkuszy papieru do czyszczenia soczewek na wydłużonym kawałku folii spożywczej, odstępowanym od siebie 5 cm (Rysunek 2Aii).</li>
	<li>Przygotuj membranę silikonową, używając poniższych komponentów i ilości. UWAGA: Ilości te wystarczają do przygotowania 4–5 membran (7 cm × 12 cm), z których każda mieści do 5–6 komór karmiących, co daje łącznie 20–30 komór.</li>
	<li>Przygotować mieszankę silikonową, łącząc 15 g silikonowego przezroczystego uszczelniacza (twardość 20–25 Shore A) i dodając 4,5 g oleju silikonowego (30% całkowitej ilości silikonu) oraz 2,9 g heksanu (19,3% całkowitej ilości silikonu). Włóż składniki do plastikowej wagi i delikatnie wymieszaj szpatułką (rysunek 2Aiii). UWAGA: Dbaj o minimalne tworzenie się bąbelków, delikatnie mieszając składniki.</li>
	<li>Umieść 2–3 g mieszanki silikonowej wzdłuż mniejszej krawędzi papieru soczewki, aby przymocować ją do folii plastikowej. Pozwól silikonowi przesiąkać przez papier soczewki 5–10 sekund (rysunek 2Aiv).</li>
	<li>Równomiernie rozprowadz mieszankę silikonową na arkuszu papieru soczewki za pomocą prostego narzędzia, takiego jak pokrywka, linijka lub szpatułka. Upewnij się, że użyty obiekt pokrywa całą powierzchnię papieru soczewki (rysunek 2Av). Zapewnia to pokrycie silikonem jednym pociągnięciem, zapobiegając falowaniu błony i falowaniu na krawędzi obiektu.</li>
	<li>Upewnij się, że cała mieszanka silikonowa jest użyta w membranie, cofając narzędzie rozprowadzające do pozycji wyjściowej do rozprowadzania. Ponieważ na narzędziu do rozprowadzania zostanie zachowana mieszanka silikonu, powrót do pobrania z narzędziem zapewni, że cały silikon zostanie użyty, aby uniknąć szczelin (rysunek 2Avi). UWAGA: Błona powinna być jednolita przezroczysta bez falowań (Rysunek 2B).</li>
	<li>Membrany o różnych grubościach przygotowuj się początkowo, dodając więcej lub mniej mieszanki silikonowej, ponieważ grubości nie można zmierzyć, dopóki membrany nie wyschną.</li>
	<li>Pozwól membranom wyschnąć na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej (20–25 °C/minimum 16 godzin).</li>
	<li>Zmierz grubość membrany za pomocą cyfrowego narzędzia do pomiaru mikrometru zewnętrznego. Różne grubości błony stosuje się dla różnych dorosłych gatunków kleszczy, od krótkich części pyska (70 μm grubości błony) po dłuższe nastroje gębowe (200 μm grubości błony).</li>
	<li>Wyjmij wszystkie części z wcześniej złożonych komor i nałóż klej silikonowy na dolną krawędź komór. Aby precyzyjnie rozłożyć klej, użyj strzykawki o 1 ml i napełnij ją klejem silikonowym (rysunek 2Ci).</li>
	<li>Umieść końcówkę pipety o pojemności 200 μL na końcówce strzykawki (zamiast igły) do nałożenia kleju (Rysunek 2Cii) i przykręć ją na koniec strzykawki, podobnie jak na końcówce igły (Rysunek 2Ciii). Pozwoli to na drobne nałożenie kleju na dolną krawędź każdej komory (rysunek 2Civ).</li>
	<li>Umieść komorę nad membraną (Rysunek 1, część i) z obciążonym przedmiotem, aby zapewnić osadzanie się. Pozostawić na noc w temperaturze pokojowej (20–25 °C/minimum 16 h) (Rysunek 2D,E). UWAGA: Używaj dowolnego płaskiego przedmiotu ważonego. Protokół ten wykorzystywał kawałek akrylu o masie 2,5 kg (rysunek 2E).</li>
	<li>Wytnij nadmiar błony z komór za pomocą zakrzywionych nożyczek (Rysunek 3A).</li>
	<li>Przed użyciem komory do karmienia kleszczy usuń pozostałą folię spożywczą (tam, gdzie membrana jest przygotowana (krok 2.1)) (rysunek 3B).</li>
	<li>Złóż części komory z powrotem, dołącz na dole szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm i użyj pokrywek naczyń jako pokrywek komór, odwracając je i umieszczając między magnesami (rysunek 3C,D). UWAGA: Używaj pokrywek odwróconych, ponieważ pierścień uchwytu pokrywy jest idealnie dopasowany do pokrywy, jeśli jest odwrócony (patrz opisy części na rysunku 3C,D).</li>
	<li>Membranę komory zanurz w wodzie destylowanej przy użyciu dolnej części szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm. Pozwól membranie stać w wodzie przez noc w temperaturze pokojowej (20–25 °C/minimum 16 h). Ponieważ błona jest początkowo hydrofobowa, namoczenie jej w wodzie przed dodaniem krwi pomaga ograniczyć powstawanie uwięzionych bąbelków. UWAGA: Brak bąbelków potwierdza, że hydrofobiczność została usunięta.</li>
</ol>
3. Karmienie kleszczy i przygotowanie krwi
<ol>
	<li>Zrób 2–3 małe otwory oddechowe w pokrywach każdej komory (z szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm) (część IV na Rysunku 1A) wspomnianych w kroku 2.16 (Rysunek 3E). Użyj podgrzanego metalowego skalpela lub cienkiej metalowej łopatki, aby nakłuć otwory oddechowe w pokrywce. UWAGA: Otwory oddechowe pozwalają na internalizację wilgoci wewnątrz obudowy komory.</li>
	<li>Uzupełnij krew siarczanem gentamicyny w końcowym stężeniu 50 μg/mL. Antybiotyki należy podawać tylko do krwi przeznaczonej do użycia w ciągu 1 tygodnia i przechowywać w temperaturze 4 °C. Utrzymywać krew bydła (lub innej krwi zwierzęcej) w temperaturze 4 °C przed i po podaniu antybiotyków.</li>
	<li>Włóż 2–3 mL krwi do czystej szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm, a następnie umieść komorę na niej. Reguluj wysokość komory, aby zwiększyć lub zmniejszyć ilość krwi używanej na komorę, obracając pierścień regulacyjny (część iii z rysunku 1A). Reguluj wysokość komory, pozostawiając 1–2 mm przestrzeni od dna szalki Petriego do błony. Zobacz strzałki magentowe na rysunku 4A dla odniesienia. UWAGA: Konstrukcja pierścienia regulacyjnego komór pozwala kontrolować objętość użytej krwi. tzn. większa przestrzeń między dnem szalki Petriego a membraną będzie wymagała większej objętości, aby wypełnić tę przestrzeń.</li>
	<li>Umieść niekarmione kleszcze w komorach w równej liczbie samców i samic. Upewnij się, że obie płcie zawsze są obecne w komorze, ponieważ może to wpływać na tempo żerowania (Rysunek 4B pokazuje 4 samce i 4 samice dorosłego A. americanum wewnątrz komory). Dla łatwiejszego prowadzenia używa się maksymalnie 10–15 tyków na komorę (dla stadium dorosłego). UWAGA: W pracy z niedojrzałymi stadiami liczba kleszczy jest wyższa (20–50 nimf w komorze, nie jest prezentowane w tym protokole).</li>
	<li>Umieszczaj komory w zakrytych suchych kąpielach w temperaturze 37 °C ± 1 °C z źródłem wilgotności (np . kubkami z wodą), które utrzymuje względną wilgotność 63% ± 2% (rysunek 4C) podczas światłego fotoperiodu 12:12 h. UWAGA: Wymagania te mogą się różnić w zależności od gatunku kleszcza i warunków laboratoryjnych; Spróbuj innych ustawień wilgotności, jeśli trzeba, i oceń najlepsze warunki do laboratorium.</li>
</ol>
4. Wymiana krwi i komór
<ol>
	<li>Przygotuj dwie butelki z roztworami do płukania błony między zmianami krwi. Do jednej butelki dodaj 0,005% roztwór nystatyny w wodzie destylowanej; Do drugiej butelki dodaj wodę destylowaną.</li>
	<li>Po 12–16 godzinach przygotowuj nowe naczynia Petriego ze świeżą krwią i umieszczaj je w suchej kąpieli w 37 °C, a następnie umieść komorę.</li>
	<li>Podczas gdy świeża krew się ogrzewa, usuń komorę z użytej krwi i spłukni spód błony wodą destylowaną przez 3–5 sekund, a następnie roztworem 0,005% nystatyny przez 3–5 sekund, aby zapobiec zakażeniu grzybiczym. Przepłucz membranę ponownie wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości nystatyny. UWAGA: Proces ten trwa mniej niż 5 minut i nie wpływa na karmienie kleszczy przyczepionych do błony na górnej powierzchni.</li>
	<li>Cała zużyta krew i woda z płukania należy do pojemnika zawierającego 0,5% roztwór podchlorynu sodu (10% wybielacza). Krew odpada jest wyrzucana zgodnie z protokołem bezpieczeństwa instytucjonalnego.</li>
	<li>Po płukaniu umieść komorę w nowej misce Petriego z krwią. UWAGA: Używaj komor do 2–3 miesięcy przed myciem, pod warunkiem, że nie ma zanieczyszczeń ani przecieków. Komory i membrany brudzą się i są narażone na zanieczyszczenie po 3 miesiącach użytkowania bez mycia. Skutkuje to mniejszą częstotliwością karmienia kleszczy. Komory można używać ponownie przez maksymalnie 1,5 roku (~10 cykli prania).</li>
	<li>Ponownie używaj komor, umieszczając je w roztworze podchlorynu sodu o stężeniu 0,5% (10% wybielacza) na maksymalnie 30 minut, a następnie myjąc płynem do naczyń. Nie wystawiaj komor na wybielanie przez dłuższy czas (>30 min), ponieważ zapach zmniejsza szybkość przyczepności i może z czasem osłabić integralność żywicy. UWAGA: Długotrwałe narażenie na wybielanie sprawia, że komora jest elastyczna podczas mokrości i kruchna po wyschnięciu, co prowadzi do pęknięcia. Dzięki temu komora nie wytrzymuje dłużej niż 4–5 cykli płukania na podstawie powtarzanych obserwacji. Ciągłe używanie tej samej komory bez mycia (do 3 miesięcy) powoduje szybsze przyczepienie kleszcza (1–3 dni po umieszczeniu w komorze) w porównaniu do niedawno umytej komory (często >7 dni na przymocowanie). Prawdopodobnie wynika to z zapachu odchodów i innych feromonów agregujących się od kleszczy żerujących w komorze, które mogą stymulować żerowanie kleszczy35,36.</li>
</ol>

<ol><li>De La Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li>
<li>Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGubler%2C+DJ+%22In+vector+biology%2C+ecology+and+control%22">In vector biology, ecology and control</a>. Atkinson, P. W. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 39-62 (2010).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22In+biology+of+ticks%22">In biology of ticks</a>. 1, Oxford University Press. Cary. 3-17 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+global+brief+on+vector-borne+diseases%22">A global brief on vector-borne diseases</a>. , World Health Organization. 1-54 (2014).</li>
<li>Mullen, G. R., Durden, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMullen%2C+GR+%22In+medical+and+veterinary+entomology%22">In medical and veterinary entomology</a>. , Academic Press. Amsterdam. 517-558 (2002).</li>
<li>Choudhary, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+salivary+gland+extract+induces+alpha-gal+syndrome+in+alpha-gal+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Tick salivary gland extract induces alpha-gal syndrome in alpha-gal deficient mice.</a> Immun Inflamm Dis. 9 (3), 984-990 (2021).</li>
<li>Van Nunen, S. A., O'Connor, L. R., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+between+tick+bite+reactions+and+red+meat+allergy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Aust%22%5BJournal%5D)">An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans.</a> Med J Aust. 190 (9), 510-511 (2009).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+alpha-gal+in+Ixodes+ricinus+%E2%80%93+A+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of alpha-gal in Ixodes ricinus – A histological study.</a> Ticks Tick Borne Dis. 11 (5), 101506(2020).</li>
<li>Hamsten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose+in+the+gastrointestinal+tract+of+the+tick+Ixodes+ricinus%3B+possible+relationship+with+red+meat+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Identification of galactose-α-1,3-galactose in the gastrointestinal tract of the tick Ixodes ricinus; possible relationship with red meat allergy.</a> Allergy. 68 (4), 549-552 (2013).</li>
<li>Chinuki, Y., Ishiwata, K., Yamaji, K., Takahashi, H., Morita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemaphysalis+longicornis+tick+bites+are+a+possible+cause+of+red+meat+allergy+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Haemaphysalis longicornis tick bites are a possible cause of red meat allergy in Japan.</a> Allergy. 71 (3), 421-425 (2016).</li>
<li>Maldonado-Ruiz, L. P., Boorgula, G. D., Kim, D., Fleming, S. D., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+intrastadial+feeding+and+its+role+on+IgE+production+in+the+murine+model+of+alpha-gal+syndrome%3A+The+tick+%E2%80%9Ctransmission%E2%80%9D+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tick intrastadial feeding and its role on IgE production in the murine model of alpha-gal syndrome: The tick “transmission” hypothesis.</a> Front Immunol. 13, 1-11 (2022).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+anaphylaxis%2C+angioedema%2C+or+urticaria+after+consumption+of+red+meat+in+patients+with+IgE+antibodies+specific+for+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-α-1,3-galactose.</a> J Allergy Clin Immunol. 123 (2), 426-433 (2009).</li>
<li>Commins, S. P., Jerath, M. R., Cox, K., Erickson, L. D., Platts-Mills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+anaphylaxis+to+alpha-gal%2C+an+oligosaccharide+in+mammalian+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Allergol+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed anaphylaxis to alpha-gal, an oligosaccharide in mammalian meat.</a> Allergol Int. 65 (1), 16-20 (2016).</li>
<li>Crispell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+alpha-gal-containing+antigens+in+North+American+tick+species+believed+to+induce+red+meat+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovery of alpha-gal-containing antigens in North American tick species believed to induce red meat allergy.</a> Front Immunol. 10, 1056(2019).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-gal+and+cross-reactive+carbohydrate+determinants+in+the+N-glycans+of+salivary+glands+in+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccines. 8 (1), 95(2020).</li>
<li>Sharma, S. R., Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+saliva+and+the+alpha-gal+syndrome%3A+Finding+a+needle+in+a+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tick saliva and the alpha-gal syndrome: Finding a needle in a haystack.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 680264(2021).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22In+biology+of+ticks%22">In biology of ticks</a>. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Vol 1, New York. 51-66 (1991).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+management+of+mammalian+hosts+for+Ixodes+scapularis+host%E2%80%93pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Laboratory management of mammalian hosts for Ixodes scapularis host–pathogen interaction studies.</a> Comp Med. 74 (4), 235-245 (2024).</li>
<li>Allan, S. A. Tick rearing and in vitro. feeding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllan%2C+SA+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. , Oxford University Press. New York. 445-473 (2013).</li>
<li>Costa-Da-Silva, A. L., Carvalho, D. O., Kojin, B. B., Capurro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+artificial+feeders+in+hematophagous+arthropod+research+cooperates+with+the+vertebrate+animal+use+replacement%2C+reduction+and+refinement+%283Rs%29+principle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Res+Bioeth%22%5BJournal%5D)">Implementation of artificial feeders in hematophagous arthropod research cooperates with the vertebrate animal use replacement, reduction and refinement (3Rs) principle.</a> J Clin Res Bioeth. 5 (2), 1-3 (2014).</li>
<li>Maldonado-Ruiz, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+alpha-gal+with+large+variation+in+the+salivary+glands+of+lone+star+ticks+fed+on+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High levels of alpha-gal with large variation in the salivary glands of lone star ticks fed on human blood.</a> Sci Rep. 13 (1), 21409(2023).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro.+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro. feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Manag Sci. 63 (1), 17-22 (2007).</li>
<li>Stone, B. F., Commins, M. A., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+feeding+of+the+Australian+paralysis+tick%2C+Ixodes+holocyclus%2C+and+collection+of+paralysing+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Artificial feeding of the Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus, and collection of paralysing toxin.</a> Int J Parasitol. 13 (5), 447-454 (1983).</li>
<li>Bonnet, S., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+artificial+infection+of+hard+ticks%3A+a+tool+for+the+analysis+of+tick-borne+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Acarologia%22%5BJournal%5D)">Laboratory artificial infection of hard ticks: a tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission.</a> Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).</li>
<li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae.%29+by+membrane+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae.) by membrane feeding.</a> J Med Entomol. 53 (2), 409-415 (2015).</li>
<li>Vimonish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+infectious+Theileria+parva+sporozoites+secreted+by+infected+Rhipicephalus+appendiculatus+ticks+into+an+in+vitro.+tick+feeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Isolation of infectious Theileria parva sporozoites secreted by infected Rhipicephalus appendiculatus ticks into an in vitro. tick feeding system.</a> Parasit Vectors. 14 (1), 616(2021).</li>
<li>Vimonish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Anaplasma+marginale+acquisition+and+transmission+by+Dermacentor+andersoni+fed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Anaplasma marginale acquisition and transmission by Dermacentor andersoni fed in vitro.</a> Sci Rep. 10 (1), 470(2020).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tick+blood+meal%3A+From+a+living+animal+or+from+a+silicone+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">The tick blood meal: From a living animal or from a silicone membrane.</a> Altex. 24, 39-41 (2007).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).</li>
<li>Waladde, S. M., Ochieng, S. A., Gichuhi, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial-membrane+feeding+of+the+ixodid+tick%2C+Rhipicephalus+appendiculatus%2C+to+repletion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">Artificial-membrane feeding of the ixodid tick, Rhipicephalus appendiculatus, to repletion.</a> Exp Appl Acarol. 11 (4), 297-306 (1991).</li>
<li>Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+artificial+membrane+feeding+for+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis.</a> J Vis Exp. (189), e64553(2022).</li>
<li>Krull, C., Böhme, B., Clausen, P. H., Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+artificial+tick+feeding+assay+for+Dermacentor+reticulatus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Optimization of an artificial tick feeding assay for Dermacentor reticulatus.</a> Parasit Vectors. 10 (1), 60(2017).</li>
<li>Garcia Guizzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+tick+artificial+membrane+feeding+for+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimizing tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis.</a> Sci Rep. 13 (1), 16170(2023).</li>
<li>Rochlin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+artificial+membrane+feeding+system+for+lone+star+ticks%2C+Amblyomma+americanum+%28Acari%3A+Ixodidae%29%2C+and+experimental+infection+with+Rickettsia+amblyommatis+%28Rickettsiales%3A+Rickettsiaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Optimization of artificial membrane feeding system for lone star ticks, Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae), and experimental infection with Rickettsia amblyommatis (Rickettsiales: Rickettsiaceae).</a> J Med Entomol. 61 (2), 442-453 (2023).</li>
<li>Barré, N., Garris, G., Lorvelec, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field++sampling+of+the+tick+Amblyomma+variegatum+%28Acari%3A+Ixodidae.%29+on+pastures+in+Guadeloupe%3A+Attraction+of+CO+and%2For+tick+pheromones+and+conditions+of+use%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">Field sampling of the tick Amblyomma variegatum (Acari: Ixodidae.) on pastures in Guadeloupe: Attraction of CO and/or tick pheromones and conditions of use.</a> Exp Appl Acarol. 21 (2), 95-108 (1997).</li>
<li>Norval, R., Peter, T., Sonenshine, D., Burridge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+the+ticks+Amblyomma+hebraeum+and+A.+variegatum.+to+known+or+potential+components+of+the+aggregation-attachment+pheromone.+III+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">Responses of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum. to known or potential components of the aggregation-attachment pheromone. III Aggregation.</a> Exp Appl Acarol. 16 (3), 237-245 (1992).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-gal+and+cross-reactive+carbohydrate+determinants+in+the+N-glycans+of+salivary+glands+in+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccines. 8 (1), 1-18 (2020).</li>
<li>Trentelman, J. J., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., Schetters, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+feeding+of+Rhipicephalus+australis+%28formerly+Rhipicephalus+microplus.%29+larvae%3A+A+valuable+tool+for+tick+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro feeding of Rhipicephalus australis (formerly Rhipicephalus microplus.) larvae: A valuable tool for tick vaccine development.</a> Parasit Vectors. 10 (1), 153(2017).</li>
<li>Kemp, D. H., Stone, B. F., Binnington, K. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKemp%2C+DH+%22In+physiology+of+ticks%22">In physiology of ticks</a>. Obenchain, F. D., Galun, R. , Pergamon. 119-168 (1982).</li>
<li>Yamasaki, Y., Singh, P., Vimonish, R., Ueti, M., Bankhead, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+an+in+vitro.+tick+feeding+system+to+identify+Ixodes+tick+environment-induced+genes+of+the+Lyme+disease+agent%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development and application of an in vitro. tick feeding system to identify Ixodes tick environment-induced genes of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi.</a> Pathogens. 13 (6), 1-13 (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak istotnych interesów finansowych związanych z badaniami opisanymi w niniejszym artykule.

Sztuczne systemy karmienia kleszczy są bardzo skutecznymi narzędziami badań nad kleszczami i są szeroko stosowane w wielu laboratoriach badawczych jako realna alternatywa dla żywienia żywych zwierząt28,29. Główną zaletą tych systemów jest ich zdolność do dostarczania lub odzyskiwania różnych środków poprzez posiłek krwi, w tym patogenów, akarycydów, związków pochodzących od kleszczy oraz innych cząsteczek modulujących 22,23,25,27. Optymalizacja systemów żywienia sztucznych błon mogłaby ułatwić rozwój zrównoważonej hodowli kleszczy, zmniejszając tym samym zależność od żywych zwierząt.
System żywienia kleszczy in vitro opisany w tym protokole okazał się szczególnie skuteczny w przypadku dorosłych Amblyomma americanum i Ixodes scapularis. Wskaźniki powodzenia karmienia kleszczami definiuje się jako odsetek (lub procent) kleszczy, które skutecznie kończą karmienie do pełnego przepęknięcia. Jednak częściowo karmione kleszcze (zazwyczaj 3–4 dni po rozpoczęciu karmienia) często wystarczają, aby uwzględnić konkretne hipotezy eksperymentalne w większości laboratoriów badawczych kleszczy zajmujących się biologią lub fizjologią kleszczy. W tym protokole systemu karmienia sztuczną błoną oraz w celu realizacji konkretnych celów badawczych projektu alfa-Gal (αGal), terminy "tempo karmienia kleszczy" były używane do określenia pozyskiwania częściowo karmionych kleszczy (2–5 dni karmienia) oraz "sukces karmienia kleszczami" w odniesieniu do pełnego przepełnienia u A. americanum. Najwyższe wskaźniki żywienia odnotowano u samic A. americanum (87,6%), następnie u samców A. americanum (86,3%), samic A. maculatum (68,2%), samców A. maculatum (76,6%), samic I. scapularis (65,2%) oraz samic R. sanguineus (56,6%), podczas gdy skuteczność karmienia A. americanum wyniosła 42,8% (Tabela 1). Samice A. americanum częściowo karmione były klasyfikowane na podstawie dni żerowania w 4 kategoriach (fazy żerowania), zmodyfikowane według wcześniejszych publikacji następująco:21: (1) niekarmione, (2) 2–3 dni częściowo karmione, (3) 4–5 dni częściowo karmione oraz (4) przebrzuchnięte (Rysunek 5). Stadium przebrzęcznionego karmienia obejmowało kleszcze na początku fazy szybkiego przepęknięcia (z wagą od 48,9 mg do 109 mg) oraz w pełni przeładowane kleszcze (o masie od 272,7 mg do 348,7 mg) (Rysunek 5). Ten sztuczny system karmienia kleszczami umożliwił wiele badań w ramach tej samej grupy badawczej i współpracowników, umożliwiając generowanie częściowo karmionych kleszczy na krwi wołowej, które następnie zostały wykorzystane do infestacji myszy i testowania hipotezy przenoszenia zespołu alfa-gal (AGS), alergii na czerwone mięso wywołanej przez ukąszenie kleszcza, oraz do badania glikomii N11, 21,37. Wygoda indywidualnego ustawienia umożliwiała korzystanie z różnych źródeł krwi, a przezroczysta pokrywka i minimalna wysokość komory umożliwiały wizualizację kleszczy podczas okresu karmienia pod stereomikroskopem przy odpowiedniej odległości roboczej.
Najnowsze zmiany wilgotności (z kąpieli wodnej 90% R na suchą kąpiel 63% ± 2% wilgotności), temperatury (z 37 °C do 35 °C i z powrotem do 37 °C) oraz grubości błony (Tabela 1) umożliwiły skuteczne żerowanie wielu gatunków kleszczy. Chociaż temperatura i wilgotność względna (RH) są ważnymi czynnikami do kontrolowania podczas żywienia kleszczy in vitro, grubość i wytrzymałość błony są kluczowymi czynnikami zapewniającymi skuteczne żerowanie różnych gatunków kleszczy33,38. Należy pamiętać, że kleszcze z krótkimi aparatami gębowymi, takie jak Rhipicephalus sanguineus i Dermacentor variabilis, będą potrzebować cieńszych błon niż kleszcze z długimi naczynamigębowymi 39, takie jak Amblyomma spp i Ixodes spp. Najwyższe wskaźniki żerowania kleszczy odnotowano u Amblyomma americanum i A. maculatum o grubości błony 100–200 μm; Rhipicephalus sanguineus o grubości od 70 do 100 μm; Ixodes scapularis o grubości <150 μm" oraz Dermacentor variabilis <150 μm (Tabela 1). Kluczowym czynnikiem przy sztucznym karmieniu kleszczami błonowymi jest to, że nadal występują wahania tempa karmienia. W tym systemie niewielka zmiana temperatury, czyli z 37 °C do 35 °C i z powrotem do 37 °C po kilku dniach, często zwiększa lub przywraca tempo karmienia kleszczy. Ponadto przejście z kąpieli suchej na kąpiel wodną daje podobne wyniki dla Amblyomma spp. i Ixodes scapularis, jednak efekt ten nie zaobserwowano u Rhipicephalus sanguineus, który w suchych kąpielach lepiej odżywia się przy 63% ± 2% względności względnej.
Inne sztuczne systemy karmienia kleszczy, takie jak te zaadaptowane z pięcioczęściowego systemu ciągłego przepływu opracowanego przez Ueti, M. i in. (USDA-ARS), a później zmodyfikowanego dla dodatkowych gatunków kleszczy przez Yamasaki, Y. i in., wykazały wysoką wydajność, zapewniając konsekwentnie wysokie wskaźniki skuteczności karmienia kleszczy27,40. Jednak badania wymagające częstego dostępu do systemu do sekcji częściowo karmionych kleszczy sprawiają, że takie rozwiązania są mniej odpowiednie, ponieważ wielokrotne otwieranie i zamykanie komory kleszczy może być uciążliwe. Opisana w tym protokole komora drukowana w 3D posiada magnetyczną pokrywkę typu sure-lock oraz indywidualne szalki Petriego, co pozwala na łatwą obsługę i wizualną inspekcję karmienia kleszczy bez zakłócania układu. Przezroczysta pokrywa umożliwia wizualny monitoring bez zakłóceń i jest bezpiecznie mocowana do komory za pomocą wbudowanych magnesów, w przeciwieństwie do najczęściej spotykanych systemów karmienia kleszczy, takich jak te zoptymalizowane przez oryginalny projekt Kröbera i Guerina22,29, gdzie indywidualna wizualizacja nie jest możliwa bez usunięcia komory karmienia z krwi, ponieważ wszystkie jednostki karmiące są zintegrowane w jednej płycie, a metody zapobiegania kleszczom są stosowane Nie pozwalają na wizualizację. Co więcej, ten system żywienia in vitro kleszczami można dodatkowo udoskonalić, aby dostarczać mniejsze, specyficzne dla miejsca objętości krwi. Na przykład, gdy samice kleszczy zostaną przyczepione w określonych miejscach żerowania, dolna szalka Petriego może zostać zastąpiona miniaturowymi zbiornikami, takimi jak górna część probówki PCR o pojemności 100 μL, zawierająca mniej niż 100 μL krwi umieszczonej bezpośrednio pod miejscem przyłączenia (Rysunek uzupełniający 1). To podejście do karmienia o niskiej objętości umożliwiłoby szczegółowe badania nad pozyskiwaniem i przenoszeniem patogenów, a także badania nad skutkami toksyn kleszczy i przeciwciał pochodzących od gospodarza. Udowodniono, że protokół ten skutecznie pozwala na częściowo karmione kleszcze od różnych dorosłych gatunków kleszczy. Na potrzeby tego badania nie oceniano w tym protokole liczby znoszonych jaj i pełnego przepęknięcia; jednak prowadzone są dalsze optymalizacje w celu uzyskania potomstwa kleszczy, co można osiągnąć na podstawie wstępnych obserwacji Amblyomma americanum i Ixodes scapularis. Być może najbardziej innowacyjną cechą tego systemu jest elastyczność w małoskalowych eksperymentalnych manipulacjach, umożliwiająca kontrolowaną zmienność zabiegów i warunków środowiskowych, a także wspierającą zastosowania w hodowli kolonii.
Karmienie kleszczami in vitro jest cennym narzędziem dla badaczy biologii, fizjologii i kompetencji wektorów kleszczy. Jednak karmienie kleszczami sztucznymi błonami to czasochłonne i wymagające wysiłku zadanie. Protokół ten, wyposażony w komorę drukowaną w 3D z systemem pewnego zamka oraz prostą laboratoryjnie wykonaną membranę, zapewnia prosty układ po wydrukowaniu komór i przygotowaniu membran, co pozwala na długotrwałe użytkowanie. Dodatkowo, poprzez regulację grubości błony, system może być skutecznie dostosowany do różnych gatunków kleszczy. Dalsza optymalizacja, w tym rozmiar komory i grubość błony, umożliwia zastosowanie w różnych fazach życia kleszcza.

Kleszcze to obowiązkowe ektopasożyty odżywiające się krwią, które mogą przenosić i przenosić szeroki zakres patogenów, w tym bakterie, wirusy i pasożyty powodujące choroby u zwierząt i ludzi na całym świecie 1,2,3,4. Jako najczęstszy wektor chorób w Stanach Zjednoczonych, ustępujący jedynie komarom w pozostałych częściach świata 2,3,5, kilka gatunków kleszczy może przenosić choroby związane z patogenami, podczas gdy inne gatunki są również znane z wywoływania chorób niezakaźnych, takich jak zespół alfa-gal (AGS, znany również jako alergia na czerwone mięso), który w ostatnich latach jest coraz częściej zgłaszany na całym świecie6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Badania mające na celu zrozumienie biologii, fizjologii, genetyki oraz kompetencji wektorów są niezbędne do opracowania strategii zmniejszających ekonomiczne i publiczne obciążenie zdrowotne zarówno chorobami przenoszonymi przez kleszcze, jak i niezakaźnymi. Badanie interakcji kleszcza z gospodarzem często wymaga częściowo karmionych lub w pełni nabrzuszonych kleszczy, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze. Można to osiągnąć poprzez karmienie żywymi zwierzętami, co pozwala kleszczom ukończyć pełny cykl życiowy17. Chociaż stosowanie żywych zwierząt do karmienia kleszczy jest bardzo skuteczne w rozwijaniu i utrzymywaniu kolonii kleszczy18,19, może być trudne do wdrożenia i może nie być stosowane do każdej hipotezy badawczej ze względu na ograniczenia dostępności gospodarzy i przepisy obiektu. Co najważniejsze, skuteczne wdrożenie systemów żywienia kleszczy in vitro pomaga ograniczyć wykorzystanie żywych zwierząt, co jest istotnym celem badań w ramach "Animal Use Alternative (3R)" (zastąpienie, ograniczenie, udoskonalenie)20.
Istnieje wiele zalet stosowania systemów karmienia kleszczy sztucznymi błonami w badaniach, dając szerokie możliwości rozwiązywania szerokiego zakresu pytań naukowych. Można je ogólnie streścić w trzech grupach; (1) ocena wpływu na zmienność krwi gospodarza i interakcje wektor-gospodarz, z wykorzystaniem różnych źródeł krwi, takich jak produkcja alfa-gal kleszcza podczas karmienia21, (2) ocena toksyczności akacydów poprzez podanie związków z krwią22 oraz odzyskanie związków wydzielanych przez kleszcze podczas karmieniakrwią 23, (3) ocena kompetencji wektorów poprzez dostarczanie patogenów naturalnie podczas karmienia krwią24, 25, 26, 27, między innymi. Ponadto charakter systemu karmienia sztuczną membraną pozwala na testowanie na dużą skalę różnych zabiegów i stężeń bez wprowadzania zmienności związanych z gospodarzem, na małą skalę i w dużej liczbie, co zmniejsza potrzebę stosowania żywych zwierząt.
Systemy żywienia kleszczy za pomocą sztucznych membran były szeroko stosowane w badaniach oraz do wspierania wychowu kleszczy 19,28,29, w niektórych przypadkach umożliwiając zakończenie długiego cyklu życia kleszcza 30,31. Dla różnych gatunków kleszczy32, 33, 34 odnotowano wiele protokołów dotyczących optymalizacji systemów żywienia kleszczy i ich materiałów. Niemniej jednak powszechnie wiadomo, że żywienie kleszczy in vitro może być bardzo zróżnicowane w zależności od warunków systemowych, użytych materiałów oraz, co najważniejsze, gatunku kleszcza i stadiów34. Ponadto wiele systemów opiera się na dużych objętościach krwi, takich jak systemy ciągłego przepływu27, które są bardzo skuteczne, ale mogą być kosztowne ze względu na duże objętości krwi. Protokół ten opisuje system karmienia kleszczy sztuczną błoną, który wykazuje się skutecznością w dorosłych stadiach pięciu różnych gatunków wektorów chorób kleszczy w Stanach Zjednoczonych. Należą do nich Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus oraz Dermacentor variabilis.

<table><tbody><tr><td>1mL strzykawka Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Cypel Luer-Lok</td></tr><tr><td>Zaawansowany przezroczysty silikon &nbsp;</td><td>General Electric</td><td>2810435</td><td>Przezroczysty silikonowy silikon. Ten uszczelniacz tworzy barierę nieprzepuszczalną dla wody po utwardzeniu.</td></tr><tr><td>Przezroczysty klej epoksydowy</td><td>JB Weld-Clear</td><td>&lrm; B009EU5ZM0</td><td>Numer produktu Amazon</td></tr><tr><td>Przezroczysta folia spożywcza (spożywcze)</td><td>Cieszę się.</td><td>CLO00020</td><td></td></tr><tr><td>Defibrynowana krew bydła</td><td>Laboratoria Hemostatów</td><td>DBB100</td><td></td></tr><tr><td>Defibrynowana ludzka krew</td><td>BioIVT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szpatułki</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td>Numer produktu Amazon</td></tr><tr><td>Inkubatory do kąpieli suchej</td><td>ONiLAB Scientific</td><td>HB120-S</td><td>Numer produktu Amazon. Blok grzewczy jest odwrócony, aby uzyskać płaską powierzchnię.</td></tr><tr><td>Sól siarczanowa gentamycyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>G3632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Papier do czyszczenia soczewek</td><td>Tiffen</td><td>EK1546027T</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki mikropipety, 200 &m; L&nbsp;</td><td>Biotix uTIP</td><td>63300057</td><td>Na strzykawkę. Aplikator silikonowego silikonu</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Inspiruj</td><td>COBALT-OG</td><td>Numer produktu Amazon</td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>BioReagenty Fishera</td><td>BP2949-5</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Phrozen Sonic MEGA 8K V2 Drukarka Żywicowa</td><td>Phrozen</td><td>B0F9NBXVVT</td><td>Objętość wykonania 320 x 175 x 300 mm. Można go kupić na Amazonie, jeśli preferowane jest drukowanie we własnym miejscu</td></tr><tr><td>Pro 8K photopolymer&nbsp; Żywica Aqua Gray</td><td>Phrozen</td><td>Przez Uniwersytet Arizony</td><td>Niskie kurczenie się. Wysoka jakość i niezwykle skomplikowane modele 3D o rozdzielczości 8K.</td></tr><tr><td>Magnesy okrągłe 3 mm x 2 mm</td><td>Mealos</td><td>B08NZTN426</td><td>Numer produktu Amazon</td></tr><tr><td>RPG fotopolimer Żywica dymowa biała</td><td>Phrozen</td><td>Przez Uniwersytet Arizony</td><td>Wysoka jakość i niezwykle skomplikowane modele 3DŚwietna elastyczność z imponującym zgięciem.</td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>378321-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Projektowanie darmowego oprogramowania 3D w Tinkercad</td><td>Tinkercad</td><td>Nie ma</td><td>https://www.tinkercad.com</td></tr><tr><td>Wagi łodzi (pojemność 100 mL)</td><td>Pura Ponta</td><td>MDO-Azoc-1030</td><td></td></tr></tbody></table>

krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3d w badaniach nad kleszczami ixoidida

Tick Blood Feeding through an Artificial Membrane on a 3D-Printed Chamber in Ixodid Tick Research

Praca ta przedstawia szczegółowy protokół dla systemu karmienia kleszczy za pomocą sztucznej membrany silikonowej wykorzystującej komorę wydrukowaną w 3D wykonaną z wysokorozdzielczej żywicy fotopolimerowej. Metoda obejmuje projektowanie komory karmiącej, przygotowanie membrany silikonowej, montaż systemu oraz optymalizację warunków karmienia kleszczy. Kleszcze są jednym z głównych wektorów chorób w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie. Badania nad kleszczami są niezbędne do opracowania skutecznych strategii zapobiegania i ograniczania częstości chorób przenoszonych przez kleszcze. Jako obowiązkowe hematofagowe ektopasożyty, kleszcze muszą żywić się krwią, aby przetrwać i tym samym przenosić choroby, co czyni karmienie krwią podstawowym procesem podczas badania interakcji wektor-żywiciel, transmisji patogenów oraz biologii, fizjologii i morfologii anatomicznej kleszczy. Systemy żywienia kleszczy z membraną silikonową były szeroko stosowane i udoskonalane przez ostatnie kilka dekad. Jednak wiele istniejących systemów jest dostosowanych do pojedynczego gatunku kleszcza, stadium życia lub konkretnego zestawu warunków. System żywienia kleszczy opisany w tym protokole został z powodzeniem wykorzystany do pozyskiwania zarówno częściowo karmionych, jak i w pełni nabrzuszonych okazów od kilku najważniejszych gatunków wektorów kleszczy w Stanach Zjednoczonych, w tym Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, oraz Rhipicephalus sanguineus . System wykazał sukces w inicjowaniu karmienia dorosłych Dermacentor variabilis oraz nimfy A. americanum, z najwyższymi wskaźnikami żerowania (>85%) u dorosłych A. americanum. W związku z tym komora żywieniowa opracowana w tym badaniu jest adaptowalna do pracy z niską objętością różnych krwi, do 100 μL, co jest kluczowe w transmisji patogenów i badaniach toksykologicznych. Przezroczysta pokrywa o minimalnej wysokości komory ułatwiała obserwację kleszczy przez cały czas karmienia się kleszczami.

Grubość błony dla każdego gatunku kleszcza. Najwyższe wskaźniki żerowania kleszczy zaobserwowano przy następujących specyfikacjach grubości błony dla każdego dorosłego gatunku kleszcza: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Wszystkie gatunki kleszczy były utrzymywane w tych samych warunkach wilgotności i temperatury podczas żerowania (63% wilgotności i 37 °C) (Tabela 1).
Kleszcze i źródła krwi stosowane w tym protokole Wszystkie kleszcze zostały pobrane z ośrodka hodowli kleszczy Oklahoma State University i utrzymywane w wilgotności względnej >90% przy 20 °C, w okresie światła i ciemności 12:12 godz. Wszystkie kleszcze były karmione defibrynowaną krwią bydła lub człowieka w ramach projektu badawczego badającego poziomy alfa-gal (αGal) u różnych gatunków kleszczy. Badanie to porównywało wpływ karmienia na różne źródła krwi w ramach szerszego projektu zespołu alfa-gal (AGS) prowadzonego przez grupę badawczą. Większość opisanych tu okazów kleszczy została rozłożona przed pełnym przepełnieniem w celu przeprowadzenia analiz ilościowych αGal u kleszczy częściowo karmionych (2–5 dni karmienia). Tylko podgrupa kleszczy Amblyomma americanum (niepotrzebnych do ilościowania αGal) mogła żerować do końca. Chociaż szczegółowe porównania wskaźników karmienia kleszczy karmionych bydłem a ludźmi nie są tutaj przedstawione, warto zauważyć, że pełne przepełnienie (czyli skuteczność karmienia) osiągnięto częściej u kleszczy karmionych krwią bydła. Spośród kleszczy, którym pozwolono pozostać w karmnikach przez dłuższy czas (n = 35), 15 osiągnęło pełne przepychnięcie, co stanowi 42,8% skuteczności karmienia. Spośród nich 9 było karmionych krwią bydła, a 6 krwią ludzką (60% karmionych bydłem, w porównaniu do 40% karmionych ludźmi).
Wskaźniki karmienia kleszczami vs. skuteczność karmienia kleszczami Wskaźniki karmienia kleszczy w tym badaniu określano na podstawie pozyskania częściowo karmionych kleszczy (2–5 dni karmienia), natomiast sukces karmienia definiowano jako pełne przepychnięcie, zwykle oznaczane zmianą ubarwienia alloscutum samicy (dane dostępne tylko dla Amblyomma americanum). Wskaźniki karmienia samców definiowano jako ciągłe karmienie przez ponad 2 dni (2–5 dni). Ogólne wskaźniki karmienia obliczono na podstawie połączenia danych z kleszczy karmionych krwią bydła i ludzi oraz obliczania procentów kleszczy, które osiągnęły karmienie przez 2–5 dni lub pełne przepełnienie się po umieszczeniu kleszczy w komorach. Kleszcze, które nie przyłączyły się lub zmarły po <2 dniach przyłączenia, były brane pod uwagę przy obliczaniu wskaźników karmienia. Chociaż dane ilościowe dotyczące wpływu źródła krwi na tempo karmienia kleszczy nie są przedstawione, te dowody obserwacyjne sugerują, że u większości gatunków kleszczy tempo przywiązania i karmienia nie różni się znacząco między krwią bydła a człowieka w okresie karmienia trwającym 2–5 dni. Wyjątek zaobserwowano w przypadku Rhipicephalus sanguineus, który wykazywał niższe wskaźniki żywienia na ludzkiej krwi między 3 a 5 dniami w porównaniu do krwi bydła. Wskaźniki karmienia dla wszystkich gatunków kleszczy, które osiągnęły częściowe karmienie i pełne przepełnienie dzięki temu systemu in vitro żywienia kleszczy, są podsumowane w Tabeli 1.
Klasyfikacja wagi i etapu karmienia samicy Amblyomma americanum Samice A. americanum częściowo karmione były klasyfikowane według dni żerowania jako: (1) niekarmione, (2) 2–3 dni częściowo karmione, (3) 4–5 dni częściowo karmione oraz (4) przepełnione (Rysunek 5). Stadium przebrzęcznionego karmienia obejmowało kleszcze na początku fazy szybkiego przepełniania (o masach od 48,9 mg do 109 mg) oraz w pełni przeładowane kleszcze (o masach od 272,7 mg do 348,7 mg).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69606/69606fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Komora do podawania kleszczy – model 3D i wydrukowany zespół z membraną. Wybuchowy model 3D i ostatecznie złożona komora prezentujące poszczególne elementy: (i) korpus komory (obudowa kleszcza), (ii) pierścień uchwytu pokrywy, (iii) pierścień regulacji wysokości, (iv) pokrywka szalki Petriego 40 mm x 10 mm oraz (v) dno szalki Petriego o wymiarach 40 mm x 10 mm z krwią (A). Montaż modelu wydrukowanego w 3D oraz poszczególnych rozmiarów części pokazanych w mm (B). Komora złożona drukowana w szarej żywicy o rozdzielczości 8K (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/69606fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69606/69606fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Przygotowanie silikonowej membrany i zespołu komory. (i) folia plastikowa o wymiarach 30 cm × 30 cm zabezpieczona taśmą, zapewniająca brak widocznych zagnieceń, (ii) pojedyncze arkusze papieru do czyszczenia soczewek nakładane na folię, odstępowane od siebie w odstępach około 5 cm, (iii) delikatne mieszanie elementów silikonowych szpatułką za pomocą ruchów kołowych, (iv) każda kartka papieru soczewki zabezpieczona przez nałożenie 1–2 g mieszanki silikonowej wzdłuż krawędzi, (v) mieszanka silikonu równomiernie rozprowadza się na papierze soczewkowym za pomocą prostego narzędzia większego niż papier (na zdjęciu pokazuje krawędź szklanej pokrywki), (vi) zauważa zmniejszoną ilość mieszanki silikonowej podczas rozprowadzania, zatrzymany silikon na narzędziu jest zwracany i rozdzielany, aby zapewnić równomierne pokrycie (A). Prawidłowo rozłożone błony nie wykazywały pęcherzyków powietrza ani szczelin (B). Przygotowanie strzykawki do aplikacji kleju: (i) strzykawka 1 mL wypełniona klejem silikonowym, (ii) końcówka pipety 200 μL włożona w końcówkę, (iii) końcówka pipety przykręcona w celu zapewnienia szczelności szczelności, oraz (iv) umieszczenie kleju na dolnej krawędzi części i (C). Komora umieszczona na wysuszonej błonie (D), a na wierzchu umieszczony przedmiot obciążony (gruby blok akrylowy ważący 2,5 kg; magenta strzała), aby zapewnić solidną przyczepność (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/69606fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69606/69606fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Ostatnie etapy przygotowania komory i membrany przed użyciem. Przycinanie krawędzi membrany otaczającej komorę za pomocą zakrzywionych małych nożyczek (A), zdjęcie folii plastikowej przed użyciem komory (B), ostateczny montaż modelu (C), umieszczenie komory w szalce Petriego o wymiarach 40 mm x 10 cm zawierającej wodę oraz użycie pokrywy szalki Petriego jako pokrywy komory (D) (liczby i-v oznaczają części zgodnie z rysunkiem 1A), oraz pokrywy komór z otworami oddechowymi (oznaczonymi magentowymi grotami strzał) (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/69606fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69606/69606fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Ustawienie do karmienia krwią i umieszczenie kleszczy. Komora umieszczona w misce wypełnionej krwią, z podświetlonym pierścieniem regulacji wysokości (magentowe strzałki) (A). Widok wnętrza komory zawierającej równą liczbę samców i samic kleszczy (B). Komory kleszczy umieszczone w suchych kąpielach z wilgotnością, utrzymujące 63% ± 2% wilgotności względnej (RH) oraz temperaturę 37 °C ± 1 °C (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/69606fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69606/69606fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Wielkość i wahanie wagi Amblyomma americanum podczas karmienia. Pokazano wielkość kleszczy niekarmionych oraz średnią wagę częściowo karmionych kleszczy. Obrazy przedstawiają typowe przykłady odpowiadające średniej masie rejestrowanej w każdym okresie karmienia. Załączona tabela przedstawia średnie wagi, odchylenia standardowe, liczbę analizowanych kleszczy, medianę oraz kwartyle 1 i 3 dla każdego punktu karmienia. Kleszcze karmione przez 2–3 dni wykazywały zakres masy od 7,4 mg (minimum) do 19,2 mg (maksymalnie). Kleszcze karmione przez 4–5 dni miały dawkę od 20,6 mg do 44,8 mg. Kleszcze na początku fazy szybkiego przepełnienia oraz w pełni nabrzmiałe kleszcze ważyły od 48,9 mg do 348,7 mg. Zdjęcie przyłączonych samic A. americanum karmionych 4-5 dni (żółty grot strzały) oraz w pełni nabrzmiałych samic (magenta grot strzały). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/69606fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gatunki kleszczy i płeć</td>
			<td>Liczba nakarmionych kleszczy/ Łączna liczba kleszczy umieszczonych w komorach (Liczba martwych kleszczy)</td>
			<td>Tempo karmienia (kleszcze przyczepione 2-5 dni)</td>
			<td>Średnia waga (mg) (SD)</td>
			<td>Grubość użytej błony (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samice A. americanum</td>
			<td>85/97 (12)</td>
			<td>87.60%</td>
			<td>37.3 (54.40)*</td>
			<td>100 - 200 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samce A. americanum</td>
			<td>19/22 (2)</td>
			<td>86.30%</td>
			<td>Nienagrane</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samice A. maculatum</td>
			<td>45/66 (21)</td>
			<td>68.20%</td>
			<td>122.4 (141.65)</td>
			<td>100 - 250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samce A. maculatum</td>
			<td>36/47 (11)</td>
			<td>76.60%</td>
			<td>Nienagrane</td>
			<td>Nienagrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samice R. sanguineus</td>
			<td>34/60 (26)</td>
			<td>56.60%</td>
			<td>Nienagrane</td>
			<td>70 - 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samice I. scapularis</td>
			<td>15/23 (8)</td>
			<td>65.20%</td>
			<td>Nienagrane</td>
			<td><150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">*Wskaźnik skuteczności karmienia w podzbiorze dorosłych kleszczy Aa karmionych bydłem wynosi (n=35) i wyniósł 42,8%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wskaźniki karmienia kleszczami i średnia waga.
Ilustracja uzupełniająca 1: Niskoobjętościowe (100 μL) karmienie poszczególnych kleszczy już przyczepionych do miejsca w komorze 3D. Mała rurka PCR przymocowana do spodu sztucznej błony za pomocą kleju silikonowego jest wypełniona 100 μL krwi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69606/FIgureS1.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

This work presents a detailed protocol for a tick feeding system through an artificial silicone membrane utilizing a 3D-printed chamber created from ...

Moje badania koncentrują się na zmniejszaniu częstości występowania chorób przenoszonych przez kleszcze poprzez zrozumienie mikroorganizmów molekularnych wpływających na kompetencje wektorów, a także na opracowywaniu nowych strategii kontroli kleszczy. Istniejące systemy sztucznego karmienia kleszczy zazwyczaj wymagają dużych ilości i skomplikowanych układów. Protokół ten wprowadza modułowy, wielokrotnego użytku system umożliwiający eksperymenty na małą skalę, konfigurowalne.Na początek, używając rękawiczek, umyj części komór do podawania, aby upewnić się, że nie ma resztek żywicy przed montażem. Jeśli trzeba, delikatnie szlifuj części drobnym papierem ściernym o ziarnistości 180–200 i upewnij się, że dolna część jest płaska i gładka. Wszystkie suche elementy wystaw na światło ultrafioletowe przez 10 minut, aby zapewnić pełną polimeryzację żywicy.Następnie sklej okrągłe magnesy o wymiarach trzy na dwa milimetry w szczeliny na górze komór i pierścieni pokrywek przezroczystym klejem epoksydowym i pozwól wyschnąć przez noc. Upewnij się, że bieguny magnesów są skierowane w jednym kierunku, aby dopasować się do przyciągania biegunów na magnesach w górnej części pierścienia pokrywy. Złóż wszystkie elementy modelu, aby upewnić się, że wszystkie elementy pasują prawidłowo.Umieść kawałek folii foliowej o wymiarach 30 na 30 centymetrów na czystą powierzchnię. Naciągnij folię na płaskiej powierzchni, aby usunąć zagniecenia i zabezpiecz krawędzie taśmą. Na rozciągniętej folii plastikowej połóż cztery do pięciu indywidualnych arkuszy papieru do czyszczenia soczewek, rozmieszczając je w odstępach około pięciu centymetrów.Aby przygotować membranę silikonową, dodaj 15 gramów silikonowego przezroczystego uszczelnienia, 4,5 grama oleju silikonowego i 2,9 grama heksanu do plastikowej wagi. Używając szpatuły, delikatnie mieszaj składniki, aż się połączą. Następnie umieść dwa do trzech gramów mieszanki silikonowej wzdłuż mniejszej krawędzi papieru do smycia soczewek, aby przymocować ją do folii plastikowej.Pozwól silikonowi przesiąkać przez papier soczewki przez pięć do dziesięciu sekund. Następnie, używając prostego narzędzia, takiego jak pokrywka, linijka czy szpatułka, równomiernie rozprowadz silikonową mieszankę na papierze do czyszczenia soczewki. Upewnij się, że narzędzie pokrywa cały obszar papieru do czyszczenia soczewki jednym ruchem, aby zapobiec falowaniu membran i falowaniu krawędzi.Wróć narzędzie do rozprowadzania do pozycji wyjściowej, aby zebrać resztki mieszanki silikonowej na narzędziu. Rozłóż zebrany silikon po membranie, aby upewnić się, że mieszanka zostanie użyta i uniknąć szczelin. Pozwól membranom wyschnąć na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia zmierz grubość błony za pomocą cyfrowego zewnętrznego mikrometru pomiarowego. Wybieraj odpowiednie grubości błony dla różnych dorosłych gatunków kleszczy, od krótkich części pyskowych po dłuższe. Następnie usuń wszystkie części z wcześniej złożonych komór.Aby nałożyć klej silikonowy na dolną krawędź komór, napełnij strzykawkę o jednym mililitrze klejem silikonowym. Przyłóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na końcówkę strzykawki. Przykręć końcówkę pipety mocno do końca strzykawki.Podobnie jak w przypadku końcówki igły, użyj tego zestawu, aby umożliwić precyzyjne nakładanie kleju na dolną krawędź każdej komory. Umieść komorę nad membraną i umieść na niej obciążony przedmiot, aby zapewnić prawidłowe osadzenie. Pozwól zespołowi odczekać przez noc w temperaturze pokojowej.Używając zakrzywionych nożyczek, usuń nadmiar błony wokół komór. Przed użyciem komory do karmienia kleszczy usuń resztki folii z membrany. Złóż części komory i dołącz na dole szalkę Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów.Odwróć pokrywki do szalek Petriego i umieść je między magnesami, aby służyły jako pokrywki komor. Napełnij dolną część szalki Petriego wodą destylowaną i pozwól membranie komory namoczyć się w niej przez noc. Użyj podgrzanego metalowego skalpela lub cienkiej metalowej łopatki, aby zrobić dwa do trzech małych otworów oddechowych w pokrywkach każdej komory.Uzupełnij krew siarczanem genamycyny do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Przechowywać uzupełnioną krew w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zużyć ją w ciągu tygodnia. Włóż dwa do trzech mililitrów krwi do czystej szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów.Umieść komorę na szczycie szalki Petriego i reguluj jej wysokość, obracając pierścień regulacyjny, aby zwiększyć lub zmniejszyć objętość krwi używanej w komorze. Reguluj komorę tak, aby zachować szczelinę od jednego do dwóch milimetrów między membraną a dnem szalki Petriego. Umieść niekarmione kleszcze w komorach z równą liczbą samców i samic.Upewnij się, że obie płcie są uwzględnione, aby wspierać karmienie. Następnie umieszczaj komory w zadaszonych suchych kąpielach z wilgotnością, takim jak kubki z wodą, pod 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym ciemnym okresem fotoperiodu. Przygotuj dwie butelki do płukania, jedną z roztworem 0,005% nystatyny w wodzie destylowanej, a drugą wyłącznie z wodą destylowaną.Po 12 do 16 godzinach przygotuj nowe szalki Petriego ze świeżą krwią. Umieść naczynia w suchej kąpieli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed ustawieniem komory. W międzyczasie usuń komorę z użytej krwi.Krótko spłukaj spód błony wodą destylowaną przez trzy do pięciu sekund, następnie spłukaj przez trzy do pięć sekund nistatyną 0,005%, aby zapobiec zakażeniu grzybiczym, a na koniec przepłukaj wodą destylowaną, aby usunąć resztki nystatyny. Po przepłukaniu umieść komorę w nowej misce Petriego zawierającej świeżą krew. Zgodnie z protokołem bezpieczeństwa instytucjonalnego wyrzuć wszelką zużytą krew i przepłukać wodę do pojemnika zawierającego roztwór podchlorynu sodu o stężeniu 0,5%.Umieść komory w roztworze podchlorynu 0,5% sodu na maksymalnie 30 minut, aby ponownie je wykorzystać. Po wybielaniu myj komory płynem do naczyń. Optymalne tempo żerowania osiągnięto przy grubości błony od 100 do 200 mikrometrów dla Amblyomma americanum oraz 100 do 250 mikrometrów dla Amblyomma maculatum.Rhipicephalus sanguineus wykazywał najwyższe wskaźniki żerowania o grubości błony 70 do 100 mikrometrów. Najwyższe wskaźniki żerowania dla Ixodes scapularis i Dermacentor variabilis zaobserwowano przy grubości błony poniżej 150 mikrometrów. Samice Amblyomma americanum częściowo karmione były klasyfikowane na fazy niekarmione, od dwóch do trzech dni częściowo karmione, cztero- do pięciu dni częściowo karmione oraz fazy przebrzuchnięte.Etap przeszczepionego karmienia obejmował kleszcze na początku szybkiego przepełnienia o masie od 48,9 miligrama do 109 miligramów oraz w pełni przepełnione kleszcze o wadze od 272,7 miligrama do 348,7 miligrama. Protokół ten umożliwia badaczom badanie zachowań żywieniowych, fizjologii oraz odpowiedzi molekularnych kleszczy w kontrolowanych warunkach in vitro. Kluczowym wyzwaniem jest zmienny skuteczność karmienia, wymagająca precyzyjnej optymalizacji warunków środowiskowych, właściwości membran oraz ostrożnego obchodzenia się z nimi, aby zachować integralność i zapobiec zanieczyszczeniu.Przyszłe badania zoptymalizują żerowanie między gatunkami, umożliwią utrzymanie pełnego cyklu życia oraz integrują narzędzia molekularne do badania transmisji patogenów i opracowywania ukierunkowanych strategii kontroli.

tick-blood-feeding-through-an-artificial-membrane-on-3d-printed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

Opracowaliśmy prosty i wszechstronny system do karmienia królików laboratoryjnych twardymi kleszczami. Nasz niepracochłonny protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i może być dostosowywany w zależności od wymagań różnych ustawień eksperymentalnych. Metoda ta pozwala na komfortowe monitorowanie i/lub pobieranie próbek kleszczy przez cały okres karmienia.

Wszechstronny model inwazji kleszczy twardych na królikach laboratoryjnych

W tym badaniu, system żywienia dla nimfalnych i larwalnych stadiów kleszcza twardego został opracowany za pomocą kapsułki dołączonej do myszy laboratoryjnej. Kapsuła do karmienia jest wykonana z elastycznych materiałów i pozostaje mocno przymocowana do myszy przez co najmniej tydzień i umożliwia wygodne monitorowanie żerowania kleszczy.

Oparty na kapsułkach model do infestacji niedojrzałych stadiów kleszczy twardych na myszach laboratoryjnych

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

W niniejszym filmie zaprezentowano test sprawdzający tolerancję na nikotynę u dwóch rodzajów mszyc: jednej, która żeruje na roślinach tytoniu w polu, oraz drugiej, która tego nie robi.

Badanie tolerancji nikotyny u mszyc z wykorzystaniem eksperymentu z dietą sztuczną

Poznaj metodę sztucznego karmienia kleszczy przez silikonową membranę w komorze drukowanej 3D. System umożliwia badania nad przenoszeniem chorób przez wektory przy minimalnych objętościach krwi.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Przeglądaj więcej filmów