Name: Generowanie i manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich organoidów szyjnych z komórek nabłonkowych. Technika umożliwia manipulację genetyczną i badanie biologii komórek macierzystych szyjki macicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte grantem Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej (RS-2024-00439434 dla Y. Jeonga).

Izolacja komórek i hodowla organoidów z użyciem ludzkich tkanek szyjki macicy zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi przez wewnętrzne komisje rewizyjne DGIST, Daegu, Korea oraz Chilgok Kyungpook National University Hospital, Gyeongsangbuk-do, Korea (DGIST-20210401-BR-112-01 oraz KNUCH-2020-12-020-001). Ludzkie tkanki ektosterwialne zostały dostarczone przez Oddział Położnictwa i Ginekologii w Narodowym Szpitalu Uniwersyteckim im. Chilgok Kyungpook. Zdrowe tkanki szyjki szyjnej zostały pobrane od pacjentek, które przeszły całkowitą laparoskopową histerektomię z powodu łagodnych chorób macicy. Wszyscy pacjenci uzyskali świadomą zgodę.
1. Izolacja pojedynczych komórek z tkanek ektocervikalnych
UWAGA: Protokół ten rozpoczyna się od próbki biopsji ektocerviksa u człowieka o wymiarach około 5 mm × 5 mm × 5 mm (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Umieść pobraną tkankę w 10-cm szalce Petriego i umyj ją raz lodowatym DPBS (bez wapnia i magnezu), aby usunąć krew i zanieczyszczenia. UWAGA: Tkanki szyjki szyjki były transportowane do laboratorium w ciągu 3 godzin po operacji w lodowatym zaawansowanym DMEM/F12 i przetwarzane natychmiast po przybyciu.</li>
	<li>Przenieś tkankę do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 mL roztworu Dispase (2,4 U/mL) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem na rotatorze rurkowym (20 rpm). UWAGA: Roztwór Dispase (2,4 U/mL) został świeżo przygotowany tuż przed użyciem przez rozpuszczenie proszku Dispase do stężenia roboczego w lodowatym DPBS.</li>
	<li>Przenieś próbkę do nowej szalki Petriego o średnicy 10 cm. Ostrożnie oddziel białą warstwę nabłonka od reszty tkanki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie odkleić powierzchnię nabłonka jako nienaruszoną warstwę. Natychmiast przenieś izolowaną warstwę nabłonka do stożkowej rurki o pojemności 50 mL utrzymywanej na lodzie. UWAGA: Jeśli nabłonek powierzchniowy nie jest łatwy do oderwania, zeskrobaj powierzchnię szczypcami z tępym końcem.</li>
	<li>Dodaj 1 mL rekombinowanego roztworu dysocjacyjnego na bazie trypsyny do oderwanej lub skrobionej próbki i przelej całą mieszankę do stożkowej probówki o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Pozostałe tkanki z poprzedniego etapu zachowaj w pozostałej stożkowej rurce o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Inkubuj 50 mL stożkową rurkę zawierającą nabłonek szyjny w temperaturze 37 °C przez 5 minut, delikatnie poruszając na rotatorze rurkowym (20 obr./min).</li>
	<li>Dodaj 10 ml świeżo przygotowanego lodowatego buforu blokującego (PBS z 2% surowicy cielęcej (BCS)) do zawiesiny komórkowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Wiruj probówkę w 450 × g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant. UWAGA: Jeśli krew jest widoczna w tkance dysocjacyjnej lub tkanka wydaje się lepka, należy przejść do następującego kroku. W przeciwnym razie przejdź do kroku 1.13.</li>
	<li>Dodaj 1 mL buforu lizyzującego RBC 1X oraz 20 μL DNazy (10 U/μL materiału) do pelletu. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby rozbić czerwone krwinki i rozłożyć lepkie DNA.</li>
	<li>Do zawiesiny komórkowej należy dodać 10 ml lodowatego buforu blokującego (PBS z 2% surowicy cielęcej (BCS)) do zawiesiny komórkowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Wiruj rurkę w 450 × g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Osusz granulat komórkowy lodowatym buforem blokującym (PBS z 2% surowicy cielęcej (BCS)).</li>
	<li>Wiruj probówkę w 450 × g przez 5 minut. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 200-500 μL pożywki do hodowli organoidów.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z roztworem trypanowego niebieskiego. Oczekiwana wydajność komórek wynosi od 50 000 do 500 000 komórek na próbkę biopsji.</li>
</ol>
2. Siew i hodowla organoidów ektocervikalnych
<ol>
	<li>Ponownie zawiesijcie 500-2 000 żywotnych komórek w końcowej objętości 50 μL pożywki organoidowej (skład opisany w liście materiałów) w mikrowirówce o pojemności 1,5 mL. Żywotność komórek oceniano przez wykluczenie trypanniebieskiego przed zasiewem.</li>
	<li>Do zawiesiny komórkowej należy dodać 50 μL matrycy błony podstawowej (np. Matrigel). Delikatnie wymieszaj na lodzie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, i wydaj mieszankę o pojemności 100 μL do wnętrza wkładu do hodowli komórkowej umieszczonej na 24-dołkowej płytce. Wszystkie procedury związane z manipulacją matrycą błony podstawnej wykonywano na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec przedwczesnej żelacji, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C, aż mieszanina błony bazalnej matrycy i komórek zastygnie.</li>
	<li>Gdy mieszanina zastygnie, należy dodać 400 μL pożywki do hodowli organoidów do studni poniżej wkładu.</li>
	<li>Hodować organoidy przez 1-2 tygodnie, aż osiągną średnią średnicę 150-250 μm (maksymalna średnica to około 500 μm). UWAGA: Gdy organoidy osiągną odpowiedni rozmiar i będą miały koncentryczny, lamelowy wzór mikrostruktur przypominających cebulę, rozważ ewentualne przepuszczenie (passage).</li>
</ol>
3. Dysocjacja organoidów i ponowne zasiewanie
<ol>
	<li>Dodaj 1 mL roztworu Dispase (2,4 U/mL) na wkład do hodowli komórkowej i delikatnie rozłącz matrycę błony podstawnej za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę matrycy membrany z bazalem z dipazą do probówki o pojemności 15 mL i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 10 ml świeżo przygotowanego lodowatego buforu blokującego (PBS z 2% surowicy cielęcej (BCS)) do zawiesiny komórkowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Wiruj rurkę w 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 200 μL TrypLE Express.</li>
	<li>Inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu blokującego lodowato zimno (PBS z 2% surowicy cielęcej (BCS)) i delikatnie pipetuj, aby zneutralizować enzym.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm, aby uzyskać pojedyncze komórki.</li>
	<li>Wirówka w probówce 450 × g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 200-500 μL pożywki do hodowli organoidów.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z roztworem trypanowego niebieskiego. Oczekiwana wydajność komórek wynosi od 50 000 do 500 000 komórek na dołek w inserwacji hodowli komórek 24-dołkowej.</li>
	<li>Następnie ponownie zawiesić 500-2 000 komórek w 50 μL pożywki do hodowli organoidów (skład opisany w liście materiałów). Dodaj 50 μL matrycy błony podstawowej do zawiesiny komórkowej. Mieszaj delikatnie, unikając powstawania pęcherzyków, i wylej mieszaninę 100 μL do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej umieszczonej na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C, aż mieszanina błony bazalnej matrycy i komórek zastygnie.</li>
	<li>Gdy mieszanina jest całkowicie zastygła (zazwyczaj po 20-30 minutach w temperaturze 37 °C), należy dodać 400 μL pożywki do hodowli organoidów do studni poniżej wkładu.</li>
	<li>Hodować organoidy przez 1-2 tygodnie w pożywce hodowlanej organoidów (skład opisany w liście materiałów) za pomocą metody 3D w macierzu zewnątrzkomórkowym. Hodowle utrzymuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w nawilżonym inkubatorze. Wymieniaj podłoże co 2-3 dni i monitoruj wzrost, aż organoidy osiągną średnią średnicę 150-250 μm.</li>
	<li>Przepuszczaj organoidy do kolejnej rundy, gdy osiągną odpowiedni rozmiar, i w razie potrzeby pokaż koncentryczny, lamelowy wzór mikrostruktur przypominających cebulę.</li>
</ol>
4. Manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych przez elektroporację
UWAGA: Protokół ten opiera się na użyciu Lonza Amaxa 4D-Nucleofector oraz zestawu P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X (#V4XP-4032).
<ol>
	<li>Po izolacji od zawiesiny komórek szyjnych szyjki macicy, należy przenieść 100 000-200 000 komórek do każdej rurki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Wiruj rurki w 450 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 20 μL mieszaniny roztworu/suplementu Nucleofector z zestawu P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X. Mieszanina przygotowuje się przez połączenie 16,4 μL roztworu Nucleofektora i 3,6 μL suplementu w probówce.</li>
	<li>Do każdej rurki zawierającej zawieszone komórki dodaj 300 nM oligo siRNA kontrolnej lub docelowej. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie. UWAGA: Objętość oligo siRNA nie powinna przekraczać 2 μL na probówkę.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś mieszaninę nukleofekcyjną (20 μL komórek zawieszonych w mieszance roztworu/suplementu Nucleofector + do 2 μL siRNA; łącznie 20-22 μL) do naczyń elektroporacyjnej z zestawu P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X.</li>
	<li>Delikatnie stuknij naczynia nukleocuvette, aby upewnić się, że próbka pokrywa dno cuwette.</li>
	<li>Zamknij pokrywę naczyń Nucleocuvette i umieść je w mechanizmie zasilającej jednostki 4D-Nucleofector. UWAGA: Upewnij się, że naczynia nukleocuvette są prawidłowo ustawione w retainerze.</li>
	<li>Rozpocznij proces nukleofekcji. Ustaw kod impulsu EA-125 dla każdej kuwety za pomocą procesu komórki głównej P4.</li>
	<li>Po zakończeniu ostrożnie usuń naczynia nukleocuvette z aparatu retainerowego.</li>
	<li>Inkubuj naczynia nukleokuwety w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby komórki mogły się ustabilizować.</li>
	<li>Otwórz pokrywkę naczyń nukleocuvette, dodaj 180 μL podgrzewczego wcześniej 37 °C medium do hodowli organoidów i delikatnie przelej zawiesinę komórkową do nowej probówki o pojemności 1,5 mL do ponownej suspensji.</li>
	<li>Weź objętość zawiesiny komórkowej zawierającej 500-2000 komórek i ponownie zawiesij ją w pożywce do hodowli organoidów do końcowej objętości 50 μL. UWAGA: Nie odrzucaj pozostałych komórek z kroku 4.12. Zostaną one wykorzystane w kroku 4.14.</li>
	<li>Hoduj organoidy, stosując się do protokołu z metody 2: Ectocervix Organoid Seed and Hodowla. Porównaj efekty siRNA, oceniając różne czynniki, w tym liczbę, rozmiar i budowę powstałych organoidów.</li>
	<li>Pozostałe komórki od etapu 4.12 należy przeprowadzić do płytki przymocowania ultraniskiego z 96 dołkami i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 48 godzinach przelać ogniwa do probówki 1,5 mL i wirować w 450 × g przez 3 minuty. Usuń nadmiar.</li>
	<li>Użyj pelletu komórkowego do eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić wybicie genów docelowych i ocenić wszelkie zmiany w ekspresji genów. UWAGA: Wszystkie ludzkie tkanki szyjki macicy i zawiesiny komórkowe powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Wykonuj wszystkie procedury z udziałem pierwotnych próbek ludzkich w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z praktykami BSL-2 oraz zgodnie z instytucjonalnymi przepisami etycznymi i biobezpieczeństwa. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego osobistego (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochrona oczu) oraz dezynfekuj powierzchnie robocze i sprzęt po użyciu zatwierdzonego przez instytucję środka dezynfekującego. Odczynniki enzymatyczne (np. enzymy dyspazacyjne i dysocjacyjne, takie jak TrypLE Express) mogą powodować podrażnienia skóry i oczu oraz generować aerozole podczas pipetowania; Unikaj powstawania aerozolu, trzymaj rurki zamknięte, gdy to możliwe, i natychmiast spłukuj wodą w razie kontaktu, stosując się do procedur ekspozycji instytucjonalnej i wytycznych producenta SDS. Utylizować wszystkie odpady biologiczne (w tym materiały zawierające matrycę i skażone tworzywa sztuczne) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W przypadku elektroporacji siRNA należy przestrzegać instrukcji bezpieczeństwa elektrycznego producenta: upewnij się, że kowety są prawidłowo osadzone i pokrywa jest całkowicie zamknięta przed inicjacją impulsów, unikaj obsługi urządzenia w mokrych rękawiczkach lub w pobliżu rozlania, sprawdź urządzenie i akcesoria pod kątem uszkodzeń oraz unikaj bezpośredniego kontaktu z elektrodami kuwety bezpośrednio po impulsowaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+incidence+and+mortality+of+cervical+cancer+in+2020%3Aa+baseline+analysis+of+the+WHO+Global+Cervical+Cancer+Elimination+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Global estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2020:a baseline analysis of the WHO Global Cervical Cancer Elimination Initiative.</a> Lancet Glob Health. 11 (2), e197-e206 (2023).</li>
<li>Worldwide cancer data. , World Cancer Research Fund International. 
 <a target="_blank" href="https://www.wcrf.org/cancer-trends/worldwide-cancer-data/">https://www.wcrf.org/cancer-trends/worldwide-cancer-data/</a> (2022).</li>
<li>Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cervical cancer.</a> Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).</li>
<li>Kwak, K., Hwang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+cervical+cancer+prevention%3A+impact+of+National+HPV+Vaccination+Program+on+young+women+in+South+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Predicted cervical cancer prevention: impact of National HPV Vaccination Program on young women in South Korea.</a> Cancer Res Treat. 56 (3), 898-908 (2024).</li>
<li>Kim, J., Lee, D., Son, K. B., Bae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+cervical+cancer+in+Korea%3Aa+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The burden of cervical cancer in Korea:a population-based study.</a> Int J Environ Res Public Health. 17 (17), 6308(2020).</li>
<li>Chang, H. K., Seo, S. S., Myong, J. P., Yu, Y. L., Byun, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+costs+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+in+the+Korean+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Incidence and costs of cervical intraepithelial neoplasia in the Korean population.</a> J Gynecol Oncol. 30 (3), e37(2019).</li>
<li>Anwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancy+outcome+after+electrosurgical+cervical+cone+biopsy+using+Fischer+cone+biopsy+excisor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Matern+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">Pregnancy outcome after electrosurgical cervical cone biopsy using Fischer cone biopsy excisor.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 29 (3), 477-481 (2016).</li>
<li>Pils, S., Eppel, W., Seemann, R., Natter, C., Ott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cervical+length+screening+in+pregnancies+after+loop+excision+of+the+transformation+zone+conisation%3A+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Sequential cervical length screening in pregnancies after loop excision of the transformation zone conisation: a retrospective analysis.</a> BJOG. 121 (4), 457-462 (2014).</li>
<li>Lee, C. J., Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+animal+replacement+testing+strategies+using+stem+cell+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Advanced animal replacement testing strategies using stem cell and organoids.</a> Int J Stem Cells. 18 (2), 107-125 (2025).</li>
<li>Jeong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+identify+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Organoid%22%5BJournal%5D)">Methods to identify epithelial stem cells.</a> Organoid. 2, e24(2022).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+genetic+manipulation+of+human+and+mouse+oesophageal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Identification and genetic manipulation of human and mouse oesophageal stem cells.</a> Gut. 65 (7), 1077-1086 (2016).</li>
<li>Myeong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolites+control+self-renewal+and+precancerous+progression+of+human+cervical+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolites control self-renewal and precancerous progression of human cervical stem cells.</a> Nat Commun. 16 (1), 2327(2025).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Rajkumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+ubiquitin-specific+protease+11+mitigates+pulmonary+fibrosis+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Loss of ubiquitin-specific protease 11 mitigates pulmonary fibrosis in human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids.</a> Int J Stem Cells. 18 (2), 205-213 (2025).</li>
<li>Ko, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+genetic+determinants+driving+esophageal+squamous+cell+carcinoma+initiation+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion.</a> Gastroenterol. 165 (3), 613-628 (2023).</li>
<li>Choi, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP1+regulates+esophageal+stem+cells%27+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">YAP1 regulates esophageal stem cells' self-renewal and differentiation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 726, 150280(2024).</li>
<li>Oh, B., Kim, J., Kim, N., Jeong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoid+system+to+evaluate+the+cytotoxicity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoid system to evaluate the cytotoxicity of natural killer cells.</a> Int J Stem Cells. 18 (1), 99-106 (2025).</li>
<li>Han, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+drug+combinations+for+cancer+identified+in+a+CRISPR+screen+for+pairwise+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synergistic drug combinations for cancer identified in a CRISPR screen for pairwise genetic interactions.</a> Nat Biotechnol. 35 (5), 463-474 (2017).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+KEAP1%2FNFE2L2+mutations+in+the+chemotherapeutic+response+of+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Role of KEAP1/NFE2L2 mutations in the chemotherapeutic response of patients with non-small cell lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 26 (1), 274-281 (2020).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+defined%2C+syngeneic+organoid+platform+for+developing+combination+therapies+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer.</a> Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Chumduri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+Wnt+signals+regulate+cervical+squamocolumnar+homeostasis+and+emergence+of+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Opposing Wnt signals regulate cervical squamocolumnar homeostasis and emergence of metaplasia.</a> Nat Cell Biol. 23 (2), 184-197 (2021).</li>
<li>He, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN-deficient+intestinal+stem+cells+initiate+intestinal+polyposis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PTEN-deficient intestinal stem cells initiate intestinal polyposis.</a> Nat Genet. 39 (2), 189-198 (2007).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+deletion+leads+to+the+expansion+of+a+prostatic+stem%2Fprogenitor+cell+subpopulation+and+tumor+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pten deletion leads to the expansion of a prostatic stem/progenitor cell subpopulation and tumor initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1480-1485 (2006).</li>
<li>Yanagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+controls+lung+morphogenesis%2C+bronchioalveolar+stem+cells%2C+and+onset+of+lung+adenocarcinomas+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Pten controls lung morphogenesis, bronchioalveolar stem cells, and onset of lung adenocarcinomas in mice.</a> J Clin Invest. 117 (10), 2929-2940 (2007).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+KEAP1%2FNRF2+and+TP53+mutations+in+lung+squamous+cell+carcinoma+development+and+radiation+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Role of KEAP1/NRF2 and TP53 mutations in lung squamous cell carcinoma development and radiation resistance.</a> Cancer Discov. 7 (1), 86-101 (2017).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dissection+of+cellular+and+molecular+features+underlying+human+cervical+squamous+cell+carcinoma+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell dissection of cellular and molecular features underlying human cervical squamous cell carcinoma initiation and progression.</a> Sci Adv. 9 (4), eadd8977(2023).</li>
<li>Koster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Chlamydia+and+HPV+co-infection+in+patient-derived+ectocervix+organoids+reveals+distinct+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming.</a> Nat Commun. 13 (1), 1030(2022).</li>
</ol>

W tym manuskrypcie opisujemy protokół ustanawiania i przekazywania ludzkich organoidów szyjnych szyjki. Dostarczamy również protokół manipulacji genetyczną, co znacząco rozwija badania biologii i patologii szyjki macicy. Chociaż zoptymalizowaliśmy protokół specjalnie pod kątem ludzkich organoidów szyjnych macicy, nasz protokół można zastosować także do innych układów organoidalnych z drobnymi modyfikacjami.
Niezbędne informacje do ustalenia i optymalizacji hodowli organoidów obejmują szczegóło...

Ektosterwix macicy jest najczęstszym miejscem raka szyjki macicy 1,2. Chociaż rak szyjki macicy zmniejsza się po wprowadzeniu szczepienia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w krajach rozwiniętych, na świecie nadal pozostaje czwartym najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet 3,4. Ponadto częstość występowania zmian przedrakowych szyjki macicy nadal rośnie w niektórych krajach 5,6. Podczas gdy niskopoziomowa zmiana nabłonkowa (LSIL) często cofa się sama, wysokopoziomowa zmiana nabłonkowa (HSIL) niesie ryzyko przejścia do inwazyjnego nowotworu i zazwyczaj wymaga interwencji chirurgicznej, takiej jak wycięcie lub konizacja. Te zabiegi mogą skrócić ektoszylicę i zwiększyć ryzyko poronienia lub przedwczesnego porodu 7,8. Głębsze zrozumienie biologii szyjki macicy, połączone z rozwojem terapii regeneracyjnej, mogłoby pomóc w rozwiązaniu tych wyzwań, ale wymaga solidnych i fizjologicznie istotnych modeli modelowych.
Modele zwierzęce znacząco poszerzyły naszą wiedzę na temat homeostazy szyjki macicy, mechanizmów chorób oraz strategii terapeutycznych. Jednak ich wrodzone różnice od biologii człowieka i patologii ograniczają ich wartość translacyjną. Alternatywnie, organoidy stały się potężnymi platformami do modelowania biologii człowieka i chorób. Organoidy to trójwymiarowe mikrostruktury pochodzące z komórek macierzystych, które odtwarzają histologię i sygnatury molekularne tkanki pochodzenia 9,10,11. Zostały one wykorzystane do identyfikacji różnorodnych komórek macierzystych tkanek ludzkich w wielu tkankach, w tym tchawicy, przełyku i szyjce macicy 12,13,14. Ponadto organoidy umożliwiają modyfikację genetyczną, umożliwiając modelowanie patogenezy różnych chorób, w tym nowotworów i włóknienia 15,16,17. Dodatkowo, organoidy stanowią skuteczną platformę do badania skuteczności i toksyczności leków lub terapii komórkowych 18,19,20,21.
Niedawno dwie niezależne grupy ustanowiły ludzkie systemy organoidów szyjnych22,23. Bazując na tych postępach, znacząco poprawiliśmy efektywność hodowli organoidów szyjnych i zidentyfikowaliśmyludzkie komórki macierzyste szyjki macicy. Ponadto, poprzez odklejanie nabłonka szyjnego, zminimalizowaliśmy obecność fibroblastów leżących pod nabłonkiem szyjnym. Poprzez zastosowanie organoidów szyjnych z modyfikacją genetyczną, odkryliśmy rolę metabolitów mikroorganizmów i ich dalszych szlaków w utrzymaniu homeostazy szyjki macicy oraz zapobieganiu postępowi przednowotworowym. Dlatego ustandaryzowany i zoptymalizowany protokół generowania, utrzymania i genetycznej modyfikacji organoidów szyjnych będzie niezbędnym narzędziem do badania biologii i patologii szyjki macicy.
W tym artykule przedstawiamy szczegółowy i zoptymalizowany protokół generowania i przekazywania ludzkich organoidów szyjnych szyjki. Opisujemy także protokół manipulacji genetycznej za pomocą elektroporacji.

<table><tbody><tr><td>Zestaw P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X</td><td>Lonza</td><td>V4XP-4032</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka mocowania ultraniskiego</td><td>SPL</td><td>39796</td><td></td></tr><tr><td>Sitnik komórkowy 40 & mikro; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>50 mL stożkowa rurka 500 na pudełko</td><td>SLP</td><td>SPL50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa rurka</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Rurka CryoPure 1,8 mL - biała</td><td>Sarstedt</td><td>72.379P</td><td></td></tr><tr><td>37 i stopni; C, 5% CO2&nbsp; Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>9734IQ905476</td><td></td></tr><tr><td>Wkład do hodowli komórkowej</td><td>SPL</td><td>37024</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa 4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (2% BCS w DPBS)</td><td>Gibco / Welgene</td><td>BCS: 26010074; DPBS: LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Proch Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Enzynomika</td><td>M059L</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizy RBC</td><td>Biosesang</td><td>R2015</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605</td><td></td></tr><tr><td>Bufor płukania (HBSS)</td><td>JBI</td><td>BL003-1</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; Streptomycyna</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>118214</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-l-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72307</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-50UG</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-19-250UG</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Selleckchem</td><td>S7692&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin 1</td><td>PeproTech</td><td>100-03-50UG</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-450-01-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Sinobiologiczny</td><td>11083-HNAS</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39H-250ug</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Petrydowy 35 mm&nbsp;</td><td>SPL</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td><przepis na mocne>Organoidowe medium</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Imię</silny></td><td><silna>Kompania</silna></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silna>koncentracja</silna></td></tr><tr><td>Zaawansowane DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; Streptomycyna</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>1x bez witaminy A</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>118214</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>N-acetylo-l-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72307</td><td>10 uM</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-50UG</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-19-250UG</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Selleckchem</td><td>S7692&nbsp;</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Neuregulin 1</td><td>PeproTech</td><td>100-03-50UG</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-450-01-100UG</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Sinobiologiczny</td><td>11083-HNAS</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39H-250ug</td><td>25 ng/ml</td></tr></tbody></table>

generowanie i manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych

Generation and Genetic Manipulation of Human Cervical Organoids

Rak szyjki macicy jest czwartym najczęściej występującym nowotworem u kobiet i najczęściej dotyka ektoszys-macicy macicy. Ektocerviks macicy wyściełana jest warstwowym nabłonkiem płaskokątnym, składającym się z komórek podstawnych i różnicujących komórki parabasalne i nadpodstawne. Regeneracja obserwowana po konizacji szyjki macicy sugeruje obecność silnej aktywności komórek macierzystych. Jednak nasza wiedza na temat tożsamości i mechanizmów regulacyjnych komórek macierzystych szyjki macicy oraz ich procesu przemiany złośliwej jest ograniczona z powodu ograniczonego dostępu do ludzkich tkanek szyjki macicy oraz braku optymalnych systemów oceny aktywności komórek macierzystych w ektosterwiksie. Niedawno opracowane ludzkie organoidy szyjne mogą pomóc przezwyciężyć te ograniczenia i oferować nowe możliwości badania fizjologii i patologii szyjki macicy. Nie istnieje jednak ustandaryzowana metoda izolowania i ustalania ludzkich organoidów szyjnych szyjki. Tutaj opisujemy metodę ustalania ludzkich organoidów ektocerwialnych. Konkretnie przedstawiamy protokół izolujący pojedyncze komórki z nabłonka ektoszyjnego człowieka. Poprzez inkubację tkanki szyjki macicy w zoptymalizowanym roztworze enzymatycznym, odbieramy nabłonek szyjny, aby zmaksymalizować wydajność komórek i minimalizować skażenie fibroblastami. Dodatkowo przedstawiamy warunki hodowli ludzkich organoidów szyjnych przy użyciu zoptymalizowanej formuły pośredniej. Ponadto szczegółowo opisujemy procedury przekazywania i genetycznej manipulacji organoidami szyjnymi szyjki. Protokół ten zapewnia bardzo efektywne podejście do ustalania ludzkich organoidów szyjnych i wykorzystywania ich do badania komórek macierzystych szyjki macicy oraz chorób szyjki macicy.

3D kultura organoidów szyjnych u człowieka
Świeżo izolowane ludzkie tkanki ektoszyjne zostały rozdzielone na pojedyncze komórki w kolejności wymienionej powyżej, które następnie nakładano na wkładki z hodowli komórek 24-dołkowych i hodowlano, aby utworzyć organoidy szyjne zgodnie z tym protokołem (Rysunek 1). Ludzkie organoidy szyjne rosną do 500 μm średnicy z pojedynczych komórek w ciągu 2 tygodni (rysunek 2A). Skute...

Przedstawiamy szczegółowy protokół ustanowienia i genetycznej modyfikacji ludzkich organoidów szyjnych szyjki macicy.

Generowanie i manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych

Cervical cancer is the fourth most common cancer in women and most frequently affects the uterine ectocervix. The uterine ectocervix is lined by ...

Utworzyliśmy systemy organoidów szyjnych Schumanna do badania biologii i patologii szyjki macicy, w tym genetycznie modyfikowanych organoidów do badania funkcji genów i mechanizmów chorób. Protokół ten można zastosować do badania biologii szyjki macicy, współczesnych chorób szyjki macicy oraz przesiewowego wykrywania skutecznych leków. Ponadto protokół ten może być modyfikowany, aby ustanowić inne układy nabłonkowe organoidalne.Na początek umieść pobraną biopsję próbki tkanki ektocerviksa w 10-centymetrowej misce Petriego. Użyj lodowatego Dulbecco PBS bez wapnia i magnezu, aby raz przemyć tkankę, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Przenieś tkankę do probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej jeden mililitr roztworu Dispase w stężeniu 2,4 jednostki na mililitr.Umieść tubę na rotatorze rurkowym ustawionym na 20 obrotów na minutę i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym poruszeniem. Następnie przenieś próbkę do nowej 10-centymetrowej szalki Petriego. Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel białą warstwę nabłonka od reszty tkanki.Teraz, używając ostrych kleszczy, delikatnie odklej powierzchnię nabłonka jako nienaruszoną warstwę i natychmiast przenieś izolowaną warstwę nabłonka do rurki o pojemności 1,5 mililitra. Do pobranej lub zeskrobanej próbki dodaj jeden mililitr rekombinowanego roztworu dysocjacyjnego na bazie trypsyny. Umieść stożkową rurkę o pojemności 1,5 mililitra zawierającą nabłonek szyjny na rotatorze rurkowym ustawionym na 20 obrotów na minutę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie przeniesiono zawiesiny komórkowe do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i dodaj 10 mililitrów świeżo przygotowanego buforu blokującego lodem na zimno z PBS z 2% surowicy cielęcej wołowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Włóż probówkę do wirówki i obróć w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj do pelletu jeden mililitr buforu do lizy czerwonych krwinek, następnie 20 mikrolitrów deoksyrybonukleazy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dwukrotnie myj ogniwa, dodając 10 mililitrów buforu blokującego lodowatą temperaturę, a następnie wiruj w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch myciach ponownie zawiesz pellet w 200 do 500 mikrolitrach pożywki do hodowli organoidów. Za pomocą hemocytometru i roztworu Trypana niebieskiego policz numer komórek.Ponownie zawiesz 500 do 2 000 żywotnych komórek w ostatecznej objętości 50 mikrolitrów pożywki do hodowli organoidów w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 50 mikrolitrów matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj na lodzie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Należy wydać mieszankę o pojemności 100 mikrolitrów do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej umieszczonej na 24-dołkowej płycie.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aż mieszanina komórek matrycy błony podstawnej zesztywnieje. Następnie dodaj 400 mikrolitrów pożywki do hodowli organoidów do studni poniżej wkładu po zastygnięciu mieszaniny. Hodować organoidy przez jeden do dwóch tygodni, aż osiągną średnią średnicę 150 do 250 mikrometrów.Dodaj jeden mililitr roztworu Dispase w ilości 2,4 jednostki na mililitr na wierzch wkładki do hodowli komórkowej i delikatnie rozłącz matrycę błony podstawnej. Przelej mieszaninę matrycy membrany bazowej Dispase do probówki o pojemności 15 mililitrów i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mililitrów świeżo przygotowanego buforu blokującego lod zimno do zawiesiny komórkowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.Włóż probówkę do wirówki i obróć w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant, ponownie zawiesz granulat w 200 mikrolitrach trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj jeden mililitr buforu blokującego lod zimno i delikatnie wymieszaj, aby zneutralizować enzym.Przefiltruj zawiesinę przez sitko komórek o średnicy 40 mikrometrów, aby uzyskać pojedyncze komórki. Włóż probówkę do wirówki i obróć w 450 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesz pellet komórkowy w 200 do 500 mikrolitrach pożywki do hodowli organoidów.Za pomocą hemocytometru i roztworu Trypana należy liczyć numer komórek. Ponownie zawiesz 500 do 2 000 komórek w 50 mikrolitrach pożywki do hodowli organoidów w rurce mikrowirówki i dodaj 50 mikrolitrów matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórkowej. Delikatnie wymieszaj, aby zapobiec powstawaniu bąbelków, i wylej mieszankę o pojemności 100 mikrolitrów do wnętrza wkładu do hodowli komórkowej umieszczonej na płycie o pojemności 24 dołków.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aż mieszanina komórek matrycy błony podstawnej zesztywnieje. Po całkowitym zastygnięciu mieszaniny dodaj 400 mikrolitrów pożywki do hodowli organoidów do studni poniżej wkładu. Następnie hoduj organoidy w pożywce organoidowej przez jeden do dwóch tygodni w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, wymieniając podłoże co dwa do trzech dni.Przygotuj roztwór nukleofektora i mieszankę suplementu, łącząc 16,4 mikrolitra roztworu nukleofektora z 3,6 mikrolitra suplementu w probówce. Następnie ponownie zawiesij pellet komórkowy zawierający od 100 000 do 200 000 komórek wyizolowanych z próbki tkanki szyjki macicy w 20 mikrolitrach przygotowanego roztworu nukleofektora i mieszanki suplementów. Następnie do każdej rurki zawierającej ponownie zawieszone komórki dodaj 300 nanomolarów kontrolnego lub docelowego małego interferującego RNA oligo i delikatnie wymieszaj.Ostrożnie przelej 20 do 22 mikrolitrów mieszaniny nukleofekcyjnej do naczyń kuwety elektroporacyjnej z zestawu transfekcyjnego. Delikatnie stuknij naczynie nukleocuvette, aby upewnić się, że próbka pokrywa dno cuwette. Zamknij pokrywę naczynia Nucleocuvette i umieść naczynie w retainerze zasilanego 4D-Nucleofector.Aby rozpocząć proces nukleofekcji, wybierz główny proces komórki P4 i ustaw kod impulsu na EA125 dla każdej kuwetty. Po zakończeniu ostrożnie wyjmij naczynie nukleocuvette z retinera i inkubuj naczynie nukleocuvette w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić komórkom stabilizację. Następnie otwórz pokrywę naczynia nukleocuvette i dodaj 180 mikrolitrów podgrzewczego wcześniej podgrzewanego pożywki organoidowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej kuwetty.Delikatnie przenieś zawiesinę ogniwową do nowej rurki 1,5 mililitra do ponownego zawieszenia. Na koniec należy pobrać objętość zawiesiny komórkowej zawierającej od 500 do 2 000 komórek, ponownie zawiesić w pożywce do 50 mikrolitrów i wyhodować organoidy, jak wcześniej wykazano. Ludzkie organoidy szyjne urosły do 500 mikrometrów średnicy z pojedynczych komórek w ciągu dwóch tygodni.Barwienie hematoksyliny i eozyny wyraźnie ujawniło powstawanie warstwowego nabłonka płaskokątnego w organoidach. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że warstwa podstawowa znajduje się na zewnętrznym obrzeżu organoidów otaczających warstwy nadpodstawne. Organoidy szyjne mogły być przepuszczane co najmniej 10 razy w ciągu sześciu miesięcy.Po elektroporyzacji ludzkich komórek nabłonka szyjnego za pomocą oligologów siRNA przeciwko AKT, około 97,3% komórek było żywotnych. Jednoczesne wyciszanie AKT1 i AKT2 skutecznie wyciszyło oba geny i zakłóciło tworzenie organoidów szyjnych szyjki. Protokół ten umożliwia ilościową ocenę funkcji leków i genów w ludzkich komórkach macierzystych szyjki macicy, ułatwiając mechanistyczne badania rozwoju i chorób szyjki macicy.Obieranie lub skrobywanie małych fragmentów nabłonka szyjnego w trakcie dysocjacji pojedynczych komórek może być technicznie wyzwaniem dla początkujących. Po tym procesie można przeprowadzić analizy histologiczne, takie jak barwienie H&E i immunoimmunologiczne, analizy transkryptomiczne lub proteomiczne oraz funkcjonalne testy perturbacyjne.

generation-and-genetic-manipulation-of-human-cervical-organoids

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Organoidy mózgowe dają niespotykane dotąd możliwości badania rozwoju narządów i patologii chorób ludzkich. Chociaż osiągnięto wielki sukces w zakresie systemów hodowli organoidów mózgowych, nadal istnieją trudności operacyjne w stosowaniu tej technologii. Niniejszy protokół opisuje procedurę organoidów mózgowych, która ułatwia zmianę podłoża i transfer organoidów.

Ułatwianie hodowli organoidów mózgowych poprzez boczne oświetlenie miękkim światłem

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich organoidów szyjnych z komórek nabłonkowych. Technika umożliwia manipulację genetyczną i badanie biologii komórek macierzystych szyjki macicy.

Generowanie i manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych

Przeglądaj więcej filmów