Ulepszone mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka myszy z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Swiss Roll
25 listopada 2025
Protokół ten określa metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną na podstawie techniki "Swiss roll" pierwotnie opracowanej dla jelita myszy.
Nasze badania koncentrują się na poprawie sposobu przygotowania i analizy łagodnego żołądka do obrazowania. Zaadaptowaliśmy technikę Swiss Roll, pierwotnie opracowaną dla jelita myszego, tak aby wszystkie główne obszary żołądka, w tym dno, ciałko i antrum, mogły być osadzone razem w jednym kriogenicznym przekroju. Pozwala to wizualizować strukturę żołądka i skład komórkowy obok siebie, zachowując dokładną orientację przestrzenną i wysoką jakość obrazu.
Żołądek to złożony organ o delikatnych tkankach. Drobne błędy mogą uszkodzić komórki lub zniekształcić układ, co sprawia, że obrazowanie wysokiej rozdzielczości i barwienie immunologiczne są niespójne. Nasza technika rolowania szwajcarskiego rozwiązuje to, zachowując wszystkie regiony, w tym dwunastnicę i przełyk, w jednym bloku kriogenicznym, co czyni eksperymenty bardziej wiarygodnymi i powtarzalnymi.
Na początek użyj nożyczek, aby przeciąć brzuszną krezkę dwunastnicy i żołądka aż do szpilki w ciele. Używając pipety transferowej wypełnionej PBS, wypłukaj resztki pokarmu z lumenu żołądka. Delikatnie rozciągnij otwarty brzuch, aby uzyskać płaską orientację.
Po krótkim stabilizacji ponownie przypiąć tkankę na płasko. Za pomocą nożyczek przytnij brzuch wzdłuż przerywanego konturu, aby uzyskać jednolity kształt odpowiedni do toczenia się. Przyciętą tkankę żołądkową umieść na papierze filtracyjnym zwilżonym przez PBS.
Zwiń tkankę w formę Swiss roll i zabezpiecz ją, wkładając wykałaczkę przez środek. Po zwalcowaniu włóż igłę o grubości 30, aby ustabilizować jej kształt. Następnie wygiąć igłę pod kątem 90 stopni, aby ustabilizować przewrócony żołądek.
Utrwal tkankę w 4% paradehydu w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Następnie delikatnie usuń igłę stabilizującą. Umieść tkankę w mieszance o optymalnej temperaturze cięcia za pomocą jednorazowych form bazowych.
Następnie zamroź pleśń na suchym lodzie. Po całkowitym zamrożeniu przechowuj pleśń w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Nowa metoda umożliwiła włączenie dna dna, ciała, antrum, części przełyku i dwunastnicy do jednej mysiej sekcji żołądkowego rolka żołądkowego.
Barwienie hematoksyliny i eozyny wałka żołądkowego ujawniło dobrze zachowaną architekturę w dnie dna, korpusie, antrumie, przełyku i dwunastnicy z wyraźnie widocznymi warstwami błony śluzowej, podśluzowej i mięśniowej. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało ekspresję KIT i ANO1 w komórkach śródmiąższowych Cajala oraz ekspresję beta tubuliny 3 w neuronach jelitowych, co potwierdzało zachowanie komórek w żołądkowym wałku szwajcarskim. Ekspresję KIT wykryto także w komórkach paneth i puchara błony śluzowej żołądka, podczas gdy ANO1 był wysoko ekspresjony w komórkach nabłonka kolumnowego w dodzie.
Ekspresję tubuliny 3 beta-3 zaobserwowano w komórkach wydzielających żołądek, hormon i śluz, oprócz neuronów jelitowych. Barwienie łańcuchem 11 miozyny potwierdziło obecność komórek mięśni gładkich i miofibroblastów w błonie śluzowej żołądka, natomiast barwienie E-kadheryną wykazało komórki nabłonkowe i barwienie KIT ponownie oznaczały komórki śródmiąższowe Cajala. Szwajcarska technika drogowa może posunąć naprzód badania nad zmianami specyficznymi dla poszczególnych obszarów w tkance żołądka.
W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, które osadzają obszar oddzielnie, technika Swiss Roll przetwarza wszystkie obszary żołądka w identycznych warunkach, oszczędzając zarówno czas, jak i odczynniki. Czyni ją praktyczną i skalowalną platformą do kompleksowej analizy tkanki żołądkowej zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną z techniki „szwajcarskiego rulonu” (ang. Swiss roll), opracowanej pierwotnie dla jelit myszy. Metoda ta pozwala na wizualizację struktury żołądka i składu komórkowego przy zachowaniu orientacji przestrzennej oraz jakości obrazu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Gastrologia
- Histologia
Wprowadzenie
- Żołądek jest złożonym organem o delikatnych tkankach.
- Tradycyjne metody często prowadzą do niespójności w obrazowaniu i barwieniu.
- Technika Swiss Roll pozwala na wspólne zatopienie wielu obszarów żołądka.
- Zwiększa to niezawodność i odtwarzalność eksperymentów.
Cel badania
- W celu usprawnienia przygotowania i analizy tkanek żołądka do obrazowania.
- W celu zwizualizowania wszystkich głównych regionów żołądka na jednym przekroju kriologicznym.
- W celu zachowania dokładnej orientacji przestrzennej podczas obrazowania.
Zastosowane metody
- Adaptacja techniki Swiss Roll do immunobarwienia całego żołądka.
- Wykorzystanie nożyczek i pipet do przygotowania tkanki.
- Zatapianie tkanki w optymalnym medium do krioctnięć (OCT).
- Barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny architektury tkanki.
Główne wyniki
- Dobrze zachowana architektura w różnych obszarach żołądka.
- Skuteczne barwienie immunofluorescencyjne specyficznych typów komórek.
- Wykazana ekspresja kluczowych białek w tkankach żołądka.
- Potwierdzona obecność komórek mięśni gładkich i komórek nabłonkowych.
Wnioski
- Technika „szwajcarskiego rulonu” (Swiss Roll Technique) usprawnia analizę tkanki żołądka.
- Umożliwia ona jednoczesne przetwarzanie wszystkich obszarów żołądka.
- Metoda ta jest praktyczna i skalowalna w badaniach nad zdrowiem i chorobami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spójne mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka jest kluczowe dla wysokiego poziomu pewności w walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków na schorzenia układu pokarmowego. Zmodyfikowana technika „swiss roll” umożliwia powtarzalną, porównawczą analizę wszystkich głównych regionów żołądka myszy, co wspiera rzetelne badania porównawcze i minimalizuje zmienność eksperymentalną. To skalowalne podejście zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w potokach badań translacyjnych skoncentrowanych na biologii żołądka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia kompleksową analizę markerów komórkowych specyficznych dla poszczególnych regionów dna, trzonu i przedzielenia żołądka.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zachowanie natywnej architektury tkanki w celu dokładnej analizy szlaków sygnałowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez wysokiej jakości odczyty immunofluorescencyjne i histologiczne.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów żołądkowych w portfelach badawczych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne przekroje tkanek do późniejszego opracowywania testów i procesów przesiewowych.
- Gwarantuje spójność ilościową i jakościową wyników immunobarwienia we wszystkich regionach żołądka.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie zwalidowanych próbek biologicznych do analiz wysokoprzepustowych.
- Zmniejsza zużycie odczynników i czas eksperymentu dzięki przetwarzaniu wszystkich regionów w identycznych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia spójność translacyjną poprzez dopasowanie badań omiki przestrzennej i biomarkerów do obszarów żołądka istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, minimalizując utratę tkanek oraz zmienność eksperymentalną.
- Umożliwia bezpośrednie porównanie stanów fizjologicznych i patologicznych w modelach przedklinicznych.
- Zwiększa skuteczność ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami żołądka i opracowywaniem terapii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu, przez opracowywanie testów, aż po badania przedkliniczne – stanowiąc powtarzalną platformę do analizy przestrzennej i molekularnej tkanek żołądka.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie analizy markerów specyficznych dla danego regionu w naturalnym kontekście tkankowym.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych skrawków do ilościowego barwienia immunocytochemicznego oraz badań porównawczych.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze, multipleksowe odczyty dla wiarygodnego porównania statystycznego regionów żołądka.
- Badania translacyjne: Utrzymuje ciągłość anatomiczną i molekularną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalną, ustandaryzowaną platformę przygotowania tkanek dla różnorodnych zastosowań w badaniach nad żołądkiem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w badaniach nad celami w żołądku.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów przygotowania tkanek.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację zmienności eksperymentalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych dotyczących żołądka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami, ich utrwalaniu oraz kriosekcjonowaniu w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Wymaga dostępu do kriostatu oraz infrastruktury do obrazowania histologicznego i immunofluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji orientacji tkanki i protokołów barwienia pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych modeli mysich i kompatybilna z przepływami pracy w omice przestrzennej.
- Zależna od starannego obchodzenia się z próbkami w celu zachowania delikatnej architektury żołądka i zminimalizowania utraty tkanki.
