Name: Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metody masowej hodowli nicieni entomopatogenicznych Steinernema carpocapsae i Heterorhabditis bacteriophora przy użyciu żelu poliakrylamidowego oraz larw Tenebrio molitor. Te proste systemy umożliwiają rolnikom samodzielną produkcję biologicznych środków owadobójczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność Stacy Byrd za pomoc techniczną. Wspomnienie nazw handlowych lub produktów komercyjnych w tej publikacji ma wyłącznie na celu dostarczenie określonych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.

1. Uzyskanie początkowego inokulum i podstawowe procedury
UWAGA: Produkcja masowa dla metod opartych na hodowcach opiera się na zakażonych żywicielach owadów. W pierwszej metodzie, po uzyskaniu początkowego inokulum, zawiesin wodnych nicieni nie są już potrzebne do zakażenia nowych żywicieli.
<ol>
	<li>Aby rozpocząć początkowe inokulum, uzyskaj pożądany gatunek EPN. Użyj stadium zakaźnego (IJ) Steinernema carpocapsae (wszystkie odmiany) i Heterorhabditis bacteriophora (odmiana VS).</li>
	<li>Używając IJ, zakaź ostatnią larwę G. mellonella metodą pułapki White7.</li>
	<li>Zakazać żywych 50 larw G. mellonella IJ (100 IJ/owód) S. carpocapsae lub H. bacteriophora w naczyniach Petri (90 mm) wyłożonych papierem filtrowym. Trzymaj zakazane owady w temperaturze 25 °C do momentu, gdy IJ są blisko wyjścia (5-7 dni dla S. carpocapsae, 7-10 dni dla H. bacteriophora).</li>
	<li>Kontynuuj proces ciągłej produkcji opartej na hodowcach9.
	<ol>
		<li>Do masowego inokulum umieść jedno zainfekowane zwłoki (np. zakażone S. carpocapsae lub H. bacteriophora) z 50 żywymi larwami G. mellonella w plastikowym pojemniku (pojemniki 5,7-14,2 L) wyłożonym wilgotnym ręcznikiem papierowym i trzymaj w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Po 72 h usuń zwłoki, które nie wykazują odpowiednich zmian barwy (brązowe/brązowe dla Steinernema; czerwono/pomarańczowo dla Heterorhabditis) z pojemnika, aby uniknąć skażenia.</li>
		<li>Przenieś zwłoki do pojemników z proszkiem żelu poliakryloamidowego w przezroczystych plastikowych pojemnikach i zwilż wodą (20 mL/suchy gram żelu). Umieść zwłoki na wierzchu siatki z nici nylonowej (2 mm × 2 mm wielkość porów), aby je oddzielić od żelu7.</li>
		<li>Zbierz IJ z zakażonych żywicieli (które pozostają na sicie na wierzchu żelu). Kontynuuj zbieranie do żelu do momentu, gdy ~5-7 dni po rozpoczęciu się wyjścia IJ; usuń i wyrzuć wyczerpane zwłoki (zbieranie IJ powinno być kontynuowane, aż IJ znacznie się zmniejszą, zazwyczaj około 5-7 dni). 
		UWAGA: IJ zebrane do żelu mogą być użyte do rozpoczęcia inokulum na kolejną rundę produkcji EPN, użyte bezpośrednio do zastosowania lub przechowywane w lodówce na kilka tygodni do miesięcy bez utraty żywotności, a nawet 3-6 miesięcy do ponownego inokulum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby opracować inokulum na kolejne rundy produkcji, wystaw zdrowym larwom G. mellonella na IJ w żelu w naczyniach Petri (90 mm). Następnie użyj tych nowo zakażonych żywicieli do zakażenia kolejnej grupy larw G. mellonella (jak wspomniano powyżej w punktach 1.2 i 1.3).</li>
	<li>Do zastosowań EPN, spłucz IJ, które weszły do żelu, wodą z kranu lub sitami (rozmiar porów < 0,3 cm). Alternatywnie, stosuj EPN w żelu bezpośrednio na małe areny bez spłukiwania. 
		UWAGA: EPN można stosować w zawiesinach wodnych i stosować za pomocą standardowej praktyki hodowlanej (opryskiwacze, nawadnianie itp.)7. Żel można przechowywać przez kilka tygodni w lodówce z niewielkimi spadkami żywotności EPN, podczas gdy w temperaturze pokojowej można go przechowywać nie dłużej niż 2 tygodnie. W lodówce żel można przechowywać przez miesiące (dokładne czasy będą różne w zależności od gatunku EPN).</li>
</ol>
2. Eksperyment z Steinernema carpocapsae 
UWAGA: Celem tego badania było zweryfikowanie produkcji IJ w podejściu opartym na hodowcach względem standardowej metody White trap poprzez zmianę wielkości aren.
<ol>
	<li>Ustaw eksperyment tak, aby obejmował pięć traktowań z różnymi gęstościami zwłok, wahającymi się od 5 do 50 żywicieli na arenę.
	<ol>
		<li>T1: Kontrolka: Umieść 5 zwłok w pułapkach White w naczyniach Petri (10,0 cm × 1,5 cm; średnica [D] × wysokość [H]) lub 0,06 zwłok/cm2.</li>
		<li>T2: Umieść 30 zwłok w większych pułapkach White (15,0 cm × 1,5 cm; D × H) w 14,2 L przezroczystych plastikowych pojemnikach (43,2 cm × 28,3 cm × 16,5 cm; D × S × W) lub 0,025 zwłok/cm2.</li>
		<li>T3: Umieść 25 zwłok w żelu poliakryloamidowym (15 g proszku żelu + 300 ml wody z kranu) w 5,7 L przezroczystych plastikowych pojemnikach (36,2 cm × 21 cm × 12,4 cm; D × S × W) lub 0,033 zwłok/cm2.</li>
		<li>T4: Umieść 30 zwłok w żelu poliakryloamidowym (35 g suchego

<ol><li>Campos-Herrera, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Herrera%2C+R+%22Nematode+Pathogenesis+of+Insects+and+Other+Pests%3A+Ecology+and+Applied+Technologies+for+Sustainable+Plant+and+Crop+Protection%22">Nematode Pathogenesis of Insects and Other Pests: Ecology and Applied Technologies for Sustainable Plant and Crop Protection</a>. , Springer International Publishing. Cham. (2015).</li>
<li>Lacey, L. A., Georgis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+for+control+of+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes for control of insect pests.</a> J Nematol. 44 (2), 218-225 (2012).</li>
<li>Mucci, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apex+predator+nematodes+and+meso-predator+bacteria+consume+their+basal+insect+prey+through+discrete+stages+of+chemical+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Apex predator nematodes and meso-predator bacteria consume their basal insect prey through discrete stages of chemical transformations.</a> mSystems. 7 (3), e0031222(2022).</li>
<li>Shapiro-Ilan, D. I., Leite, L. G., Han, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Prod+Benef+Organisms%22%5BJournal%5D)">Production of entomopathogenic nematodes.</a> Mass Prod Benef Organisms. 2023, 293-315 (2023).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66 (1709), 302-303 (1927).</li>
<li>Hazir, S., Kaya, H. K., Touray, M., Çimen, H., Shapiro-Ilan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+laboratory+and+field+manual+for+conducting+research+with+the+entomopathogenic+nematodes%2C+Steinernema+and+Heterorhabditis%2C+and+their+bacterial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Zool%22%5BJournal%5D)">Basic laboratory and field manual for conducting research with the entomopathogenic nematodes, Steinernema and Heterorhabditis, and their bacterial symbionts.</a> Turk J Zool. 46 (4), 305-350 (2022).</li>
<li>Shapiro-Ilan, D., Raymond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+opportunities+for+cheating+stabilizes+virulence+in+insect+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Appl%22%5BJournal%5D)">Limiting opportunities for cheating stabilizes virulence in insect parasitic nematodes.</a> Evol Appl. 9 (3), 462-470 (2016).</li>
<li>Askary, T. H., Ahmad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+virulence+capacity+of+native+strain+of+entomopathogenic+nematode%2C+Steinernema+cholashanense%2C+in+different+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Agric+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and virulence capacity of native strain of entomopathogenic nematode, Steinernema cholashanense, in different formulations.</a> Agric Res. 10 (3), 390-397 (2021).</li>
<li>Oliveira-Hofman, C., Steffan, S., Shapiro-Ilan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sustainable+grower-based+method+for+entomopathogenic+nematode+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">A sustainable grower-based method for entomopathogenic nematode production.</a> J Insect Sci. 23 (5), 4(2023).</li>
<li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 56 (5-6), 623-633 (2001).</li>
<li>Dunn, M. D., Belur, P. D., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cost-effective+media+for+the+in+vitro+liquid+culture+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Development of cost-effective media for the in vitro liquid culture of entomopathogenic nematodes.</a> Nematology. 24 (7), 763-775 (2022).</li>
<li>Automated insect separation system. US Patent. , US8025027Bl (2011).</li>
<li>Gaugler, R., Brown, I., Shapiro-Ilan, D., Atwa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+technology+for+in+vivo+mass+production+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">Automated technology for in vivo mass production of entomopathogenic nematodes.</a> Biol Control. 24, 199-206 (2002).</li>
<li>Lindegren, J. E., Valero, K. A., Mackey, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+in+vivo+production+and+storage+methods+for+Steinernema+carpocapsae+infective+juveniles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Simple in vivo production and storage methods for Steinernema carpocapsae infective juveniles.</a> J Nematol. 25 (2), 193-197 (1993).</li>
<li>System and method for producing beneficial parasites. US Patent. , 8677935 (2014).</li>
<li>Van Zyl, C., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+culturing+of+Galleria+mellonella+and+Tenebrio+molitor+and+entomopathogenic+nematode+production+in+various+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+Entomol%22%5BJournal%5D)">Cost-effective culturing of Galleria mellonella and Tenebrio molitor and entomopathogenic nematode production in various hosts.</a> Afr Entomol. 23 (2), 361-375 (2015).</li>
<li>Testa, A. M., Shields, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+labor+%26%2334%3Bin+vivo%26%2334%3B+mass+rearing+method+for+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">Low labor &#34;in vivo&#34; mass rearing method for entomopathogenic nematodes.</a> Biol Control. 106, 77-82 (2017).</li>
<li>Ye, W., Foye, S., MacGuidwin, A. E., Steffan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Oscheius+onirici+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potentially+entomopathogenic+nematode+from+the+marshlands+of+Wisconsin%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Incidence of Oscheius onirici (Nematoda: Rhabditidae), a potentially entomopathogenic nematode from the marshlands of Wisconsin, USA.</a> J Nematol. 50 (1), 9-26 (2018).</li>
<li>Foye, S., Steffan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+native+Wisconsin+nematodes+represent+virulent+biocontrol+agents+in+cranberries%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">Two native Wisconsin nematodes represent virulent biocontrol agents in cranberries.</a> Biol Control. 138, 104042(2019).</li>
<li>Foye, S., Steffan, S. A., Bruck, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rare%2C+recently+discovered+nematode%2C+Oscheius+onirici+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+kills+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+within+fruit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A rare, recently discovered nematode, Oscheius onirici (Rhabditida: Rhabditidae), kills Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) within fruit.</a> J Econ Entomol. 113 (2), 1047-1051 (2020).</li>
<li>Shapiro-Ilan, D. I., Lewis, E. E., Son, Y., Tedders, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+efficacy+observed+in+entomopathogenic+nematodes+applied+in+infected-host+cadavers+compared+with+application+in+aqueous+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Superior efficacy observed in entomopathogenic nematodes applied in infected-host cadavers compared with application in aqueous suspension.</a> J Invertebr Pathol. 83 (3), 270-272 (2003).</li>
<li>Gulzar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+tolerance+of+entomopathogenic+nematodes+differs+among+nematodes+arising+from+host+cadavers+versus+aqueous+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Environmental tolerance of entomopathogenic nematodes differs among nematodes arising from host cadavers versus aqueous suspension.</a> J Invertebr Pathol. 175, 107452(2020).</li>
<li>Leite, L. G., Shapiro-Ilan, D. I., Hazir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Steinernema+feltiae+in+different+formulation+substrates%3A+Improved+longevity+in+a+mixture+of+gel+and+vermiculite%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">Survival of Steinernema feltiae in different formulation substrates: Improved longevity in a mixture of gel and vermiculite.</a> Biol Control. 126, 192-197 (2018).</li>
<li>Georgis, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorgis%2C+R+%22Formulation+and+Application+Technology.+In+Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control%22">Formulation and Application Technology. In Entomopathogenic Nematodes in Biological Control</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1990).</li>
<li>Leite, L. G., Chacon-Orozco, J. G., Shapiro-Ilan, D. I., Baldo, F. B., Cardoso, J. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+for+optimizing+production+and+storage+of+Steinernema+rarum+in+a+novel+biphasic+process%2C+and+efficacy+of+the+nematode+against+Sphenophorus+levis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature for optimizing production and storage of Steinernema rarum in a novel biphasic process, and efficacy of the nematode against Sphenophorus levis.</a> Biol Control. 187, 105381(2023).</li>
<li>Sharifi-Far, S., Shapiro-Ilan, D. I., Brownbridge, M., Hallett, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+approach+of+strain+discovery+and+the+inbred+line+technique+for+improving+control+of+Delia+radicum+with+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Control%22%5BJournal%5D)">The combined approach of strain discovery and the inbred line technique for improving control of Delia radicum with Heterorhabditis bacteriophora.</a> Biol Control. 118, 37-43 (2018).</li>
<li>Shapiro-Ilan, D. I., Morales-Ramos, J. A., Rojas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+production+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo production of entomopathogenic nematodes.</a> Methods Mol Biol. 1477, 137-158 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania wykazały, że metody zorientowane na producenta (z żelem poliakryloamidowym i/lub dwuwarstwową gazą pokrytą polimerem) mogą niezawodnie produkować duże ilości nicieni dla programów zwalczania szkodników. Co ważne, podstawowe parametry wymienionych powyżej procesów można ulepszyć, aby spełnić potrzeby producentów (np. gęstość żywiciela, wielkość aren i używane podłoża). Dwa podejścia mogą być odpowiednie dla różnych systemów upraw; porównanie i dalsza optymalizacja metod będzie głównym tematem przyszłych badań.
Porównując żel poliakryloamidowy z metodą opartą na pułapce White'a, podłoże żelowe produkuje większe liczby IJ. Krytycznym elementem tych ustaleń jest to, że IJ mogą bezpośrednio przemieszczać się do żelu, podczas gdy w pułapkach White'a muszą przemieszczać się z wnętrza naczynia trzymanego do naczynia do zbioru, a zatem niektóre IJ mogą nie dotrzeć do naczynia do zbioru. Istnieją zalety zbierania IJ bezpośrednio z żelu, ponieważ IJ mają tendencję do rozpraszania się w otoczeniu, skupiając się efektywnie w żelu, ułatwiając przechowywanie i/lub zbiór15.
Podobnie, IJ hodowane w czerwcu osadzone w dwuwarstwowym gazie mogą również opuszczać padliny i, śledząc siłę grawitacji, przemieszczają się w dół i gromadzą na/w zwłóknionych włóknach gazy. Struktura dwuwarstwy pokrytej polimerem tworzy dużą powierzchnię, na której nicienie mogą się koncentrować. Łatwość hodowli i zbioru IJ sprawia, że to podejście jest przystosowane do producentów chcących produkować nicienie we własnym zakresie. Ustalenie, że gaza końska jest równie produktywna jak wata bawełniana, jest bardzo ważne, ponieważ wskazuje, że zalety gazy konnej (tj. poprawiona wydajność zbioru nicieni) mogą być utrzymane bez spadku wydajności. Prawdopodobnie gaza końska zapewnia lepsze przewietrzenie w porównaniu z watą bawełnianą, ponieważ włókna gazy nie zapadają się w gęstą, nasiąkniętą wodą mata. Co ważne, nicienie, które pojawiają się bezpośrednio z zakażonego żywiciela (zgodnie z naszymi metodami in vivo), wykażą się - jako populacja - zdolnością do znajdowania, obezwładniania i zabijania owadów żywicieli, co wskazuje na wysoki stopień zakaźności (zdolności inwazyjnej), lepszą zdolność do rozsiewania, wyższą wirulencję i tolerancję środowiskową (abiotyczną), w porównaniu z nicieniami wyprodukowanymi metodami in vitro21,22.
Proponowane tutaj systemy produkcji zorientowane na producenta mogą być łatwo dostosowane do innych gatunków EPN, ponieważ owadzi żywiciel, Galleria mellonella, jest bardzo podatny na większość gatunków Steinernema i Heterorhabditis 6. Można zastosować inne owadzie żywiciele, takie jak T. molitor6,7,18,19. Wartość formuły żelowej została wykazana przez Leite et al. (2018)23; jeśli są przechowywane w odpowiedniej temperaturze w systemie żelowym, mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed użyciem. Formuła na bazie żelu jest bardzo odpowiednia dla większości systemów aplikacji; żele z poliakrylamidami były z powodzeniem stosowane jako standardowe formuły EPN przez dziesięciolecia6,7,24. Ponadto żele mają wysoki poziom pojemności magazynowej, a zbieranie z żelu poprzez przesiewanie i płukanie jest bardzo łatwe24, może zająć mniej niż 5 minut (obserwacja osobista Shapiro-Ilan) i wyższe plony obserwuje się w podejściu z systemem żelowym w porównaniu z pułapkami White'a. Formuły żelowe zatrzymujące IJ wewnątrz preparatów (podczas gdy inne formuły (na bazie torfu, wermikulitu, mieszanki doniczkowej, kremy z okrzemki i kompostu z grzybów) miały wyższy procent IJ, które uciekły z medium23). Dalsze badania nad podłożami do przechowywania nicieni, które mogą całkowicie się rozpuścić w wodzie zbiornika do opryskiwania (np. gąbka fenolowa, jak zastosowano przez Leite et al. (2023)25) będą przydatne dla producentów.
Nasz podejście zorientowane na producenta ma potencjalną wadę - wielokrotne podhodowle mogą powodować pogorszenie wirulencji nicieni, co jest potencjalnym problemem dla wszystkich systemów produkcyjnych. Problemu tego można uniknąć, jeśli producenci użyją początkowego inokulum z linii inbredowanych26 i następnie ograniczają gęstość nicieni podczas infekcji, ograniczając tym samym występowanie "oszustów" (niewirulentne nicienie, które polegają na innych nicieniach do zabicia gospodarza) w kulturach nicieni27.
Nasze nowe metody produkcji oparte na producentach reprezentują zrównoważone, dostępne, wysoko

Glistniki entomopatogenne (EPN), reprezentowane powszechnie przez gatunki Steinernema i Heterorhabditis, od wielu lat są używane jako skuteczne środki biologicznego zwalczania szkodników przenoszonych przez glebę1. EPN żerują w glebie na gospodarzach owadów, a gdy nicień znajdzie odpowiedniego gospodarza, wchodzi do ciała owada i uwalnia symbiotyczne bakterie, które zabijają owada2. Te symbiotyczne bakterie konsumują żywiciela, rozmnażają się w zwłokach i stają się głównym źródłem pokarmu dla nicieni3. Ostatecznie, po wielu pokoleniach nicieni w ciele zwłok gospodarza, infekują młode nicienie (IJ) wychodzą na poszukiwanie nowych gospodarzy owadów. Na tym etapie nicienie mogą być zebrane i wykorzystane jako bio-insektycyd do ochrony upraw. Rolnicy (oraz inni interesariusze rolniczy) mogą kupować preparaty takich pożytecznych nicieni, ale rzadko rolnicy mogą wyhodować własne nicienie do zastosowania w programach zwalczania szkodników.
Hodowla i zbiór nicieni metodami produkcji typowymi może być dość trudne. Hodowla na małą skalę EPN jest często oparta na metodach in vivo, podczas gdy na większą skalę stosuje się produkcję in vitro4. Większość metod in vitro wykorzystuje homogenaty produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego jako dietę dla nicieni, omijając w ten sposób manipulowanie owadami. Niciennie nie jest zaskakujące, że produkcja in vivo może być wymagająca i kosztowna, ponieważ polega na inokulowaniu żywych owadów gospodarzy, często przy użyciu metody pułapki White5 z Galleria mellonella L. (gąsienice woskowe) lub Tenebrio molitor L. (gąsienice mączne). Hodowla nicieni wewnątrz żywych owadów gospodarzy nie tylko podnosi koszt żywych owadów, ale także zwiększa pracę związaną z ich manipulacją.
Gdy EPN rozwijają się wewnątrz swoich owadów gospodarzy, zwłoki pokazują charakterystyczne objawy infekcji odpowiadające gatunkowi EPN, który je zainfekował6. Zwłoki mogą następnie być umieszczane na nawilżonej powierzchni w naczyniu trzymanym wewnątrz większego naczynia wypełnionego wodą7. Gdy nicienie zakończą swój cykl życiowy wewnątrz zwłok gospodarza, IJ wychodzą z zwłok i są zbierane, zazwyczaj poprzez delikatne nawadnianie wodą, a następnie przechowywane w różnych mediach, w tym w obojętnych podłożach takich jak żele (Rysunek 1), trociny lub wermikulit8. Produkcja in vivo ogólnie odzwierciedla niską ekonomię skali z powodu kosztów pracy i owadów7,9.
Produkcja in vitro opiera się na wychowywaniu EPN na sztucznych mediach zawierających kultury monokseniczne EPN i ich symbiotyczne bakterie, Photorhabdus (dla Heterorhabditis) i Xenorhabdus (dla Steinernema)4,10. Metoda ta wymaga zaawansowanej znajomości i znacznych wydatków na materiały i sprzęt niezbędny do fermentacji o wysokiej wydajności11. W rezultacie, niezawodna produkcja EPN in vitro jest prawdopodobnie za drogie dla wielu gospodarstw rolnych.
Dla rolników i innych interesariuszy rolniczych, trudności techniczne związane z technikami in vitro można ominąć poprzez ulepszenie metodologii in vivo, szczególnie poprzez ulepszony wychów owadów12 w połączeniu z zautomatyzowaną inokulacją i zbiorem nicieni7,13. Takie metody in vivo mogą stać się znacznie bardziej wydajne, ponieważ optymalizują procedury inokulację, produkcję i przechowywanie EPN7,14,15,16. Ponadto, produkcja in vivo może być dostosowana do potrzeb użytkowników końcowych poprzez ułatwienie wytwarzania EPN przez samych rolników17. Jedną z podstawowych wad tej metody jest to, że szczepionka nicieni musi być dostarczana hodowcom z komercyjnego lub finansowanego publicznie źródła dla każdej rundy produkcji9, co sprawia, że hodowca jest stale zależny od zewnętrznego źródła szczepionki. Dlatego potrzebna była trwała, długoterminowa metoda produkcji EPN dla hodowców. Wynikiem tych badań są metody trwałe, przedstawione w niniejszym artykule.
Aby zbadać te podejścia, ustanowiliśmy dwie różne metody produkcji in vivo. W pierwszej metodzie porównano produkcję in vivo z standardową metodą pułapki White z nowatorską metodą zorientowaną na hodowców. Rezultatem jest stosunkowo prosta, nisko kosztowa metoda produkcji EPN, która jest trwała

<table><tbody><tr><td>Clear plastic Containers</td><td>Sterile Crop, Townsend MA</td><td>https://www.sterilite.com/</td><td></td></tr><tr><td>Clear plastic Containers</td><td>Iris USA, Inc, Pleasant Prairie, WI</td><td>https://www.irisusainc.com/</td><td></td></tr><tr><td>Wata bawełniana</td><td>MedLine Cotton Rolls, 1 &times; 8.5 ft rolls</td><td>https://athome.medline.com/en/medline-sterile-cotton-roll-1in-x-8-5ft-1lb-10ct-non6028</td><td></td></tr><tr><td>Heterorhabditis georgiana</td><td>USDA ARS Vegetable Crops Research Unit, Madison, WI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ocheius onirici&nbsp;</td><td>USDA ARS Vegetable Crops Research Unit, Madison, WI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Proszek do żelu poliakrylamidu</td><td>Soil Moist, JRM Chemical, Cleveland OH</td><td>https://www.soilmoist.com/</td><td></td></tr><tr><td>Wata bawełniana powlekana polimerem (gaza konna)</td><td>Leggett &amp; Platt</td><td>BB Satin Star 12'S, 30 &times; 36 inch roll</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema carpocapsae (wszystkie szczepy)&nbsp; Heterorhabditis bacteriophora (szczep VS)</td><td>USDA ARS Southeastern Fruit and Tree Nut Research Laboratory, Byron, GA.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Grower-Based In Vivo Propagation of Entomopathogenic Nematodes

Niematody entomopatogenne (NEP) produkowane metodami in vitro lub in vivo są wysoce efektywnymi środkami biokontroli w zarządzaniu szkodnikami owadami. Systemy masowej propagacji in vivo dają wysokiej jakości nicienie, ale często są bardziej pracochłonne i/lub mniej opłacalne niż komercyjne metody in vitro. Opisane do tej pory systemy propagacji nicieni dla hodowców są ogólnie niezawodne, ponieważ polegają na zewnętrznych źródłach (laboratoria przemysłowe lub akademickie) do kalibracji inokulum. Zaprojektowaliśmy nowatorskie systemy dla hodowców, w których rolnicy mogą ciągle produkować własne nicienie po uzyskaniu inokulum z uznanych laboratoriów/firm produkujących NEP.
Przedstawiamy tutaj dwie metody masowej propagacji NEP jako bioinsektycydów dla rolników. W pierwszej metodzie, porównaliśmy produkcję nicieni in vivo z użyciem standardowej metody pułapki White z podejściem dla hodowców z zastosowaniem żelu poliakrylamidowego jako podłoża dla nicieni. Metoda dla hodowców wyprodukowała więcej nicieni niż standardowa metoda podczas hodowania dwóch powszechnie dostępnych gatunków NEP (Steinernema carpocapsae i Heterorhabditis bacteriophora).
W drugiej metodzie, dwa rodzime gatunki nicieni (Oscheius onirici i Heterorhabditis georgiana) były masowo rozmnażane w żywych larwach chrząszczy (Tenebrio molitor), które były osadzone między dwiema warstwami bawełny pokrytej polimerem. Zebranie wylęgających się nicieni z warstwy bawełny polegało na systematycznym nawadnianiu tacki, tworząc zawiesinę nicieni gotową do zastosowań w polu. Te systemy dla hodowców obiecują szerokie przyjęcie przez interesariuszy rolniczych, ponieważ podejścia są technicznie proste i skalowalne dla tych, którzy szukają dostępnych, niezawodnych metod produkcji nicieni. Dostarczając hodowcom środków do stworzenia własnych narzędzi do zarządzania szkodnikami, te metody powinny ułatwić większą niezależność i opłacalność na farmach w USA.

S. carpocapsae eksperyment 
Efekty leczenia były istotne w oparciu o średnią liczbę IJ/kadłub (ANOVA jednoczynnikowa: F4,39 = 2,95, P = 0,0362). Tylko T2 i T4 były istotnie różne od siebie, ponieważ T4 wyprodukowało więcej IJ na kadłub (244 029 ± 16 241) niż T2 (159 114 ± 9 669) (Rysunek 2).
H. bacteriophora eksperyment 
W tym eksperymencie stwierdzono istotny efekt leczenia na średniej liczbie IJ na kadłub (ANOVA jednoczynnikowa: F1,19 = 5,0, P = 0,040). Leczenie oparte na metodzie zorientowanej na hodowcę miało znacznie więcej IJ/kadłub (186 389 ± 28 645) niż leczenie pułapką White (124 470 ± 19 129) (Rysunek 3).
Oscheius onirici i Heterorhabditis georgiana rozmnażanie 
Warstwa koniczyny była równie skuteczna jak wata w zapewnieniu podłoża do hodowli nicieni O. onirici i H. georgiana (ANOVA dwuczynnikowa: główny efekt tożsamości nicieni: F1,23 = 0,146; P = 0,706; główny efekt typu podłoża: F1,23 = 0,104; P = 0,751; oddziaływanie między tożsamością nicieni a typem podłoża: F1,23 = 0,346; P = 0,563). Średnia O. onirici na litr z tacki z waty i koniczyny wynosiła odpowiednio (w milionach) 101,11 ± 13,73 i 95,93 ± 20,19. Średnia H. georgiana na litr z tacki z waty i koniczyny wynosiła odpowiednio (w milionach) 82,23 ± 18,69 i 99,93 ± 18,40.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Diagram metody opartej na hodowcy. Krok 1: inokulacja; Krok 2: inkubacja masowa; Krok 3: przeniesienie na żel poliakrylamidowy z sitkiem. Skrót: IJ = zarażone larwy nicieni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Średnia produkcja zarażonych larw (IJ) Steinernema carpocapsae (wszystkie) na Galleria mellonella kadłub w pięciu leczenach. Skrót: IJ = zarażone larwy nicieni. Ten rysunek został wzięty z pozwolenia Oliveira-Hofman et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Średnia produkcja zarażonych larw (IJ) Heterorhabditis bacteriophora (szczep VS) na Galleria mellonella kadłub z pułapki White i leczenia żelem poliakrylamidowym. Ten rysunek został wzięty z pozwolenia Oliveira-Hofman et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Entomopathogenic nematodes (EPNs) produced through in vitro or in vivo methods are highly effective biocontrol agents for insect pest management. In vivo ...

Nasze badania rozwijają zrównoważoną, przyjazną dla hodowców metodę produkcji owadobójczych nicieni, eliminującą bariery kosztowe i techniczne, aby umożliwić rozwiązania do kontroli szkodników na farmie. Ten niskokosztowy i niskozasobowy podchod do hodowli owadobójczych nicieni prowadzi do zrównoważonej produkcji i jest łatwo przystosowywalny do różnych gatunków nicieni. Aby rozpocząć początkowe inokulum, uzyskaj pożądany gatunek owadobójczych nicieni.Użyj stadium zakaźnego larw Steinernema carpocapsae szczep ALL i Heterorhabditis bacteriophora szczep VS. W przypadku pojedynczych infekcji zaszczep 50 żywych larw Galleria mellonella zakaźnymi larwami w gęstości 100 zakaźnych larw na owada. Trzymaj zaszczepione owady w 25 stopniach Celsjusza, aż zakaźne larwy będą blisko wylęgu.W przypadku masowego inokulum umieść jeden zakażony padlinożerca z 50 żywymi larwami Galleria mellonella w plastikowym pojemniku o objętości od 5,7 do 14,2 litrów, wyłożonym wilgotnym ręcznikiem papierowym i trzymaj pojemnik w 25 stopniach Celsjusza. Po 72 godzinach usuń padlinożerców, które nie wykazują odpowiednich zmian barwy, aby uniknąć skażenia. Zidentyfikuj brązowe padlinożerców dla infekcji Steinernema i czerwone lub pomarańczowe padlinożerców dla infekcji Heterorhabditis.Następnie zwilż żel poliakryloamidowy wodą w proporcji 20 mililitrów na suchy gram żelu. Umieść padlinożerców na siatce nylonowej o wielkości porów 2 na 2 milimetra i przenieś odpowiednio zabarwione padlinożerców do przezroczystego plastikowego pojemnika zawierającego żel poliakryloamidowy. Następnie usuń i wyrzuć wyczerpane padlinożerców, gdy produkcja zakaźnych larw znacznie się zmniejszy.Żnij zakaźne larwy z zakażonych gospodarzy, które pozostają na sitowie nad żelem. Kontynuuj żniwa do żelu przez pięć do siedmiu dni po tym, jak zakaźne larwy zaczną się wylęgać. Aby opracować inokulum na kolejne rundy produkcji, wystaw zdrowe larwy Galleria mellonella na zakaźne larwy wewnątrz żelu w 90-milimetrowych naczyniach Petriego.Użyj tych nowo zakażonych gospodarzy do zaszczepienia kolejnej grupy larw Galleria mellonella. W przypadku zastosowań owadobójczych nicieni przepłukuj zakaźne larwy, które weszły do żelu, wodą z kranu i sitami o wielkości porów mniejszej niż 0,3 centymetra. Alternatywnie, stosuj nicienie bezpośrednio w żelu do małych aren bez przepłukiwania.Aby uzyskać zakaźne larwy Oscheius onirici i Heterorhabditis georgiana z kultur in vivo nicieni z Tenebrio molitor jako gospodarzem, delikatnie podlej okrągłą wacikę wodą. Umieść cztery do sześciu larw Tenebrio molitor, żywych lub zamrożonych, w nienachodzącym się wzorze między dwoma wacikami i dodaj 10 do 15 mililitrów wody. Dodaj 10 mililitrów zawiesiny nicieni o stężeniu 400 do 500 zakaźnych larw na mililitr na górny wacik i pozwól zakaźnym larwom zainfekować stonki.Żnij zakaźne larwy z naczyń Petriego, wlewając 20 do 25 mililitrów wody na górny wacik, a następnie zbierasz zawiesinę, która jest filtrowana przez wacik. Aby zainfekować owada-gospodarza w dużych płytkich tackach, wytnij i umieść warstwę wełny w tackach. Następnie rozprowadź gospodarzy Tenebrio molitor między warstwami wełny.Przed dokładnym podlaniem warstw wełny około 400 mililitra zawiesiny nicieni o stężeniu 80 000 do 90 000 nicieni na litr. Inkubuj tackę w 21 do 22 stopniach Celsjusza przez cztery tygodnie. Po czterech tygodniach żnij nicienie, podlewając każdą tackę 500 mililitrów wodą z kranu i następnie zbierając roztwór.Powtórz podlewanie po raz drugi i zebraj łącznie jeden litr zawiesiny nicieni. Na koniec określ gęstość nicieni, licząc liczbę nicieni na mililitr pod mikroskopem sekcującym i sumując wyniki dla każdej powtórzonej tacki. W eksperymencie Steinernema carpocapsae, umieszczenie 30 padlinożerców w żelu poliakryloamidowym w 14,2-litrowych przezroczystych plastikowych pojemnikach produkuje znacznie więcej zakaźnych nicieni larwalnych na padlinożercach w porównaniu do tego w większych białych pułapkach.W eksperymencie Heterorhabditis bacteriophora, znacznie więcej zakaźnych nicieni larwalnych na padlinożercach zostało wyprodukowanych w leczeniu żelu zorientowanym na hodowców w porównaniu z leczeniem w białej pułapce. Metody produkcji nicieni owadobójczych zorientowane na hodowców reprezentują niższy koszt, przystosowanie, zrównoważenie, długowieczność i wyższe plony dla programów kontroli szkodników. Nicienie owadobójcze są odpowiednie dla szerokiej różnorodności systemów upraw.W przeciwieństwie do wcześniejszych metod, nasze podejścia oparte na hodowcach, po ich rozpoczęciu, są w pełni samodzielne. Żel średni można przechowywać przez wiele miesięcy, w chłodni, do późniejszego użycia, co sprawia, że jest to opłacalne. Badania te zapewniają jasną ścieżkę dla rolników i interesariuszy do propagacji nicieni owadobójczych na małych obszarach bez większych

grower-based-in-vivo-propagation-of-entomopathogenic-nematodes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano dwie odrębne metody przesiewania roślin pod kątem infekcji nicielami okrągłymi (nematodami) tworzącymi narośla korzeniowe. Opisane podejścia obejmują wysokoprzepustowe badania z użyciem nematod w sposób niedestrukcyjny, co ułatwia wykorzystanie tych roślin w programach hodowlanych.

Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół demonstruje dwie metody inokulacji w celu wprowadzenia entomopatogenu grzyba Beauveria bassiana jako endofitu do fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris), w ramach przygotowań do kolejnych ocen endofitycznej kontroli biologicznej.

Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Poznaj metody masowej hodowli nicieni entomopatogenicznych Steinernema carpocapsae i Heterorhabditis bacteriophora przy użyciu żelu poliakrylamidowego oraz larw Tenebrio molitor. Te proste systemy umożliwiają rolnikom samodzielną produkcję biologicznych środków owadobójczych.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Przeglądaj więcej filmów