Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Moje badania koncentrują się na jednoczesnym pomiarze wtórnej hemostazy i fibrynozy, aby zmierzyć ogólną równowagę hemostatyczną. Większość obecnych badań ocenia izolowane składniki krzepnięcia lub fibrynolizy. Ten test mierzy oba procesy jednocześnie w jednym testie.

Na początek włącz czytnik płyty fluorescencyjnej i pozwól mu wyrównać temperaturę do 37 stopni Celsjusza. Konfiguruj ustawienia filtra w programie, ustawiając liczbę par długości fal na dwie. Ustaw długość fali wzbudzenia na 355 nanometrów dla trombiny i 485 nanometrów dla plazminy.

Następnie ustaw długość fali emisji na 460 nanometrów dla trombiny i 525 nanometrów dla plazminy. Następnie ustaw typ płyty na mikropłytkę Flat Bottom Black o pojemności 96 dołków Greiner. Przejdź do obszaru odczytu i zdefiniuj układ płyt, używając maksymalnie 20 wgłębień na płytę.

Konfiguruj ustawienia PMT i optyki, ustawiając wzmocnienie PMT na 200 woltów oraz liczbę błysków na odczyt na sześć. Następnie przejdź do Timing, aby potwierdzić ustawienia czasowe z całkowitym czasem trwania jednej godziny, dziewięć minut i 30 sekund, czyli interwałem 30 sekund. Przejdź do Shake, aby potwierdzić drżenie trzy sekundy przed pierwszym odczytem.

Przejdź do Więcej Ustawień, aby upewnić się, że kolejność odczytu jest ustawiona na Kolumnę. Konfiguruj ustawienia transferu związków przed odczytem, ustawiając liczbę transferów związków na jeden i objętość początkową na 120 mikrolitrów. Sprawdź, czy wysokość pipety wynosi 130 mikrolitrów, objętość 20 mikrolitrów, szybkość jednego mikrolitra na sekundę, a punkt czasu 14 sekund.

W sekcji Compound Source potwierdź format płyty złożonej 96 well i wybierz opcję Beckman 96 2,3 mililitra. Potwierdź ustawienia układu Pipette Tipte, wybierając odpowiednie kolumny. Teraz przejdź do kolumn Compound Tips i wybierz właściwe kolumny.

Ustaw temperaturę mikropłyty na 37 stopni Celsjusza i sprawdź temperaturę przed użyciem. Następnie ustaw intensywność drgań na 1 100 obrotów na minutę. Następnie rozmroz osocze pacjenta i prawidłowe osadzanie w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 10 minut.

Dokładnie wymieszaj próbki plazmy i potwierdz całkowite rozmrażenie bez widocznego krioprepitu. Za pomocą pipety dodaj 80 mikrolitrów osocza pacjenta lub normalnej zgromadzonej plazmy do wybranych dołków, używając świeżej końcówki pipety do każdej próbki. Następnie przygotuj mieszankę podłoża, mieszając 48 mikrolitrów cefaliny z 48 mikrolitrami czynnika tkankowego.

Do tego dodaj 240 mikrolitrów buforu chlorku trisodu, następnie pipetę 96 mikrolitrów substratu trombinowego oraz 48 mikrolitrów substratu plazminowego. Pipetą wylej 20 mikrolitrów mieszanki podłoża do każdego dołka. Potrząśnij potem.

Następnie włóż mikropłytkę do czytnika płyty fluorescencyjnej i pozwól jej wyrównać temperaturę 37 stopni Celsjusza przez kilka minut. Połącz bufor chlorku trisodu, chlorek trisodu, bufor chlorku wapnia oraz aktywator plazminogenu tkankowego, aby przygotować odczynnik startowy. Dokładnie przeprowadź wir, żeby wymieszać.

Pipetować mieszaninę odczynników startowych we wszystkich rzędach kolumny związku. Włóż płytkę zawierającą mieszaninę odczynników startowych do szuflady źródłowej i rozpocznij pomiar fluorescencji. Nagrywaj sygnały fluorescencyjne co 30 sekund przez 70 minut.

Utrzymuj płytkę na 37 stopniach Celsjusza przez cały pomiar. Do analizy danych eksportuj dane fluorescencji kinetycznej jako tabelę zawierającą punkty czasowe i wartości fluorescencji na dołek. Oblicz pierwszą pochodną i narysuj krzywe generowania enzymów dla każdego dołka, aby zwizualizować generowanie trombiny lub plazmy w czasie.

Test hemostazowy umożliwił jednoczesne, czasowo rozdzielone pomiary generacji trombiny i plazmy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Z krzywej generowania trombin można wyprowadzić kilka parametrów, w tym czas opóźnienia, wysokość szczytu oraz potencjał trombinowy. Dłuższe opóźnienia, niższe szczyty i zmniejszone potencjały trombinowe wskazują na upośledzoną produkcję trombin.

Krzywa generowania plazminy dostarcza również wielu parametrów, w tym czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. Krótsze czasy lizy fibryny i wyższe szczyty odzwierciedlają zwiększone generowanie osocza. Krzywe generowania trombiny i osocza z trzech zdrowych kontrolnych oraz prawidłowo połączonego osocza wykazały powtarzalny czas zakończenia szczytowej wysokości, służąc jako profile referencyjne dla prawidłowej funkcji hemostatycznej.

U pacjenta z aktywnością czynnika V na poziomie 3% generacja trombiny była całkowicie nieobecna. Jednak produkcja plazmy wzrosła nieznacznie. Pacjent z aktywnością czynnika V na poziomie 44% wykazał zmniejszoną produkcję trombiny z wydłużonym opóźnieniem i obniżoną maksymalną wysokość, podczas gdy produkcja osocza pozostawała w normie.

W przypadku niedoboru Alfa-2-antyplazminy produkcja osocza wzrastała wraz ze spadkiem aktywności Alfa-2-antyplazminy. Pacjent homozygotyczny z aktywnością 23% wykazał wczesne poczęcie generacji plazmy, krótszy czas lizy fibryny oraz wyższy szczyt plazmy. Zmiany te zaobserwowano również u pacjenta heterozygotycznego z aktywnością 73%, choć nie były tak wyraźne.

Test hemostazowy jest dobrze przystosowany do badań nad rzadkimi niedoborami czynników krzepnięcia, zaburzeniami fibrinolitycznymi oraz efektami hemostatycznych leków. Główne wyzwania to standaryzacja techniki oraz normalizacja wyników w celu poprawy porównywalności między salami i laboratoriami. Przyszłe badania mogą koncentrować się na automatyzacji testu i opracowywaniu adaptacji kompatybilnych z osoczem pełnym lub bogatym w płyty krwi.