Name: Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj test hemostazy Nijmegen umożliwiający jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni mikropłytkowej. Ta metoda dostarcza kompleksowej oceny równowagi hemostatycznej w osoczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z celami EuroBloodNet.

Wszystkie procedury z udziałem próbek osocza z ludzi były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez komisję etyki medycznej Arnhem-Nijmegen. Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich dawców.
1. Przygotowanie buforów, odczynników i próbek plazmy
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory buforowe<ol>
		<li>Waż 1,2 g Tris (p.a.) i rozpuszczaj w 180 mL 0,9% NaCl.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl.</li>
		<li>Zwiększ końcową objętość do 200 mL z 0,9% NaCl, aby uzyskać 50 mM bufora Tris-150 mM NaCl (TBS).</li>
		<li>Zrób TBS w dwóch probówkach po 50 mL.</li>
		<li>Wykorzystaj pozostałe 100 ml TBS do przygotowania buforu zawierającego wapń. Rozpuścić 7,34 g CaCl2,2H 2O w 100 mL TBS, aby uzyskać bufor Tris-NaCl-CaCl2 (TBS-Ca, pH 7,4).</li>
		<li>Zrób TBS-Ca w dwóch probówkach po 50 mL.</li>
		<li>Przechowuj oba środki w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj podłoża fluorogenne<ol>
		<li>Rozpuszcz 53,2 mg substratu trombinowego (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) w 4 mL buforu Tris-NaCl. UWAGA: Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 μL dodanego ludzkiego trombinu w odczynniku 120 μL dawało końcowe stężenie 76 nmol/L.</li>
		<li>Zawieraj 100 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.</li>
		<li>Rozmroź aliquot fluorogenicznego substratu specyficznego dla trombiny przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wiruj i trzymaj się na lodzie podczas eksperymentu.</li>
		<li>Rozpuścić zawartość jednej fiolki substratu plazminy (CBZ-L-Phe-Arg-rodamina) w 1 955 μL DMSO. UWAGA: Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 μL dodanej plazminy ludzkiej w odczynniku 120 μL dawało końcowe stężenie 200 nmol/L.</li>
		<li>Zawieraj 60 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.</li>
		<li>Rozmroz aliquot plazmin-specyficznego podłoża fluorogenicznego przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wiruj i utrzymuj w temperaturze pokojowej podczas eksperymentu. UWAGA: Podłoże to rozpuszcza się w dimetylosulfoklenku (DMSO) i nie może być chłodzone, aby uniknąć wytrącenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj odczynniki wyzwalające<ol>
		<li>Zrekonstytuować liofilizowaną cefalinę, dodając 1 mL wody destylowanej. Wiruj dokładnie, aż całkowicie się rozpuści. UWAGA: Cefalina jest rekonstytuowana w celu dostarczenia fosfolipidów, które są niezbędne do katalizowania wielu reakcji krzepnięcia, umożliwiając fizjologicznie istotne krzepnięcie w teście.</li>
		<li>Zachowaj 60 μL w rurkach Eppendorfa (wystarczające na 20 otworów) i przechowywać w temperaturze −20 °C.</li>
		<li>Rozmroź aliquot przed użyciem i trzymaj na lodzie. Krótko zawiruj przed pipetowaniem.</li>
		<li>Rekonfunduj zawartość jednej fiolki z rekombinowanym czynnikiem tkankowym (TF) w 4 mL wody destylowanej.</li>
		<li>Zawieraj 60 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.</li>
		<li>Rozmroz aliquot TF i wir na krótko.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenie TF w czasie 1:500 przez sekwencyjne rozcieńczenie:<ol>
			<li>Dodaj 6 μL TF do 54 μL bufora TBS. Vortex.</li>
			<li>Weź 6 μL tego rozcieńczenia i dodaj do 54 μL TBS. Wir.</li>
			<li>Weź 20 μL tego drugiego rozcieńczenia i dodaj do 80 μL TBS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,28 pM. Vortex.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rekonstytuuj zawartość jednej fiolki (20 mg) aktywatora plazminogenu tkankowego (tPA) w 20 mL wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 580 000 IU/mL (weryfikuj stężenie specyficzne dla partii).</li>
		<li>Zachowaj 50 μL w rurkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze −80 °C.</li>
		<li>Rozmroz aliquot tPA i na krótko zawij wir.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenie tPA w stosunku 1:50 przez dodanie 20 μL tPA do 980 μL buforu Tris-NaCl, osiągając końcowe stężenie 11 600 IU/mL. Vortex.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbki plazmy<ol>
		<li>Pobierz krew żylną do rurek o pojemności cytrynianu 3 mL zawierających cytrynian 3,2%, zapewniając pobranie co najmniej 2,7 mL (90% wypełnienia).</li>
		<li>Nie używaj pierwszej rurki po nakłuciu żył; Usuń ją, aby uniknąć aktywacji przez czynnik tkankowy.</li>
		<li>Odwróć rurkę co najmniej 10 razy zaraz po pobraniu.</li>
		<li>Wirówka w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, najpierw 2 500 × g przez 5 minut, następnie 10 000 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Użyj jednorazowej pipety, aby zebrać plazmę tuż powyżej warstwy komórki.</li>
		<li>Aliquot plazmę przekształca w oznakowane krioviale, zamraża na bieżąco w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze −80 °C. UWAGA: Upewnij się, że próbka nie zawiera zakrzepów. Używaj tylko świeżej lub raz rozmrożonej plazmy. Jedna rurka CTAD wystarcza do analizy duplikatów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie instrumentów i konfiguracja oprogramowania
<ol>
	<li>Przygotuj czytnik płyty fluorescencyjnej<ol>
		<li>Włącz czytnik tablic i pozwól mu wyrównać temperaturę do 37 °C.</li>
		<li>Ustaw następujące podstawowe parametry:<ol>
			<li>Greiner 96-well, płaskie dno,.</li>
			<li>Ustawienia ogólne: Opóźnienie pozycjonowania: 0,1 s; Liczba okien kinetycznych: 1.</li>
			<li>Okno kinetyczne: Liczba cykli: 140; Czas rozpoczęcia pomiaru: 0,0 s; Liczba błysków na studnię na cykl: 10; Czas cyklu: 30 s.</li>
			<li>Optyka: Górna optyka</li>
			<li>Ustawienia filtra: Liczba monochromatyków: 2. Filtr wzbudzenia: 355 nm dla trombiny; 485 nm dla plazminy. Filtr emisyjny: 460 nm dla trombiny, 520 nm dla plazminy. Zysk: 600.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zdefiniuj układ z maksymalnie 20 otworami na płytę.</li>
		<li>Przejdź do Stężenia/Objętości/Wstrząsanie i potwierdź następujące ustawienia. Pompa 1 = 20 μL; Pompa 2 = 0 μL; Prędkość = 420 μL/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj system wtryskowy<ol>
		<li>Wyjmij i przepłucz igły do wstrzykiwania w pojemniku z buforem.</li>
		<li>Ustaw objętość płukania na 2 500 μL i płucz pompy buforem Tris/NaCl o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zresetuj objętość płukania do 500 μL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienie testu w formacie mikropłyty
<ol>
	<li>Układ mikropłyt wstrząsaczowych<ol>
		<li>Ustaw mikropłytę na 37 °C i sprawdź temperaturę przed użyciem.</li>
		<li>Ustaw intensywność drgań na 1100 obr./min.</li>
		<li>Używaj tego shakera do wszystkich etapów mieszania testu, aby zapewnić jednorodny rozkład odczynników i stałą aktywność enzymatyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj odczynniki do studni<ol>
		<li>Rozmrażaj osocze pacjenta i prawidłowe osoczenie zgromadzone (NPP) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez maksymalnie 10 minut.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj i sprawdź całkowite rozmrażenie (bez krioprecypitacji).</li>
		<li>Dodaj 80 μL osocza pacjenta lub NPP do wybranych studni. Do każdej próbki używaj świeżej końcówki pipety. UWAGA: Uwzględnij próbkę NPP w każdym przebiegu testowym, aby uwzględnić zmienność między przebiegami (patrz dalej w kroku 5.6).</li>
		<li>Dodaj 2 μL cefaliny.</li>
		<li>Dodaj 2 μL czynnika tkankowego (rozcieńczenie 1:500). Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.</li>
		<li>Dodaj 10 μL bufora Tris-NaCl. Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.</li>
		<li>Dodaj 4 μL substratu trombinowego.</li>
		<li>Dodaj 2 μL substratu plazmowego. Krótko wymieszaj za pomocą shakera do talerzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przedinkubacja<ol>
		<li>Włóż mikropłytkę do czytnika płyt.</li>
		<li>Pozwól płytce wyrównać się w temperaturze 37 °C przez kilka minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie i wstrzyknięcie odczynnika startowego
<ol>
	<li>Przygotuj odczynnik do pompy 1<ol>
		<li>Połącz 672 μL bufora Tris/NaCl, 192 μL bufora Tris/NaCl/CaCl₂ oraz 96 μL tPA (od kroku 1.2.5). Dokładnie przeszukaj wir.</li>
		<li>Przebij dwa otwory w koreku rurki odczynnikowej.</li>
		<li>Włóż rurkę pompy przez jeden otwór na dno rury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podstaw i rozpocznij badanie<ol>
		<li>Użyj oprogramowania, aby zapełnić pompę 500 μL odczynnikiem.</li>
		<li>Ponownie włóż igły do wstrzykiwania na wyznaczone miejsca.</li>
		<li>Natychmiast rozpocznij pomiar fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręczne rozpoczęcie testu UWAGA: Ta ręczna procedura inicjacji stanowi alternatywę dla zautomatyzowanego workflow iniekcji opisanego w krokach 2.2, 4.1 i 4.2.<ol>
		<li>Przygotuj odczynnik startowy zgodnie z informacją o 4.1.1 tuż przed użyciem.</li>
		<li>Usuń mikropłytkę z czytnika płyt i szybko dodaj 20 μL odczynnika startowego ręcznie do każdego dołka, używając skalibrowanej lub wielokanałowej pipety dla szybszego obsługi.</li>
		<li>Natychmiast zwróć płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar fluorescencji bez zwłoki. UWAGA: Zminimalizuj czas między dodaniem odczynnika a rozpoczęciem pomiaru (<10 s na rząd), aby zmniejszyć zmienność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt kinetyczny<ol>
		<li>Rejestruj fluorescencję co 30 sekund przez 70 minut.</li>
		<li>Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 °C podczas pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Przygotuj dane do analizy<ol>
		<li>Eksportuj dane fluorescencji kinetycznej z czytnika płyt jako tabelę z punktami czasu i wartościami fluorescencji na studnię.</li>
		<li>Przekształc surowe dane fluorescencyjne na krzywe generujące enzymy, obliczając pierwszą pochodną za pomocą Excela lub innego programu.</li>
		<li>Narysuj krzywe generowania enzymów dla każdego dołka, aby zobrazować reakcję enzymatyczną. UWAGA: Te krzywe reprezentują tempo generowania trombiny lub plazminy w czasie i odpowiadają graficznym wynikom przedstawionym na rysunkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj krzywe generowania trombin<ol>
		<li>Zidentyfikuj następujące parametry z krzywej generowania trombin (patrz Rysunek 1):<ol>
			<li>Czas opóźnienia: Punkt czasowy, w którym krzywa generacji trombiny rośnie równomiernie i osiąga 8% szczytowej wysokości trombiny.</li>
			<li>Szczytowa wysokość trombiny: Maksymalna wartość sygnału na osi y (czyli maksymalna szybkość generowania trombiny).</li>
			<li>Czas szczytu trombiny: Czas od rozpoczęcia testu do szczytu trombiny.</li>
			<li>Potencjał trombinowy (powierzchnia pod krzywą generowania trombiny): Obszar pod krzywą od czasu opóźnienia do powrotu sygnału trombinowego do poziomu wyjściowego. UWAGA: Potencjał trombinowy odzwierciedla całkowitą zdolność próbki generującej trombinę w warunkach testowych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj krzywe generowania plazminy<ol>
		<li>Zidentyfikuj następujące parametry z krzywej generowania plazminy (patrz Rysunek 2):<ol>
			<li>Czas lizy fibryny: Czas od rozpoczęcia generacji plazminy (czyli punktu, w którym krzywa generowania plazminy rośnie równomiernie i osiąga 8% wysokości szczytu plazminy) do momentu, w którym osiąga się szczyt plazminy.</li>
			<li>Wysokość szczytu plazminy: Pierwszy wyraźny maksimum na krzywej, odpowiadający początkowemu wybuchu generacji plazmy, jest wyznaczane w momencie, gdy druga pochodna krzywej generacji plazminy (oparta na trzyminutowej średniej kroczącej) osiąga zero po rozpoczęciu generacji plazminy.</li>
			<li>Potencjał plazminy (powierzchnia pod krzywą generowania plazminy): Obszar pod krzywą od początku generacji plazminy do momentu szczytu plazminy. UWAGA: Fluktuacje sygnału występują po początkowym szczycie plazminy i nie są uwzględniane w analizie parametrów generowania plazmy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja parametrów ręcznie lub za pomocą niestandardowego oprogramowania<ol>
		<li>Użyj Microsoft Excela, GraphPad Prism lub niestandardowego skryptu (np. w Pythonie lub R) do wyodrębniania parametrów kinetycznych.</li>
		<li>Zachowaj surowe dane, wykresy krzywe i obliczone parametry w uporządkowanym formacie do archiwizacji i przyszłego wykorzystania. UWAGA: Jeśli używasz makr, sprawdź poprawność wszystkich parametrów wizualnie i ręcznie, zanim będziesz polegać na automatycznym wyjściu. Nasze makro do konwersji danych jest dostępne na żądanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standaryzacja i normalizacja<ol>
		<li>Ustalić odniesienie fizjologiczne, mierząc 40 indywidualnych próbek od zdrowych dawców równolegle z próbką NPP używaną do normalizacji. Wykonaj ten krok raz na każdą partię elektrowni jądrowej.</li>
		<li>Oblicz średnie wartości parametrów generowania trombiny i plazminy zdrowych dawców oraz określ ich stosunek do odpowiadających wartości NPP uzyskanych w tym samym przebiegu.</li>
		<li>Dla każdej próbki pacjenta w danym cyklu najpierw normalizuj parametr generowania trombiny lub plazminy do wartości NPP zmierzonej w tym samym cyklu.</li>
		<li>Podziel ten wynik przez zdrowy stosunek dawców do NPP wcześniej ustalony dla tej samej partii NPP (patrz krok 5.6.2). Daje to wartość względną znormalizowaną do przeciętnej zdrowej osoby, ze standaryzacją zmienności między biegami przy użyciu NPP.</li>
		<li>Wartości parametrów wyrażamy w procentach względem średniej wartości zdrowych osobników (zdefiniowanej jako 100%). Przedstawiaj wyniki próbek pacjentom odpowiednio. UWAGA: Względne wartości parametrów dla każdej pojedynczej próbki pacjenta oblicza się według następującego wzoru: run a oznacza cykl pomiarowy próbki pacjenta, a run b to run referencyjny, w którym próbki zdrowego dawcy były mierzone równolegle z tą samą partią NPP. Nasz plik Excel zawierający obliczenia normalizacji danych jest dostępny na żądanie. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/69701/69701eq1.jpg" style="margin: auto;" /></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Generowanie krzywych kalibracyjnych
<ol>
	<li>Przygotuj krzywą kalibracyjną trombiny<ol>
		<li>Odtworzenie liofilizowanej ludzkiej α-trombiny zgodnie z instrukcjami w układzie katalogowym producenta. UWAGA: Na przykład, jeśli karta katalogowa określa rekonstrukcję w wodzie o pojemności 100 μL, aby uzyskać 3,34 mg/mL, odpowiada to 0,334 mg w 100 μL.</li>
		<li>Rozcieńcz zrekonstytuowany trombin 1:10 w buforze Tris/NaCl. UWAGA: Daje to stężenie stockowe około 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), na podstawie masy cząsteczkowej 36 700 g/mol.</li>
		<li>Przygotuj serię rozcieńczeń w buforze Tris/NaCl, aby uzyskać końcowe stężenia trombiny w badaniu w zakresie od 0 do 152 nmol/L.</li>
		<li>Pipeta włóż trombinę do wybranych studni już zawierających bufor, osiągając całkowitą objętość 100 μL na odwiert.</li>
		<li>Przygotuj roztwór podłoża dla pompy 1, mieszając 300 μL bufora Tris/NaCl z 200 μL substratu trombinowego od etapu 1.2.2.</li>
		<li>Dalej rozcieńcz ten roztwór, łącząc 400 μL mieszaniny z 360 μL buforu Tris/NaCl.</li>
		<li>Dodaj 20 μL tej mieszanki do każdego dołka kalibracyjnego, co daje całkowitą objętość testu 120 μL.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj płytkę i włóż ją do czytnika płyt. Prowadź test kinetyczny przez 25 cykli, stosując te same ustawienia fluorescencji opisane w sekcji 2.</li>
		<li>Eksportuj surowe dane fluorescencji i określaj początkowy nachylenie (tempo wzrostu fluorescencji na cykl) dla każdego stężenia trombiny za pomocą GraphPad Prism lub odpowiedniego oprogramowania.</li>
		<li>Generuj standardową krzywą, rysując początkowe nachylenie względem stężenia trombiny. UWAGA: Upewnij się, że wszystkie bufory są wstępnie podgrzane do 37 °C i obsługują enzymy na lodzie. Zawsze przygotowuj świeże rozcieńczenia i dokładnie wymieszaj. Powstała krzywa standardowa służy do obliczenia względnej aktywności trombiny w nieznanych próbkach za pomocą makro opisanego w sekcji 5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie krzywej kalibracji plazmy<ol>
		<li>Rekonstytuacja plazminy liofilizowanej w wodzie destylowanej (np. 0,543 mL) zgodnie z instrukcjami producenta. UWAGA: Plazmina ma masę cząsteczkową 75 400 g/mol. Uzyskane stężenie zapasowe wynosi około 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), zakładając 1 mg w 0,543 mL.</li>
		<li>Przygotuj serię rozcieńczeń w buforze Tris/NaCl, aby uzyskać końcowe stężenia plazminy w teście w zakresie od 66 do 532 nmol/L.</li>
		<li>Plazminę pipetę wprowadzać do studni zawierających bufor Tris/NaCl, aby osiągnąć końcową objętość 100 μL na odwiert.</li>
		<li>Przygotuj roztwór podłoża dla pompy 1, mieszając 680 μL buforu Tris/NaCl z 80 μL podłoża plazmin/rodaminy (wstępnie rozcieńczonego 1:1, jeśli jest potrzebne) od etapu 1.2.5.</li>
		<li>Dodaj 20 μL tego roztworu substratowego do każdej studni kalibracyjnej, co daje całkowitą objętość 120 μL.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj płytkę i włóż ją do czytnika płyt. Prowadź test kinetyczny przez 25 cykli, używając tych samych ustawień fluorescencji, co opisane w Sekcji 2.</li>
		<li>Eksportuj surowe dane fluorescencji i określaj początkowy nachylenie wzrostu fluorescencji dla każdego stężenia plazmy, stosując regresję liniową do fazy liniowej krzywej kinetycznej za pomocą oprogramowania GraphPad Prism lub równoważnego.</li>
		<li>Generuj standardową krzywą, rysując początkowy nachylenie względem stężenia plazminy. UWAGA: Ze względu na różnice aktywności plazminy w poszczególnych partiach, kalibracja powinna być powtarzana przy każdej nowej partii. Jeśli zaobserwuje się niespodziewanie wysoką aktywność, zaleca się rozcieńczenie zapasu w stosunku 1:2 przed przygotowaniem serii kalibracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj krzywej kalibracyjnej do kwantyfikacji<ol>
		<li>Wykorzystaj krzywe kalibracyjne wygenerowane w Sekcji 6, aby przekształcić wartości nachylenia fluorescencji na względną aktywność enzymów.</li>
		<li>Do interpolacji nieznanych próbek używaj wyłącznie liniowej części krzywej kalibracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chapin, J. C., Hajjar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolysis+and+the+control+of+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibrinolysis and the control of blood coagulation.</a> Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).</li>
<li>Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of thrombosis.</a> Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).</li>
<li>Teruya, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+normal+aPTT+does+not+guarantee+adequate+coagulation+factor+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">A normal aPTT does not guarantee adequate coagulation factor levels.</a> Anesthesiology. 94 (3), 542(2001).</li>
<li>Puetz, J., Hugge, C., Moser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+aPTT+in+children+with+mild+factor+XI+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Normal aPTT in children with mild factor XI deficiency.</a> Pediatr Blood Cancer. 65 (4), pbc.26910(2018).</li>
<li>Toulon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+sensitivity+of+different+activated+partial+thromboplastin+time+reagents+to+mild+clotting+factor+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro sensitivity of different activated partial thromboplastin time reagents to mild clotting factor deficiencies.</a> Int J Lab Hematol. 38 (4), 389-396 (2016).</li>
<li>Massignon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothrombin+time+sensitivity+and+specificity+to+mild+clotting+factor+deficiencies+of+the+extrinsic+pathway%3Aevaluation+of+eight+commercial+thromboplastins%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Prothrombin time sensitivity and specificity to mild clotting factor deficiencies of the extrinsic pathway:evaluation of eight commercial thromboplastins.</a> Thromb Haemost. 75 (4), 590-594 (1996).</li>
<li>Burns, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxic+effect+of+multiple+mild+coagulation+factor+deficiencies+on+the+prothrombin+time+and+activated+partial+thromboplastin+time%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paradoxic effect of multiple mild coagulation factor deficiencies on the prothrombin time and activated partial thromboplastin time.</a> Am J Clin Pathol. 100 (2), 94-98 (1993).</li>
<li>van Geffen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+hemostasis+assay+for+the+simultaneous+measurement+of+coagulation+and+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">A novel hemostasis assay for the simultaneous measurement of coagulation and fibrinolysis.</a> Hematology. 16 (6), 327-336 (2011).</li>
<li>van Geffen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacodynamics+of+recombinant+activated+factor+VII+and+plasma-derived+factor+VII+in+a+cohort+of+severe+FVII+deficient+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacodynamics of recombinant activated factor VII and plasma-derived factor VII in a cohort of severe FVII deficient patients.</a> Thromb Res. 132 (1), 116-122 (2013).</li>
<li>Hemker, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calibrated+automated+thrombogram+%28CAT%29%3Aa+universal+routine+test+for+hyper-+and+hypocoagulability%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiol+Haemost+Thromb%22%5BJournal%5D)">The calibrated automated thrombogram (CAT):a universal routine test for hyper- and hypocoagulability.</a> Pathophysiol Haemost Thromb. 32 (5-6), 249-253 (2002).</li>
<li>Kristensen, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+measured+on+ST+Genesia%2C+a+new+platform+in+the+coagulation+routine+lab%3Aassessment+of+analytical+and+between-subject+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation measured on ST Genesia, a new platform in the coagulation routine lab:assessment of analytical and between-subject variation.</a> Res Pract Thromb Haemost. 6 (1), e12654(2022).</li>
<li>Hemker, H. C., Béguin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+the+clotting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Phenotyping the clotting system.</a> Thromb Haemost. 84 (5), 747-751 (2000).</li>
<li>Tripodi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+assay+and+its+application+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation assay and its application in the clinical laboratory.</a> Clin Chem. 62 (5), 699-707 (2016).</li>
<li>Valke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolytic+assays+in+bleeding+of+unknown+cause%3Aimprovement+in+diagnostic+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrinolytic assays in bleeding of unknown cause:improvement in diagnostic yield.</a> Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12681(2022).</li>
<li>van Geffen, M., van Heerde, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+haemostasis+assays%2C+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Global haemostasis assays, from bench to bedside.</a> Thromb Res. 129 (6), 681-687 (2012).</li>
<li>Luddington, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombelastography%2Fthromboelastometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Thrombelastography/thromboelastometry.</a> Clin Lab Haematol. 27 (2), 81-90 (2005).</li>
<li>Hartmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+testing%3Aan+illustrated+review+of+technology+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic testing:an illustrated review of technology and clinical applications.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (1), 100031(2023).</li>
<li>Schoeman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+and+microfluidic+approaches+for+measuring+thrombus+formation+in+genetic+bleeding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Flow chamber and microfluidic approaches for measuring thrombus formation in genetic bleeding disorders.</a> Platelets. 28 (5), 463-471 (2017).</li>
<li>Bavinck, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+testing+in+patients+with+very+rare+bleeding+disorders+of+secondary+hemostasis%3Aa+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic testing in patients with very rare bleeding disorders of secondary hemostasis:a scoping review.</a> Thromb Res. 2025, 109449(2025).</li>
<li>Mansouritorghabeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+total+thrombus-formation+analysis+system+%28T-TAS%29+in+the+thrombosis+and+hemostasis+field%3Aa+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">The utility of total thrombus-formation analysis system (T-TAS) in the thrombosis and hemostasis field:a scoping review.</a> Int J Lab Hematol. 47 (2), 201-211 (2025).</li>
<li>Lecchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-chamber+device+%28T-TAS%29+to+diagnose+patients+suspected+of+platelet+function+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Transfus%22%5BJournal%5D)">Flow-chamber device (T-TAS) to diagnose patients suspected of platelet function defects.</a> Blood Transfus. 22 (1), 55-64 (2024).</li>
<li>Zekavat, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+thrombin+generation+assay+with+conventional+coagulation+tests+in+evaluation+of+bleeding+risk+in+patients+with+rare+bleeding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Appl+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Comparison of thrombin generation assay with conventional coagulation tests in evaluation of bleeding risk in patients with rare bleeding disorders.</a> Clin Appl Thromb Hemost. 20 (6), 637-644 (2014).</li>
<li>Brummel-Ziedins, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+bleeding+in+haemophilia+A%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and bleeding in haemophilia A.</a> Haemophilia. 15 (5), 1118-1125 (2009).</li>
<li>Al Dieri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%3Awhat+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation:what have we learned.</a> Blood Rev. 26 (5), 197-203 (2012).</li>
<li>Binder, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+thrombin+generation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Clinical use of thrombin generation assays.</a> J Thromb Haemost. 19 (12), 2918-2929 (2021).</li>
<li>Verhagen, M. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+patients+with+hemophilia%2C+a+decreased+thrombin+generation+profile+is+associated+with+a+severe+bleeding+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In patients with hemophilia, a decreased thrombin generation profile is associated with a severe bleeding phenotype.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100062(2023).</li>
<li>Haisma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+thrombin+and+plasmin+generation+profiles+in+alpha-2-antiplasmin-deficient+patients%3Adata+from+the+Rare+Bleeding+Disorders+in+the+Netherlands+study%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Enhanced thrombin and plasmin generation profiles in alpha-2-antiplasmin-deficient patients:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study.</a> Res Pract Thromb Haemost. 8 (7), 102604(2024).</li>
<li>Haisma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+thrombin+generation+platforms+for+patients+with+coagulation+factor+deficiencies%3Aa+comprehensive+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of thrombin generation platforms for patients with coagulation factor deficiencies:a comprehensive assessment.</a> Thromb Res. 240, 109045(2024).</li>
<li>van Geffen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+evaluation+of+bleeding+tendency+and+simultaneous+thrombin+and+plasmin+generation+in+patients+with+rare+bleeding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia%22%5BJournal%5D)">Retrospective evaluation of bleeding tendency and simultaneous thrombin and plasmin generation in patients with rare bleeding disorders.</a> Haemophilia. 18 (4), 630-638 (2012).</li>
<li>Haisma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genotype%2C+and+laboratory+assessment+of+congenital+fibrinogen+disorders%3Adata+from+the+Rare+Bleeding+Disorders+in+the+Netherlands+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">genotype, and laboratory assessment of congenital fibrinogen disorders:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study.</a> Thromb Res. 249, 109317(2025).</li>
<li>Bouma, B. N., Meijers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-activatable+fibrinolysis+inhibitor+%28TAFI%2C+plasma+procarboxypeptidase+B%2C+procarboxypeptidase+R%2C+procarboxypeptidase+U%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U).</a> J Thromb Haemost. 1 (7), 1566-1574 (2003).</li>
<li>Marx, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-activatable+fibrinolysis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor.</a> Curr Med Chem. 11 (17), 2335-2348 (2004).</li>
<li>Rijken, D. C., Lijnen, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+molecular+mechanisms+of+the+fibrinolytic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system.</a> J Thromb Haemost. 7 (1), 4-13 (2009).</li>
<li>Depasse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+assays+are+versatile+tools+in+blood+coagulation+analysis%3Aa+review+of+technical+features%2C+and+applications+from+research+to+laboratory+routine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation assays are versatile tools in blood coagulation analysis:a review of technical features, and applications from research to laboratory routine.</a> J Thromb Haemost. 19 (12), 2907-2916 (2021).</li>
<li>Subcommittee on Control of Anticoagulation of the SSC of the ISTH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+recommendation+for+the+standardization+of+the+measurement+of+platelet-dependent+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Towards a recommendation for the standardization of the measurement of platelet-dependent thrombin generation.</a> J Thromb Haemost. 9 (9), 1859-1861 (2011).</li>
<li>Duarte, R. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+evaluation+of+the+performance+of+the+thrombin+generation+test+under+hypo-+and+hypercoagulability+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Transfus+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Standardization and evaluation of the performance of the thrombin generation test under hypo- and hypercoagulability conditions.</a> Hematol Transfus Cell Ther. 41 (3), 244-252 (2019).</li>
<li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+standardization+and+normalization+on+imprecision+of+calibrated+automated+thrombography%3Aan+international+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated automated thrombography:an international multicentre study.</a> Br J Haematol. 139 (2), 303-309 (2007).</li>
<li>Ninivaggi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+measurement+of+thrombin+generation%3Acommunication+from+the+ISTH+SSC+Subcommittee+on+Lupus+Anticoagulant%2FAntiphospholipid+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the measurement of thrombin generation:communication from the ISTH SSC Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibodies.</a> J Thromb Haemost. 19 (5), 1372-1378 (2021).</li>
<li>Duchemin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+coagulation+factors+and+tissue+factor+concentration+on+the+thrombin+generation+test+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Influence of coagulation factors and tissue factor concentration on the thrombin generation test in plasma.</a> Thromb Haemost. 99 (4), 767-773 (2008).</li>
<li>Miszta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fat+diet+delays+plasmin+generation+in+a+thrombomodulin-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A high-fat diet delays plasmin generation in a thrombomodulin-dependent manner in mice.</a> Blood. 135 (19), 1704-1717 (2020).</li>
</ol>

W.L. van Heerde jest założycielem i pracownikiem Enzyre BV oraz współwłaścicielem Van Heerde Holding BV, która jest udziałowcem Enzyre. Enzyre otrzymało fundusze na badania kontraktowe od Takeda i Novo Nordisk. W.L. van Heerde otrzymał również wsparcie grantowe na podróże od SOBI i CAF-DCF. Pozostali autorzy deklarują brak konkurujących interesów finansowych.

Badanie hemostazy Nijmegen (NHA) to dwuenzymowy test fluorogenny, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazmy w osoczu ubogim w płytki krwi. Dzięki uchwyceniu obu procesów w jednym dołku, metoda umożliwia wysokorozdzielczą analizę kinetyczną wtórnej hemostazy i fibrynolizy. Ten podwójny odczyt oferuje wyraźne przewagi metodologiczne w porównaniu z konwencjonalnymi testami i został z powodzeniem stosowany w badaniach niedoborów czynników koagulacyjnych, schorzeń hiperfibrinolityczn...

Hemostaza jest wynikiem dynamicznej równowagi między krzepnięciem a fibrynozą. Trombina i plazmina są kluczowymi enzymami napędzającymi te procesy: trombina przekształca fibrynogen w fibrynę, natomiast plazmina rozkłada fibrynę, rozpuszczając zakrzepy. Zaburzenie tej równowagi może prowadzić do krwawienia lub epizodów zakrzepowych 1,2. Jednak testy laboratoryjne stosowane do oceny hemostazy w praktyce klinicznej zazwyczaj koncentrują się na pojedynczych etapach krzepnięcia lub fibrynozy, dostarczając ograniczonego wglądu w ogólną równowagę hemostatyczną. U pacjentów z podejrzeniem skłonności do krwawienia rutynowe testy przesiewowe, takie jak czas protrombinowy (PT) oraz aktywowany czas częściowy tromboplastyny (aPTT), są powszechnie stosowane do wykrywania niedoborów czynników krzepnięcia. Jednak te testy mierzą czas do początkowego powstania fibryny i nie rejestrują powstawania trombiny po rozpoczęciu krzepnięcia, gdzie występuje najbardziej fizjologicznie istotna aktywność trombina 1,2,3. W konsekwencji mogą one dawać prawidłowe wyniki u pacjentów z łagodnymi niedoborami czynników krzepnięcia 3,4,5,6,7,8. Aby zidentyfikować te konkretne niedobory, stosuje się testy aktywności koagulacyjnej. Chociaż są one pouczające do diagnozy, te testy oceniają poszczególne białka w izolacji i nie odzwierciedlają ogólnej równowagi hemostatycznej. W związku z tym u pacjentów z łagodnymi niedoborami poziomy czynników często słabo korelują z fenotypem krwawienia 9,10. To komplikuje kliniczną ocenę ryzyka i optymalizację leczenia pacjenta, w tym termin i dawkowanie terapii, a także interwencje w odpowiedzi na zakrzepowe lub ciężkie zdarzenia krwotoczne. Te ograniczenia podkreślają potrzebę testów, które oferują pełniejszy obraz procesu hemostatycznego w czasie i mogą pomóc zniwelować różnicę między wynikami laboratoryjnymi a obrazem klinicznym.
Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) został opracowany, aby zniwelować te ograniczenia poprzez umożliwienie jednoczesnego, czasowo rozdzielonego pomiaru generacji trombiny i plazminy w osoczu ubogim w płytkikrwi 8,9. Wykorzystuje dwa syntetyczne podłoża fluorogeniczne o różnych widmach wzbudzenia i emisji do ilościowego określenia obu enzymów w tej samej mikropłytowej jamie bez reaktywności krzyżowej. Krzywe generowania enzymów pozwalają wyprowadzić ilościowe parametry odzwierciedlające dynamikę wtórnej koagulacji i fibrynolizy, w tym czas opóźnienia, wysokość szczytu trombiny, czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. NHA oferuje kilka przewag w porównaniu z istniejącymi testami generowania trombin, takimi jak Kalibrowany Zautomatyzowany Trombogram (CAT), Ceveron s100 oraz ST Genesia, które dostarczają cennych informacji o dynamice trombin, ale nie oceniają aktywności fibrinolitycznej 10,11,12,13. Testy lizy zakrzepów z kolei wychwytują aspekty fibrynozy, ale nie mają informacji o14. generacji trombiny. Ogranicza to ich przydatność do oceny złożonych interakcji decydujących o ogólnej równowadze hemostatycznej. Podczas gdy niektóre podejścia opracowane laboratoryjnie łączą pomiary generacji trombiny i plazmy, zazwyczaj wymagają one oddzielnych dołków lub testów równoległych, co ogranicza wyrównanie czasowe i przepustowość15. Globalne testy, takie jak tromboelastografia (TEG) i rotacyjna tromboelastometria (ROTEM), dostarczają uzupełniających informacji, rejestrując pierwotną hemostazę, wtórną krzepliwość oraz fibrynolizę16,17. Systemy komór przepływowych stanowią kolejne nowe, a zarazem eksperymentalne podejście do oceny całkowitej hemostazy w warunkach przepływu18. Chociaż te globalne testy oferują szerszy kontekst fizjologiczny, są one zazwyczaj mniej wrażliwe na łagodne zaburzenia krwawienia 19,20,21. Poprzez jednoczesne pomiary generacji trombiny i plazminy w tej samej reakcyjnej wiertnie, NHA łączy czułość konwencjonalnych TGA z zintegrowanym spojrzeniem na globalne testy, umożliwiając bezpośrednią ocenę wtórnej hemostazy, fibrynolizy i ich interakcji.
Testy generowania trombiny już wykazały znaczne obiecujące zastosowania translacyjne, takie jak indywidualne profilowanie ryzyka krwawienia i zakrzepowego oraz monitorowanie terapii 22,23,24,25. W badaniach klinicznych NHA wykazało zmniejszoną produkcję trombiny u pacjentów z hemofilią A, hemofilią B oraz rzadkimi niedoborami czynników krzepnięcia, a także podwyższoną produkcję plazmy w stanach hiperfibrynolitycznych, takich jak niedobór α2-antyplazminy 26,27,28,29 . Różnice w obu szlakach zaobserwowano również u pacjentów z hipofibrynogenemią, zaburzeniem związanym zarówno z krwawieniem, jak i zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. W tej populacji niższe poziomy fibrynogenu korelowały ze zmniejszoną generacją plazmyny, prawdopodobnie z powodu braku miejsc wiążących plazminogen, podczas gdy pacjenci z wywiadem zakrzepicy wykazywali wzrost30. generacji trombiny. Dodatkowo test wykrywa działanie środków terapeutycznych, w tym antykoagulantów, prokoagulantów i antyfibrynolityków8. W poprzednim badaniu zaproponowaliśmy podejście standaryzacyjne i normalizacyjne, aby poprawić powtarzalność i umożliwić porównanie wyników między biegami i laboratoriami, co jest kluczowym krokiem w kierunku wdrożenia klinicznego28. Protokół ten określa pełną procedurę i podejście analityczne NHA do wdrożenia w badaniach klinicznych lub środowiskach translacyjnych.

<table><tbody><tr><td><Mocne>Materiały</wytrzymałe></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorohydrat wapnia (CaCl2,2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.02382</td><td></td></tr><tr><td>Cefalina (zestaw odczynnikowy C.K. Prest 5 APTT)</td><td>Stago</td><td>00847</td><td>Stabilna przez 6 miesięcy przy -20 stopień i stopień C &nbsp;</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td></td><td></td><td>Zarejestruj datę otwarcia. Użyj w ciągu 1 dnia od pierwszego otwarcia.</td></tr><tr><td>Dimetylosiarkowotlenek (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1.02950.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki alfa-trombina</td><td>Laboratoria Badań Enzymów</td><td>HT 1002a</td><td>Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 i mikro; L dodanej ludzkiej trombiny w 120 i mikro; Odczynnik L daje końcowe stężenie 76 nmol/L.</td></tr><tr><td>Plazma ludzka</td><td>Laboratoria Badań Enzymów</td><td>HPlas</td><td>Pudełko zawiera ulotkę z certyfikatem analizy. Objętość buforu do dodania zależy od określonego stężenia i powinna być dostosowana tak, aby 1 i mikro; L dodanych ludzkiej plazminy w 120 i mikro; Odczynnik L daje końcowe stężenie 200 nmol/L.</td></tr><tr><td>Normalna plazma zgromadzona</td><td>Przygotowanie wewnętrzne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Stabilne przez 3 godziny po rozmrożeniu, jeśli trzyma się na lodzie.</td></tr><tr><td>Osocze pacjenta</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Substrat plazminowy (CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid)-rodamina-morfolinomocz</td><td>Symeres</td><td></td><td>Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C &nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik tkankowy ludzki (TF): Innovin</td><td>Dade Behring</td><td>B4212</td><td>Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C &nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinowany aktywator plazminogenu tkankowego typu (tPA): Alteplaza/Aktyliza</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Stabilna przez 12 miesięcy przy -80 °C &nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hydroksylmetylo)aminometan (H2NC(CH2OH)3)</td><td>Merck</td><td>1.08382.2500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)</td><td>Przygotowanie wewnętrzne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-NaCl-CaCl2 bufor, pH 7,4 (TBS-Ca)</td><td>Przygotowanie wewnętrzne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Substrat trombinowy Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-metylokoumaryna</td><td>Symeres</td><td></td><td>Stabilny przez 6 miesięcy przy -80 °C &nbsp;</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetr / czytnik mikropłyt Fluostar Optima z kontrolą temperatury i wtryskiwaczami odczynników</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka mikromiareczkowa, polistyren, płaskie dno,, średnia powierzchnia wiązania (odpowiednik mikrolonów)</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna (waga obciążająca od góry)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie końcówki pipet (dla 100-1000 i mikro; L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi z cytrynianem 3mL (3,2% cytrynian)</td><td>BD Vacutainer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro z lodem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do lodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator / mikropłyta wstrząsająca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak rur mikrowirówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe, zamykalne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipety 0,1-10 & mikro; L, niesterylna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety (2, 10, 20, 100 i 1000 & mikro; L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt (używany jako sonda)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik rurowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żółte końcówki pipety (dla 20-200 i mikro; L)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test hemostazy nijmegen: jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

The Nijmegen Hemostasis Assay: Simultaneous Fluorogenic Measurement of Thrombin and Plasmin Generation in a Single Well

Trombina i plazmina odgrywają centralną rolę w hemostazie, regulując odpowiednio krzepnięcie i fibrynolię. Konwencjonalne testy hemostatyczne często koncentrują się na izolowanych składnikach lub ograniczonych fazach hemostazy; Na przykład aktywowany czas częściowy tromboplastyny i czas protrombinowy oceniają jedynie inicjację powstawania fibryny, podczas gdy testy aktywności czynnikowej oceniają funkcję poszczególnych czynników krzepnięcia. Chociaż są one cenne, nie zawierają kompleksowego obrazu całego procesu wtórnej hemostazy i fibrynozy, która dynamicznie rozwija się w czasie. Test hemostazy w Nijmegen (NHA) rozwiązuje to ograniczenie, umożliwiając jednoczesne, czasowo rozdzielone pomiary generacji trombiny i plazminy w pojedynczej mikropłytce. Stosując dwa syntetyczne podłoża fluorogenne o odmiennych widmach wzbudzenia i emisji oraz bez reaktywności krzyżowej, test pozwala na dokładne ilościowe określenie obu enzymów równolegle. Hemostaza inicjuje się w osoczu ubogim w płytki krwi przy użyciu czynnika tkankowego, wapnia i aktywatora plazminogenu tkankowego, a fluorescencja jest rejestrowana co 30 sekund przez 70 minut w temperaturze 37 °C. Krzywe aktywności enzymów są generowane na podstawie standardów kalibracyjnych, z których wyprowadzane są parametry takie jak czas opóźnienia, potencjał trombinowy, czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. Test niezawodnie rejestruje jednoczesną produkcję trombiny i plazminy z dobrą precyzją wewnątrz- i między testami, oraz wykrywa modulację krzepnięcia i fibrynolizy przez efektory takie jak heparyna, aktywowane białko C oraz kwas epsilon-aminokapronowy. W próbkach klinicznych zaobserwowano istotnie zmniejszoną produkcję trombiny u pacjentów z niedoborami czynników krzepnięcia, podczas gdy pacjenci z chorobami fibrynolitycznymi wykazywali podwyższone profile generowania plazmy. Łącząc pomiary generacji trombiny i plazminy, NHA zapewnia kompleksowy wgląd w równowagę hemostatyczną wykraczającą poza konwencjonalne testy. To zintegrowane podejście daje nadzieję na badania i zastosowania kliniczne, takie jak charakteryzacja fenotypów hemostatycznych, ocena ryzyka krwawienia i zakrzepów oraz monitorowanie ukierunkowanych interwencji terapeutycznych. Protokół ten określa procedurę NHA, której celem jest pogłębienie zrozumienia i oceny równowagi hemostatycznej.

Reprezentatywne krzywe generowania trombiny i plazminy uzyskane za pomocą testu hemostazy Nijmegen (NHA) przedstawiono na Rysunku 3. Intensywność sygnału każdej krzywej wyraża się jako procent w stosunku do równocześnie mierzonej normalnej próbki plazmy (NPP). Próbka z NPP jest dołączana do każdego testu jako wewnętrzna kontrola mająca na celu weryfikację ważności testu i zapewnienie porównywalności między seriami.
Rysunek 3A,...

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Thrombin and plasmin both play a central role in hemostasis, regulating coagulation and fibrinolysis, respectively. Conventional hemostatic assays often ...

Moje badania koncentrują się na jednoczesnym pomiarze wtórnej hemostazy i fibrynozy, aby zmierzyć ogólną równowagę hemostatyczną. Większość obecnych badań ocenia izolowane składniki krzepnięcia lub fibrynolizy. Ten test mierzy oba procesy jednocześnie w jednym testie.Na początek włącz czytnik płyty fluorescencyjnej i pozwól mu wyrównać temperaturę do 37 stopni Celsjusza. Konfiguruj ustawienia filtra w programie, ustawiając liczbę par długości fal na dwie. Ustaw długość fali wzbudzenia na 355 nanometrów dla trombiny i 485 nanometrów dla plazminy.Następnie ustaw długość fali emisji na 460 nanometrów dla trombiny i 525 nanometrów dla plazminy. Następnie ustaw typ płyty na mikropłytkę Flat Bottom Black o pojemności 96 dołków Greiner. Przejdź do obszaru odczytu i zdefiniuj układ płyt, używając maksymalnie 20 wgłębień na płytę.Konfiguruj ustawienia PMT i optyki, ustawiając wzmocnienie PMT na 200 woltów oraz liczbę błysków na odczyt na sześć. Następnie przejdź do Timing, aby potwierdzić ustawienia czasowe z całkowitym czasem trwania jednej godziny, dziewięć minut i 30 sekund, czyli interwałem 30 sekund. Przejdź do Shake, aby potwierdzić drżenie trzy sekundy przed pierwszym odczytem.Przejdź do Więcej Ustawień, aby upewnić się, że kolejność odczytu jest ustawiona na Kolumnę. Konfiguruj ustawienia transferu związków przed odczytem, ustawiając liczbę transferów związków na jeden i objętość początkową na 120 mikrolitrów. Sprawdź, czy wysokość pipety wynosi 130 mikrolitrów, objętość 20 mikrolitrów, szybkość jednego mikrolitra na sekundę, a punkt czasu 14 sekund.W sekcji Compound Source potwierdź format płyty złożonej 96 well i wybierz opcję Beckman 96 2,3 mililitra. Potwierdź ustawienia układu Pipette Tipte, wybierając odpowiednie kolumny. Teraz przejdź do kolumn Compound Tips i wybierz właściwe kolumny.Ustaw temperaturę mikropłyty na 37 stopni Celsjusza i sprawdź temperaturę przed użyciem. Następnie ustaw intensywność drgań na 1 100 obrotów na minutę. Następnie rozmroz osocze pacjenta i prawidłowe osadzanie w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 10 minut.Dokładnie wymieszaj próbki plazmy i potwierdz całkowite rozmrażenie bez widocznego krioprepitu. Za pomocą pipety dodaj 80 mikrolitrów osocza pacjenta lub normalnej zgromadzonej plazmy do wybranych dołków, używając świeżej końcówki pipety do każdej próbki. Następnie przygotuj mieszankę podłoża, mieszając 48 mikrolitrów cefaliny z 48 mikrolitrami czynnika tkankowego.Do tego dodaj 240 mikrolitrów buforu chlorku trisodu, następnie pipetę 96 mikrolitrów substratu trombinowego oraz 48 mikrolitrów substratu plazminowego. Pipetą wylej 20 mikrolitrów mieszanki podłoża do każdego dołka. Potrząśnij potem.Następnie włóż mikropłytkę do czytnika płyty fluorescencyjnej i pozwól jej wyrównać temperaturę 37 stopni Celsjusza przez kilka minut. Połącz bufor chlorku trisodu, chlorek trisodu, bufor chlorku wapnia oraz aktywator plazminogenu tkankowego, aby przygotować odczynnik startowy. Dokładnie przeprowadź wir, żeby wymieszać.Pipetować mieszaninę odczynników startowych we wszystkich rzędach kolumny związku. Włóż płytkę zawierającą mieszaninę odczynników startowych do szuflady źródłowej i rozpocznij pomiar fluorescencji. Nagrywaj sygnały fluorescencyjne co 30 sekund przez 70 minut.Utrzymuj płytkę na 37 stopniach Celsjusza przez cały pomiar. Do analizy danych eksportuj dane fluorescencji kinetycznej jako tabelę zawierającą punkty czasowe i wartości fluorescencji na dołek. Oblicz pierwszą pochodną i narysuj krzywe generowania enzymów dla każdego dołka, aby zwizualizować generowanie trombiny lub plazmy w czasie.Test hemostazowy umożliwił jednoczesne, czasowo rozdzielone pomiary generacji trombiny i plazmy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Z krzywej generowania trombin można wyprowadzić kilka parametrów, w tym czas opóźnienia, wysokość szczytu oraz potencjał trombinowy. Dłuższe opóźnienia, niższe szczyty i zmniejszone potencjały trombinowe wskazują na upośledzoną produkcję trombin.Krzywa generowania plazminy dostarcza również wielu parametrów, w tym czas lizy fibryny oraz wysokość szczytu plazminy. Krótsze czasy lizy fibryny i wyższe szczyty odzwierciedlają zwiększone generowanie osocza. Krzywe generowania trombiny i osocza z trzech zdrowych kontrolnych oraz prawidłowo połączonego osocza wykazały powtarzalny czas zakończenia szczytowej wysokości, służąc jako profile referencyjne dla prawidłowej funkcji hemostatycznej.U pacjenta z aktywnością czynnika V na poziomie 3% generacja trombiny była całkowicie nieobecna. Jednak produkcja plazmy wzrosła nieznacznie. Pacjent z aktywnością czynnika V na poziomie 44% wykazał zmniejszoną produkcję trombiny z wydłużonym opóźnieniem i obniżoną maksymalną wysokość, podczas gdy produkcja osocza pozostawała w normie.W przypadku niedoboru Alfa-2-antyplazminy produkcja osocza wzrastała wraz ze spadkiem aktywności Alfa-2-antyplazminy. Pacjent homozygotyczny z aktywnością 23% wykazał wczesne poczęcie generacji plazmy, krótszy czas lizy fibryny oraz wyższy szczyt plazmy. Zmiany te zaobserwowano również u pacjenta heterozygotycznego z aktywnością 73%, choć nie były tak wyraźne.Test hemostazowy jest dobrze przystosowany do badań nad rzadkimi niedoborami czynników krzepnięcia, zaburzeniami fibrinolitycznymi oraz efektami hemostatycznych leków. Główne wyzwania to standaryzacja techniki oraz normalizacja wyników w celu poprawy porównywalności między salami i laboratoriami. Przyszłe badania mogą koncentrować się na automatyzacji testu i opracowywaniu adaptacji kompatybilnych z osoczem pełnym lub bogatym w płyty krwi.

the-nijmegen-hemostasis-assay-simultaneous-fluorogenic-measurement

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Prezentacja szybkiego testu ilościowego hamowania krzepnięcia krwi przez enoksaparynę, będącą heparyną o niskiej masie cząsteczkowej. Wkład enoksaparyny jest oceniany poprzez usunięcie jej wpływu za pomocą trawienia heparynazą. Pełniejszy opis testu szczegółowo przedstawiono w naszej opublikowanej pracy.1 Test ten wymaga nadal potwierdzenia klinicznego.

Szybki test przy łóżku pacjenta (point-of-care) do oceny skuteczności przeciwkrzepliwej enoxaparyny w krwi pełnej

Ten film demonstruje użycie spektrofotometru UV do monitorowania powstawania nierozpuszczalnych skrzepów fibryny w funkcji zmiany zmętnienia roztworu. Spektrofotometr w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV mierzy absorbancję roztworu w czasie, która reprezentuje zmianę zmętnienia spowodowaną tworzeniem się nierozpuszczalnych skrzepów fibryny.

Spektroskopia w zakresie widzialnym UV do monitorowania tworzenia się skrzepów fibryny

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj test hemostazy Nijmegen umożliwiający jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni mikropłytkowej. Ta metoda dostarcza kompleksowej oceny równowagi hemostatycznej w osoczu.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Przeglądaj więcej filmów