Opracowanie nowego modelu wewnętrznego fiksacji dla złamań promieniowych szczurów: ocena gojenia złamań i izolacja gangliów korzenia grzbietowego

Złamania kości promieniowej są bardzo powszechne na całym świecie i stanowią główną przyczynę złamań długich kości kończyn. Model złamania promieniowego szczura jest kluczowy do badania gojenia złamań, badań przesiewowych leków oraz oceny biomateriałów w badaniach ortopedycznych. Ponieważ promień szczurów jest stosunkowo cienki, stalowe płyty i śruby stosowane obecnie w praktyce klinicznej nie nadają się do leczenia złamań promieniowych szczurów.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół innowacyjnie łączy szwy i mocowanie igieł tytanowych, ustanawiając stabilny model złamania promieniowego do badań nad stabilizacją wewnętrzną. W protokole przedstawiliśmy również zastosowanie systemu mikro-CT na żywych zwierzętach, aby wyjaśnić gojenie złamań u szczurów. Pokazaliśmy także ekstrakcję i hodowlę DRG w modelu złamania szczura, który będzie wykorzystywany do badania mechanizmu urazu nerwowego i naprawy złamań.

Narzędzia chirurgiczne do złamań szczurów obejmują ostrze skalpela, uchwyt skalpela, nożyczki operacyjne, uchwyt na igły, kleszcze hemostatyczne oraz kleszcze do tkanek zębatych. Samiec szczura Sprague Dawley, około 8 tygodni życia i waży około 200 gramów. Znieczulaj szczura za pomocą aparatu do znieczulenia gazowego izofluranem i utrzymuj znieczulenie wentylacyjne przez cały czas trwania zabiegu.

Utrzymuj temperaturę na sali operacyjnej na poziomie 28°C. Ustaw szczura w pozycji bocznej. Odsłonij prawą kończynę przednią i ogol włosy maszynką do strzyżenia. Zawij sterylną prześcieradło i owiń opaską opatrunkową wokół bliższej prawej kończyny przedniej, aby zmniejszyć krwawienie po zabiegu.

Przygotuj skórę, naprzemiennie stosując alkohol i peelingi z betadyną trzy razy. Wykonaj 1,5 cm podłużne nacięcie na grzbietowej promieniowej stronie prawego przedramienia. Oddziel przestrzenie mięśniowe i całkowicie odsłoń prawą promień kończyny przedniej.

Użyj nożyczek operujących, aby przeciąć promień i stworzyć pęknięcie poprzeczne. Kierunek nożyczek tworzy kąt 90 stopni względem promienia. Weź tytanową igłę o średnicy 0,8 mm i długości 10 mm, i włóż ją w pęknięcie promieniowe wzdłuż jej osi podłużnej.

Napraw promień i tytanową igłę szwem. Szew był wiązany trzema kolejnymi węzłami, a tytanowa igła była mocowana do promienia za pomocą czterech przerywanych szwów. Zszyj kolor skóry nadmiaru szwów i zamknij drewno.

Dezynfekuj skórę peelingami z betadyną. Okryj ranę sterylną gazą i zabezpiecz bandażami. Szczur odzyskał przytomność po znieczuleniu, a jego stan dobrze się zregenerował.

Znieczulaj szczura za pomocą aparatu do znieczulenia gazowego izofluranem. Umieść szczura w pozycji leżącej w komorze skanującej. Dostosuj pozycję kończyn i głowy, aby wycentrować obszar skanowania w polu widzenia i utrzymać ciągłą wentylację oraz znieczulenie przez cały zabieg.

Wpychaj stałe łóżko zwierzęce do komory skanującej i zamknij drzwi komory. Parametry skanowania mikro-CT zostały ustawione następująco: tryb skanowania: standardowy, czas naświetlania: dwie minuty, pole widzenia: 72 mm, rozmiar woksela: 144 m, kilowolt: 90; mikroamperzy: 88, filtr: 3D-soft. Dane skanowania są automatycznie przesyłane do oprogramowania, a następnie generowany jest trójwymiarowy obraz CT.

Oddziel docelowe tkanki. Eksportuj przetworzone obrazy. Przetnij kręgosłup, usuń ciała kręgów od C1 do C7.

Przetnij kręgosłup szyjny wzdłuż przedniej i tylnej linii środkowej, podzielony na lewą i prawą połowę. Użyj kleszczy z tkanek zębatych, aby podnieść DRG, delikatnie go podnieść, a następnie użyj nożyczek operacyjnych, aby przeciąć włókna nerwowe. Przenieś wyekstrahowane DRG do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL z medium ekstrakcyjnym.

Postaw na lodzie. Powoli zasysaj i wyrzucaj podłoże ekstrakcyjne. Dodaj 1 ml mieszanego roztworu trawiennego i enzymatycznego.

Trawić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 60 do 70 minut. Pipetą należy podać odpowiednią ilość roztworu roboczego fibronektyny do szalki Petriego i obtoczyć ją w inkubatorze 37°C na godzinę. Po trawieniu zawsypaj i wyrzuć mieszany roztwór enzymów trawiennych.

Zbierz filtrat, wiruj w 70 x g przez 8,5 minuty. Po wirowaniu zasysaj i wyrzuć supernatant do rurki wirówki. Dodaj 1 mL kompletnego medium, aby ponownie zawiesić osad.

Wyjmij szalkę Petriego. Wyrzuć roztwór działający fibronektyny i przepłucz PBS dwukrotnie. Zaszczep komórki do szalki Petriego, dodaj 1 ml kompletnego medium.

Umieść je w inkubatorze o stałej temperaturze 37°C z 5% dwutlenku węgla na 8-12 godzin. Obrazowanie mikro-CT potwierdziło pomyślne opracowanie modeli szczurów z złamaniem promieniowym oraz modelu wewnętrznego fiksacji dla złamań promieniowych szczurów. 20 dni po modelowaniu analiza mikro-tomografii u szczurów SD w grupie modelowanej złamania wykazała korzystne rokowanie.

Zaobserwowano powstawanie odcisków na końcach złamania, z postępującym zespoleniem i stopniowym zatarciem linii złamania, co jest zgodne z wczesną fazą zrośnięcia kości. Zdjęcia pokazały rozmytą linię złamania w modelowanym obszarze, co sugeruje, że tkanka kostna w miejscu złamania była w dużej mierze zagojona. W 5. do 6. dniu po izolacji DRG komórki neuronalne wykazują intensywną ekspozycję cytoplazmatyczną.

Na tym etapie całe ciała komórek neuronalnych i otaczające je synapsy są wyraźnie rozróżnialne. Mikroskopia immunofluorescencyjna została użyta do fotografowania komórek neuronalnych szóstego dnia hodowli. Jak pokazano na Rysunku 9, beta-III-tubulina została pokazana jako zielona fluorescencja.

Komórki pozytywne na Beta III-tubulinę, w tym zarówno ciała komórek DRG, jak i aksony, zostały zabarwione na zielono, a niebieska fluorescencja reprezentuje jądra neuronów barwionych przez DAPI. Szczury są klasycznym modelem do badania mechanizmu gojenia złamań dzięki wyraźnemu tłu genetycznemu i krótkiemu cyklowi rozrodczemu. Jednak niewielka średnica promienia, około 1-1,5 mm, uniemożliwia dopasowanie do klinicznego wewnętrznego urządzenia do utrwalania, co poważnie ogranicza jego zastosowanie w badaniach nad gojeniem kości nerwowych.

W odpowiedzi na ten problem badanie innowacyjne zaproponowało metodę wewnętrznego utrwalania igły tytanowej z połączonym szwem. Podstawowa logika polega na zastąpieniu sztywnego mocowania śrub elastycznym podwiązywaniem szwów, co mogłoby zmniejszyć uszkodzenie nerwu iatrogenicznego i zapewnić stabilne środowisko mechaniczne. Protokół ten zapewniał powtarzalność i standaryzację konstrukcji modelu.

Szwy i tytanowe igły są używane do wewnętrznego fiksowania w modelach złamań promieniowych szczurów. Gojenje złamań ocenia się za pomocą mikro-CT. Pierwotne neurony DRG są izolowane i hodowlowane po badaniach gojących złamania.

W protokole innowacyjnie łączymy szwy i tytanowe igły dla stabilnej wewnętrznej fiksacji w modelu złamania promieniowego szczura. Gojenje złamań oceniano za pomocą mikro-CT, a pierwotne neurony DRG zostały wyizolowane i wyhodowane do dalszych badań.