Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu metod przesiewowych CRISPR do identyfikacji celów i zwiększenia skuteczności terapii komórkami CAR T. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują osiągnięcie powtarzalnych metod laboratoryjnych w podejściach przesiewowych CRISPR. Na początek dodaj ustaloną ilość wirusowej biblioteki CRISPR Lenta do płytki o 24 dołkach zawierającej limfocyty T.

Dodaj poli mózg w końcowym stężeniu ośmiu mikrogramów na mililitr. Mieszaj delikatnie, aby zapewnić równomierne rozłożenie. Wiruj komórki w 700 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza, aby przeprowadzić spin-fekcję.

Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij płytkę z wirówki. Zamień podłoże na świeże medium do wzrostu komórek T. Po sześciu godzinach dodaj wektor wirusowy CAR lenta z mnożnością zakażeń o liczbie trzech.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery dni. Po zakończeniu inkubacji pobierz komórki CAR T. Raz umyj PBS.

Następnie barwimy komórki za pomocą acradine orange propidium jode, a następnie liczymy je w liczniku fluorescencyjnych. Przygotuj czteromikromolowy roztwór cas9 w buforze elektroporacyjnym. Ponownie zawiesijcie pięć razy 10 na moc sześciu ogniw CAR T w 50 mikrolitrach roztworu cas9.

Następnie pipetuję 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej dołki wielodołkowego paska cuvete, nie tworząc przy tym pęcherzyków. Usuń widoczne pęcherzyki, delikatnie przesuwając końcówką pipety po krawędziach dołu. Użyj programu rozszerzania komórek T trzy, aby jądrami połączyć komórki T CAR.

Umieść kuwetty w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 40 minut. Ponownie zawiesić komórki z jądrami w ośrodku wzrostu limfocytów T. Następnie inkubuj ponownie w 37 stopniach Celsjusza przez trzy dni.

Policz komórki za pomocą barwienia Acradine Orange propidium jodkiem w liczniku komórek fluorescencjowych. Po dostosowaniu gęstości komórek do dziesięciu do mocy sześciu komórek na mililitr, dodaj puromycynę do końcowego stężenia 2,5 mikrograma na mililitr. Po sześciu dniach inkubacji należy ocenić procent komórek CAR za pomocą cytometrii przepływowej.

Następnie sortować populacje komórek T CAR i przechowywać suche granulki komórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ekstrakt genomowego DNA z próbek za pomocą metody ekstrakcji DNA komórkowej i tkankowej. Zmierz stężenie DNA genomowego za pomocą zestawu do ilościowania DNA z podwójną nicią.

Następnie trawić do pięciu mikrogramów DNA genomowego z 20 jednostkami wybranych enzymów restrykcyjnych w całkowitej objętości 50 mikrolitrów. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze. Następnego dnia przygotuj 10 mililitrów buforu elucyjnego zawierającego 10 milimolartris HCL oraz 50 mililitrów świeżego 70% etanolu.

Pipeta 100 mikrolitrów strawionego produktu do rurki zawierającej wirujące koraliki. Pipeta dokładnie wymiesza zawiesinę i inkubuje przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie magnetizuje przez kolejne pięć minut. Podczas pracy na magnesie odrzuć supernatant i pipetować 200 mikrolitrów roztworu 70% etanolu, nie zakłócając granulki.

Po 30 sekundach odrzuć supernatant i wykonaj jeszcze dwa mycia alkoholowe. Po dwóch myciach pozwól kulkom wyschnąć przez dwie minuty, a następnie usuń je z magnesu. Dodaj 40 mikrolitrów buforu elucian i pipety, aby ponownie zawiesować kulki.

Magnetyzuj zawieszenie na dwie minuty, a następnie przelej supernatant do nowej rury. Dodaj jeden bufor wiązający do prania do rurki zawierającej miligram magnetycznych kulek wirowych streptawidyny. Pipeta do ponownego zawieszenia koralików w buforze.

Następnie umieść zawieszenie na magnesie na jedną minutę, odrzuć supernatant i wykonać jeszcze dwa płukania. Po trzecim praniu ponownie włóż koraliki w dwa bufory wiązania x wash. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 10 mikromolowych biotinylowanych starterów pulldown do oczyszczonego produktu trawienia.

Inkubuj mieszankę w suchej kąpieli w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie natychmiast ostygaj na lodzie przez pięć minut. Dodaj do reakcji jeden miligram wcześniej umytych magnetycznych kulek streptawidyny, zapewniając, że zarówno reakcja, jak i krople streptawidyny mają równe objętości. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, zawieszając co cztery minuty.

Magnetyzuj kulki przez pięć minut, potem myj trzy razy z jednym buforem wiązania z myciem. Na koniec ponownie zawiesij kulki zawierające kasetę powiązaną sgRNA w 50 mikrolitrach buforu elucian. Przygotuj i amplifikuj bibliotekę sgRNA oraz ją sekwencjonuj.

Po selekcji antybiotyku, komórki CAR T transdukowane przez bibliotekę CRISPR wykazały kontynuację przeżycia i proliferacji u obu dawców po leczeniu puromycyną. Nietransdukowane limfocyty T oraz limfocyty CAR T bez transdukcji biblioteki CRISPR nie wykazały porównywalnej proliferacji pod selekcją antybiotykową i służyły jako kontrolne testy negatywne. Trawienie enzymów restrykcyjnych z użyciem NDEL i PSPXI generowało fragmentowane DNA genomowe, zachowując pojedynczą kasetę prowadzącą RNA do wzbogacenia.

Fragmenty zawierające sgRNA były następnie selektywnie amplifikowane. Korelacje Pearsona i Spearmana wykazały, że liczba odczytów pojedynczego przewodnika RNA oraz złożoność biblioteki zostały zachowane w próbkach genomowych dawców w porównaniu z biblioteką plazmidów. Solidna analiza agregacji rang wykazała geny, które zostały istotnie wzbogacone lub osłabione po edycji Cas9 u obu dawców.

Analiza wzbogacenia szlaków ujawniła najważniejsze terminy ontologiczne genów powiązane z zidentyfikowanymi regulatorami genetycznymi. Nasz protokół stanowi niezawodną alternatywę dla istniejących technik laboratoryjnych wykorzystujących metody przesiewowe CRISPR. Nasze wyniki przyczynią się do rozwoju tej dziedziny, wspierając rozwój bardziej powtarzalnych i solidnych protokołów przesiewowych CRISPR.

Nasze wyniki utorowały drogę do identyfikacji genów i można je moderować, aby poprawić fenotyp i funkcję komórek CAR T.