Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo
24 lipca 2026
Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej patologii.
Analiza przestrzenna komórek starczych jest ważna dla zrozumienia ich wkładu w procesy takie jak starzenie się, rak, odporność i normalna homeostaza tkanek. Wykrywanie komórek starczych opiera się na profilowaniu wielu biomarkerów. Wielokrotna immunofluorescencyjna mikroskopowa analiza umożliwia szybkie profilowanie tych biomarkerów na pojedynczej sekcji tkanki.
Na początek upewnij się, że 5-mikronowe grubości formalinowo fiksowane, wparafinowane lub FFPE sekcje tkanek o maksymalnym rozmiarze 4 x 2 centymetrów kwadratowych są centralnie zamontowane na pozytywnie naładowanych szlabanach mikroskopicznych i są wyraźnie widoczne w oknie widzenia uchwytu bez pokrywy. Wykonaj kroki przygotowywania próbki, albo ręcznie używając komory odsłaniającej, albo automatycznie używając automatycznego urządzenia do barwienia. Umieść przygotowane szlabany w uchwycie bez pokrywy.
Wyrównaj górną i prawą krawędź z metalowymi blokadami. Zablokuj szlaban na miejscu, używając obu rąk w tym samym czasie, aby obrócić plastikowe zaciski do pozycji zamka. Upewnij się, że szlaban jest zamocowany całkowicie płasko i nie kołysze się w uchwycie.
Umieść ClickWell, włóż komorę wkładania nad szlabanem i zaciśnij boczne belki dłońmi, aby ograniczyć ciśnienie i zapobiec pęknięciom. Należy załadować komorę kliknięciem 2 mililitrów mediów montażowych zawierających 50% glicerolu w buforowanym fosforanowym roztworze soli przez port wlotowy. Dodaj etykietę kodu kreskowego do lewej strony szlabanu w dowolnej orientacji, a następnie przejdź do obracania.
Do wyboru regionu i analizy autofluorescencji otwórz wersję 4204 oprogramowania akwizycji Mx Workflow, multiplex imaging. Kliknij na Narzędzia, aby wybrać Protocol Publisher. W wyskakującym oknie Multiplex Protocol Publisher wprowadź nazwę protokołu.
Kliknij na Utwórz Okrąg Ustawieniowy, następnie dodaj Kolejny Okrąg Protokołu, aby utworzyć wiele rund oznaczania biomarkerów. Kliknij Publikuj, a następnie wybierz OK w wyskakującym oknie. Uzyskaj kanał Cy3 dla wirtualnych obrazów H&E.
Kliknij na Szlaban, a następnie Utwórz Nową Partię. Po wybraniu nazwy protokołu wprowadź identyfikator szlabanu. Kliknij na Dodaj Szlaban i następnie wybierz Utwórz Partię dla utworzenia wielokanałowego przepływu eksperymentu. Otwórz oprogramowanie akwizycji Cell DIVE.
Kliknij na Wczytaj, aby załadować szlaban do mikroskopu. Pod menu Narzędzia, kliknij ikonę siatki, aby zdefiniować pożądane regiony i użyj narzędzia Przenieś, aby przemieścić zdefiniowane regiony. Następnie użyj narzędzia Rysuj, aby odznaczyć dowolne pola, które nie są potrzebne, upewniając się, że każde pole widoku ma co najmniej dwa sąsiednie pola widoku, aby zapobiec problemom z szyciem, i kliknij Zapisz Regiony.
W oknie Mx Workflow kliknij na QC Widoku, aby otworzyć stronę widoku Cell DIVE i wizualizować obraz tkanki w powiększeniu 10x. Kliknij ikonę korekcji obrazu, aby dostosować jasność obrazu i kliknij Prześlij QC, aby wybrać Przejdź i Ponów wczytanie Szlabanu w wyskakującym oknie. Po ponownym wczytaniu obrazu kliknij Dodaj ROI, aby narysować i dostosować regiony zainteresowania.
Wybierz pożądane pola widoku i powtórz dodawanie ROI. Następnie kliknij Wyślij do Laboratorium. Załaduj szlaban, aby rozpocząć automatyczne akwizycje obrazu autofluorescencji 20x.
Pod menu QC Obrazowania, zaznacz pole wyboru odpowiadające konkretnemu identyfikatorowi szlabanu, a następnie kliknij QC Widoku. Powiększ załadowany obraz, aby skanować regiony poza ogniskiem lub artefakty. Sprawdź obrazy tła dla każdego kanału, które zostaną odjęte od końcowego sygnału biomarkera. Kliknij Prześlij QC, a następnie wybierz Przejdź i Zakończ, aby wygenerować obrazy tła.
Przed sekwencyjnym barwieniem biomarkerów wyśrodkuj przeciwciała w 13 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć artefakty. Przygotuj roztwór przeciwciał w 1:200 rozcieńczeniu w buforowanym fosforanowym roztworze soli, albo PBS, zawierającym 0,3% albuminy surowicy bydlęcej, albo BSA. Usuń medium montażowe, pipetując je z portu ClickWell.
I przemyj trzykrotnie 2 mililitrami PBS zawierającego 0,01% Tween 20 albo PBST przez 5 minut. Włóż 350 mikrolitrów roztworu przeciwciał do portu, aby zapewnić pełne pokrycie próbki w komorze barwienia. Inkubację prowadź przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie pipetuj roztwór przeciwciał z portu ClickWell. I przemyj trzykrotnie 2 mililitrami PBST przez 5 minut. Włóż 2 mililitra mediów montażowych.
Włóż uchwyt ClickWell do mikroskopu i załaduj szlaban, aby rozpocząć 20x obracanie biomarkerów. Przeprowadź kontrolę jakości obrazu używając edytora mieszanki i opcji korekcji obrazu oraz prześlij ocenę kontroli jakości obrazu. Pipetuj medium montażowe z portu ClickWell i przemyj trzykrotnie 2 mililitrami PBST przez 5 minut.
Przygotuj roztwór inaktywacji barwnika świeżo przed użyciem. Po usunięciu PBST dodaj 2 mililitry roztworu inaktywacji barwnika dla każdego szlabanu. Inkubację prowadź przez 15 minut w uchwycie szlabanu.
Pipetuj roztwór inaktywacji barwnika z port
Overview
This article presents a comprehensive protocol for multiplexed immunofluorescence (IF) staining, enabling the simultaneous detection of multiple antibody markers within a single tissue section. The method is particularly suited for profiling senescent cells across diverse human tissue types, allowing for detailed spatial and quantitative analysis that surpasses traditional IF techniques.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Immunofluorescence imaging
- Digital pathology
- Tissue microarray analysis
Background
- Traditional IF imaging is limited in the number of markers that can be assessed simultaneously.
- Senescence lacks a universal biomarker; signatures vary by cell type, trigger, and time since induction.
- Multiplexed IF allows for the detection of multiple markers in a single tissue section, improving cell type and structure profiling.
- Spatial relationships between cell types and tissue structures are critical for understanding senescence in situ.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for multiplexed IF staining and imaging of human tissue samples.
- To enable unbiased detection and spatial analysis of senescent cells using combinatorial biomarker approaches.
- To demonstrate the utility of multiplexed imaging for comprehensive tissue profiling.
Methods Used
- Tissue microarrays from 34 human tissue types were utilized.
- 10-plex immunofluorescence staining targeting structural, immune, and senescence biomarkers.
- Sequential staining, imaging, and dye inactivation cycles to build multiplex datasets.
- Image acquisition with a multiplex fluorescence slide scanner.
- Protocols for both manual and automated slide preparation.
- Single-cell segmentation and spatial analysis using digital pathology software.
Main Results
- Successful multiplexed detection of multiple biomarkers within single tissue sections.
- Assessment of abundance and spatial distribution of senescent cells across diverse tissues.
- Generation of high-content multiplex datasets suitable for advanced spatial analysis.
- Protocols adaptable for both manual and automated workflows.
Conclusions
- Multiplexed IF provides a powerful, unbiased approach for senescent cell detection in situ.
- The described methods facilitate comprehensive spatial and quantitative analysis of tissue samples.
- This protocol serves as a general guide for multiplexed imaging in research and pathology applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence enables high-content spatial profiling of senescence markers across diverse human tissues, addressing the challenge of heterogeneous senescence signatures in drug discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity by allowing simultaneous assessment of multiple biomarkers within a single tissue section. The method is positioned to improve decision-making at key inflection points in early discovery and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of senescence-associated pathways using combinatorial biomarker panels.
- Supports biological de-risking by revealing cell-type and context-specific senescence signatures.
- Facilitates predictive confidence in target selection through spatially resolved marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Standardizes multiplexed assay workflows for reproducible and quantitative biomarker detection.
- Enables scalable imaging and analysis suitable for high-throughput tissue microarray studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker data with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting unbiased senescent cell detection.
- De-risks advancement decisions by quantifying abundance and distribution of senescent cells in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed IF assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, quantitative analysis of senescence markers in human tissue microarrays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multi-marker spatial profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated tissue contexts.
- Analytics: Provides high-content imaging datasets and digital pathology outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning biomarker data with disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed imaging across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biomarker analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and digital pathology analysis.
- Needs access to multiplex slide scanners and compatible digital pathology software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to both manual and automated slide preparation workflows.
- Dependent on tissue quality and marker panel optimization for reliable outputs.
