Name: Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Naucz się izolować perycyty z kory mózgu myszy metodą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Zoptymalizowany protokół zapewnia wysoką żywotność komórek i jakość RNA, umożliwiając badanie heterogeniczności perycytów w chorobach neuro-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Fundację Nauki Przyrodniczej w Pekinie (Grant nr 7242222), Prowincjonalny Plan Nauki i Technologii Prowincji Hebei (Grant nr 203777110D) oraz Instytut Badań Mikrokrążenia Uniwersytetu Medycznego Unii Pekińskiej, Chińska Akademia Nauk Medycznych (Grant nr CAMS-IM-2023-02).

W tym badaniu użyto trzech dorosłych myszy C57BL/6J (w wieku 3 miesięcy, 20-25 g). Wszystkie myszy były trzymane w cyklu 12 godzinnym światło/ciemność, w ściśle kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z wolnym dostępem do żywności i wody przed eksperymentami. Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i Etyki Instytutu Mikrokrążenia Chińskiej Akademii Nauk Medycznych i Uniwersytetu Medycznego w Pekinie oraz przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>30% (wt/vol) Roztwór glukozy: Rozpuść 15 g glukozy w 50 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH2O. Aby zapewnić całkowite rozpuszczenie, najpierw dodaj glukozę do 20 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH2O i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj wodę UltraPure DNase/RNase-free dH2O do objętości końcowej 50 mL. Przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
	<li>DNase I (10 mg/mL): Rozpuść 50 mg DNase I w 5 mL sterylnej wody ddH2O. Roztwór mogą przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy. 
	UWAGA: Należy ściśle unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej. Aby zminimalizować wpływ zamrażania i rozmrażania, przed pierwszym zamrożeniem podziel 150 μL roztworu na sterylne probówki mikrowirówkowe i rozmrażaj pojedyncze alikwoty w miarę potrzeby na potrzeby eksperymentów.</li>
	<li>2% (vol/vol) Surowica płodowa bydlęca (FBS) w buforowanym roztworze fosforanowym (PBS): Przygotuj 1x PBS mieszając 5 mL 10x PBS z 45 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH2O. Dodaj 1 mL FBS do 49 mL 1x PBS i dokładnie wymieszaj. 
	UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w czasie kroku 2.1.2. Przeznacz 15 mL na próbkę tkanki.</li>
	<li>Roztwór enzymatyczny składnika mieszanego kolagenazy i dispazu (CD): Oddzielnie rozpuść 100 mg dispazu i 100 mg kolagenazy w 1 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH2O. Połącz roztwory, aby uzyskać końcową objętość 2 mL (stężenie enzymatyczne 100 mg/mL). 
	UWAGA: Podziel 500 μL na sterylne probówki mikrowirówkowe i przechowuj w temperaturze -20 °C. Przed użyciem wstrząśnij, aby uniknąć utraty aktywności związanej z wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem. Należy pamiętać, że forma proszku może powodować poważne podrażnienia skóry/oczu i zaburzenia oddychania. Zawsze obsługuj w wyciągu chemicznym, nosząc rękawice nitrylowe i maskę N95. W przypadku kontaktu natychmiast przepłucz obszar narażony obficie wodą i skontaktuj się z lekarzem.</li>
	<li>Roztwór roboczy enzymatyczny CD: Wymieszaj 1,5 mL roztworu enzymatycznego CD z 43,5 mL 2% (vol/vol) FBS w PBS (z kroku 1.3) przez delikatne odwrócenie. 
	UWAGA: Przygotuj bezpośrednio przed dysocjacją tkanki (krok 2.3.4). Ta objętość jest zoptymalizowana dla trzech myszy; dostosuj proporcjonalnie w razie potrzeby.</li>
	<li>22% (vol/vol) Roztwór Percoll: Połącz 11 mL Percoll, 5 mL 10x PBS i 34 mL wody UltraPure DNase/RNase-free dH2O, aby przygotować 50 mL roztworu. 
	UWAGA: Przefiltruj przez membranę PES o przepływie 0,22 μm. Można przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc bez znacznej utraty stabilności.</li>
	<li>Bufor do mechanicznej dysocjacji: Dodaj 1 mL DNase I (10 mg/mL) do 10 mL 2% (vol/vol) FBS w PBS (z kroku 1.3). Mieszaj za pomocą pipety.</li>
	<li>Roztwory BSA: Przygotuj oddzielnie 1%, 20% i 35% (wt/vol) roztwory BSA według poniższego schematu:
	<ol>
		<li>1% (wt/vol) BSA: Rozpuść 0,15 g BSA w 15 mL buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).</li>
		<li>20% (wt/vol) BSA: Rozpuść 3 g BSA w 15 mL DPBS.</li>
		<li>35% (wt/vol) BSA: Rozpuść 0,7 g BSA w 2 mL DPBS. 
		UWAGA: Przed użyciem przefiltruj wszystkie roztwory przez membranę PES o przepływie 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor HBSS/BSA/Glukoza: Dodaj 167 μL 30% (wt/vol) glukozy (z kroku 1.1) i 1,4 mL 35% (wt/vol) BSA (z kroku 1.8) do 50 mL HBSS, delikatnie wymieszaj. 
	UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w warunkach sterylnych w trakcie kroku 2.1.2. Przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Bufor do zbierania tkanek: Uzupełnij 12 mL buforu HBSS/BSA/Glukoza (z kroku 1.9) o 800 μL DNase I (10 mg/mL). Używaj do tymczasowego przechowywania tkanek i spłukiwania pipet. 
	UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo w warunkach sterylnych w trakcie kr

<ol><li>Payne, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pericyte+microenvironment+during+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The pericyte microenvironment during vascular development.</a> Microcirculation. 26 (8), e12554(2019).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-associated+pericytes+internalize+and+clear+aggregated+amyloid-%CE%B242+by+LRP1-dependent+apolipoprotein+E+isoform-specific+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism.</a> Mol Neurodegener. 13 (1), 57(2018).</li>
<li>Mäe, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+blood-brain+barrier+response+to+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of blood-brain barrier response to pericyte loss.</a> Circ Res. 128 (4), e46-e62 (2021).</li>
<li>Li, P., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+loss+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Pericyte loss in diseases.</a> Cells. 12 (15), 1931(2023).</li>
<li>Oliveira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+brain+pericytes+adopt+an+immature+phenotype+and+require+endothelial+cells+for+expression+of+canonical+markers+and+ECM+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cultured brain pericytes adopt an immature phenotype and require endothelial cells for expression of canonical markers and ECM genes.</a> Front Cell Neurosci. 17, 1165887(2023).</li>
<li>Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+pericyte+research%3Apericyte-specific+and+subtype-specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Challenges in pericyte research:pericyte-specific and subtype-specific markers.</a> Transl Stroke Res. 13 (6), 863-865 (2022).</li>
<li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Alliot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+and+periendothelial+cells+of+brain+parenchyma+vessels+co-express+aminopeptidase+N%2C+aminopeptidase+A%2C+and+nestin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin.</a> J Neurosci Res. 58 (3), 367-378 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+characterization+of+primary+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and characterization of primary endothelial cells and pericytes from mouse sciatic nerve.</a> J Neurosci Methods. 416, 110366(2025).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nat Protoc. 13 (4), 738-751 (2018).</li>
<li>Eichhorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tissue+factor+and+platelet%2Fleukocyte+markers+on+extracellular+vesicles+reflect+platelet-leukocyte+interaction+in+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of tissue factor and platelet/leukocyte markers on extracellular vesicles reflect platelet-leukocyte interaction in severe COVID-19.</a> Int J Mol Sci. 24 (23), 16886(2023).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> J Chem Neuroanat. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+mechanisms+of+N6-methyladenosine+methylation+regulating+mammalian+hypertension+development+by+determined+spontaneously+hypertensive+rats+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic mechanisms of N6-methyladenosine methylation regulating mammalian hypertension development by determined spontaneously hypertensive rats pericytes.</a> Epigenomics. 11 (12), 1359-1370 (2019).</li>
<li>Mirzadeh, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3Awholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face:wholemount staining and ependymal flow.</a> J. Vis. Exp. (39), e1938(2010).</li>
<li>Zappaterra, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cerebrospinal+fluid+from+rodent+embryos+for+use+with+dissected+cerebral+cortical+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants.</a> J. Vis. Exp. (73), e50333(2013).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+atlas+of+human+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging.</a> Dev Cell. 56 (3), 383-397.e8 (2021).</li>
<li>Bahl, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+learning+to+quantify+neuronal+activation+from+single-cell+and+spatial+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Using deep learning to quantify neuronal activation from single-cell and spatial transcriptomic data.</a> Nat Commun. 15 (1), 779(2024).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).</li>
<li>Song, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+comparison+of+human+and+mouse+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels.</a> Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+mural+cell+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain mural cell transcriptome.</a> Sci Rep. 6, 35108(2016).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Crouch, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+stage-specific+effects+of+prospectively+purified+vascular+cells+on+the+adult+V-SVZ+neural+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage.</a> J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).</li>
<li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+muscle+pericyte+selective+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of muscle pericyte selective markers.</a> Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).</li>
<li>Dias, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-derived+fibrotic+scarring+is+conserved+across+diverse+central+nervous+system+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions.</a> Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).</li>
<li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+pericyte+dysfunction+in+mouse+brain+using+functional+ultrasound+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy.</a> Nat Biomed Eng. , (2025).</li>
<li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Niniejsze badanie opisuje systematycznie zoptymalizowaną i zweryfikowaną strategię FACS opartą na wielokolorowym oznakowaniu CD13⁺/CD31⁻ do bardzo wydajnego izolowania perycytów naczyń krwionośnych mózgu myszy24. Analizy cytometryczne przepływowe i późniejsze analizy scRNA-seq potwierdziły, że metoda precyzyjnie rozróżnia perycyty od komórek śródbłonka i daje komórki, które konsekwentnie spełniają wszystkie kluczowe metryki kontroli jakości dla scRNA-seq, w tym żywotność, tempo skupiania się, stęż...

Perycyty są ważnym typem komórek zlokalizowanych wzdłuż mikronaczyń, zazwyczaj osadzone w błonie podstawnej naczyń włosowatych i otulają komórki śródbłonka1. W mózgu perycyty, razem z komórkami śródbłonka, astrocytami i innymi typami komórek, tworzą jednostkę neurovaskularną i są integralne dla struktury i funkcji bariery krew-mózg (BBB). Perycyty odgrywają zasadniczą rolę w regulacji przepływu krwi mózgowej, remodelacji naczyń i utrzymaniu homeostazy naczyniowej. Zachowują integralność BBB poprzez bliskie fizyczne interakcje i parakrynowe sygnałowanie z sąsiednimi komórkami2; dynamicznie regulują transport transendotelialny poprzez endocytozę i ekspresję specyficznych białek transporterów; i przyczyniają się do stabilności hemodynamicznej mózgu poprzez ich czynności kurczowe i rozkurczowe3. Dysfunkcja perycytów, jak również zmiany ich pokrycia lub gęstości, mogą prowadzić do dysregulacji naczyniowej i niedoborów neurologicznych, ostatecznie powodując patologiczne zmiany związane z różnymi zaburzeniami neurologicznymi4. Jednakże, właściwa heterogeniczność perycytów stanowi znaczne wyzwania dla dalszych badań mechanizmowych.
Wraz z rozwojem technologii sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), coraz więcej badań wykorzystuje scRNA-seq do eksploracji heterogeniczności komórkowej i identyfikacji kluczowych celów w patogenezie i progresji chorób. Powszechnie stosowane markery perycytów obejmują receptor PDGF beta (PDGFR-β)5, antygen neuron-glejowy 2 (NG2) i alfa-miozynę gładkomięśniową (α-SMA). Jednakże, te markery mają stosunkowo niską specyficzność6, ponieważ mogą jednocześnie oznaczyć inne komórki naczyniowe, takie jak komórki mięśni gładkich, i komórki przodkowe neuronów, jak komórki przodkowe oligodendrocytów, co utrudnia odróżnienie perycytów od innych komórek mózgowych. W poszukiwaniu bardziej odpornej alternatywy, zwróciliśmy się ku CD13 (Aminopeptydazie N, APN), markerowi szeroko rozpoznanemu za jego silną i konsekwentną ekspresję w perycytach naczyń krwionośnych w poprzednich badaniach7,8,9,10. W naszym badaniu przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne na sekcjach tkanki mózgowej, a wyniki potwierdziły ekspresję CD13 w perycytach, demonstrując jego skuteczność w odróżnianiu perycytów od komórek śródbłonka, ponieważ sygnał CD13 był wyłącznie kojarzony z komórkami naczyniowymi i był nieobecny w komórkach śródbłonka CD31+. (Rysunek 1A). Jednakże, ważne jest, aby zauważyć, że ekspresja CD13 nie jest całkowicie ograniczona do perycytów; wykrywalne poziomy są również obserwowane w komórkach mięśni gładkich tętniczek i żyłek (Rysunek 1B,C).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69749/69749fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Barwienie immunofluorescencyjne wykazuje ekspresję CD13 w perycytach naczyń krwionośnych mózgu i komórkach mięśni gładkich, bez wykrywalnego sygnału w komórkach śródbłonka. (A) Reprezentatywne obrazowanie immunofluorescencyjne strefy przejścia tętniczek-włosowatych w mikrokrążeniu mózgu. Złączone zdjęcie pokazuje perycyt CD13+ (zielony) otulający komórki śródbłonka CD31+ (czerwony). Komórki mięśni gładkich α-SMA+ (cyjan) zlokalizowanych są w regionie tętniczek i nieobecne w włosowatych. (B) Przekrój tętniczki. Obrazy demonstrują jasną ko-lokalizację perycytów CD13+ (zielony) i komórek mięśni gładkich α-SMA+ (cyjan) w otaczającej warstwie mięśniowej, potwierdzając ekspresję CD13 w komórkach mięśni gładkich tętniczek. (C) Przekrój żyłki. Podobnie, CD13 (zielony) jest wykrywalny w komórkach mięśni gładkich α-SMA (wskazówki strzałkami) ściany żyłki. Skala: 20 µm (A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69749/69749fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Aby uzyskać perycyty naczyń kory mózgowej myszy spełniające wymagania dla scRNA-seq, przeprowadziliśmy sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie (FACS) z wykorzystaniem oznaczenia przeciwciała CD13+/CD31- do izolację perycytów11. Początkowo, markery CD45 i CD41 zostały użyte do wykluczenia komórek krwiotwórczych z zawiesiny tkanki mózgowej12. Następnie, perycyty zostały wzbogacone poprzez selekcję komórek CD13+, a komórki śródbłonka zostały dalsze wyłączone poprzez wybór populacji CD31-,

<table><tbody><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibicol</td><td>A5669701</td><td>Aliquot and store at -20&deg;C; can be stored at 4&deg;C for up to 1 week after thawing</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline(10&times;PBS, pH 7.4)</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td>Dilute before use for cell washing</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>For preparing cell energy buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-25g</td><td>Protects cells and prevents adhesion</td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Phosphate Buffered Saline (DPBS,1&times;)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1&times;)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>For cell washing and resuspension</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>For preparing nuclease-free reaction systems</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001-100mg</td><td>For tissue digestion and cell dissociation; aliquot and store at -20&deg;C</td></tr><tr><td>DNaseI(RNase-Free)</td><td>TIANGEN</td><td>RT411-1500U</td><td>Prevents DNA aggregation; aliquot and store at -20&deg;C</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-100ML</td><td>For cell separation; store at 4&deg;C</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD13</td><td>BD Biosciences</td><td>558744</td><td>Fluorescent conjugate; store protected from light at 4&deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td>Store protected from light at 4&deg;C for several months</td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Store protected from light at 4&deg;C for several months</td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553081</td><td>Store protected from light at 4&deg;C for several months</td></tr><tr><td>FITC Rat IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>552916</td><td>Fluorescence control; store protected from light at 4&deg;C</td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Store protected from light at 4&deg;C for several months</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2b, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>553989</td><td>Store protected from light at 4&deg;C for several months</td></tr><tr><td>RNase AWAY Decontamination Reagent</td><td>Ambion</td><td>10328011</td><td>For eliminating RNase contamination</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Prevent non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td>For dead cell exclusion.</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>For the preparation of 1.25% (w/v) Tribromoethanol Solution</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Psaitong</td><td>M20008-500mL</td><td>For the preparation of 1.25% (w/v) Tribromoethanol Solution</td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.</td><td>SYXK (Su) 2020-0041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>cell cluture dish 100mm&times;20mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger</td><td></td><td>3.1.0/4.0.0</td><td>Single-Cell Sequencing Data Analysis Software</td></tr><tr><td>Loupe Cell Browser</td><td></td><td>4.1</td><td>Cell Browser</td></tr><tr><td>STAR</td><td></td><td>2.5.1b</td><td>RNA Alignment</td></tr><tr><td>irlbpy</td><td></td><td>-</td><td>Principal Component Analysis</td></tr><tr><td>tsne</td><td></td><td>0.15</td><td>Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analysis</td></tr><tr><td>k-means</td><td></td><td>0.17</td><td>K-Means Clustering</td></tr><tr><td>graph-based clustering</td><td></td><td>0.17</td><td>Graph-Based Clustering</td></tr><tr><td>FastQC</td><td></td><td>v0.11.2</td><td>Data Quality Control (QC)</td></tr></tbody></table>

izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą facs do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Isolation of Pericytes from Mouse Cortical Tissue Using FACS for Single-cell Sequencing

Perycyty, jako kluczowy komponent jednostki neuronaczyniowej, odgrywają istotną rolę w utrzymaniu integralności bariery krew-mózg i regulacji homeostazy hemodynamicznej mózgu poprzez modulacje tonusu mikrokrążenia. Dysfunkcja perycytów została związana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi. Aby zbadać heterogeniczność perycytów i wyjaśnić ich mechanizmy w chorobach neuronaczyniowych na poziomie pojedynczych komórek, opracowałyśmy zoptymalizowany i powtarzalny protokół izolacji perycytów mózgowych myszy, nadający się do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq). Metoda ta opiera się na ustalonej strategii sortowania CD13+/CD31-, ale zawiera kluczowe ulepszenia dostosowane specjalnie do zastosowań scRNA-seq. W skrócie, mózgi zostały zebrane z trzech dorosłych myszy C57BL/6. Tkanki mózgowe zostały mechanicznie rozdrobnione i poddane enzymatycznej dysocjacji, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Po sekwencyjnej wirowanianiu końcowy pelet komórek został resuspendowany w 20% roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA), co jest kluczowy krokiem, który wprowadziliśmy, aby zminimalizować stres i agregację, a tym samym maksymalizować żywotność i jakość RNA do sekwencjonowania. Zatem zoptymalizowane podejście oparte na FACS umożliwia trwałe izolację żywych perycytów mózgowych myszy spełniających rygorystyczne wymagania dla scRNA-seq, oferując potężne narzędzie do analizy heterogeniczności perycytów i ich patologicznych ról w chorobach neuronaczyniowych.

Aby osiągnąć precyzyjne izolację perycytów mózgu, komórki dysocjowane z tkanki mózgowej zostały zabarwione za pomocą PE Texas Red-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD41/CD45 myszy, FITC-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD13 myszy i APC-konjugowanego przeciwciała przeciwko CD31 myszy, co umożliwiło stosowanie wieloetapowej strategii sortowania integrującej markery powierzchniowe i wykrywanie żywotności (Rysunek 2). Wstępne bramy oparte na parametrach rozproszenia przedniego (FSC-A) i r...

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Pericytes, as a core component of the neurovascular unit, play a vital role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier and regulating ...

Nasze badania koncentrują się na pasożytach mózgu, ich roli naczyniowej oraz ich interakcjach w jednostce naczyniowo-mózgowej, aby zrozumieć funkcjonowanie mózgu. Niskie obrazowanie i przestrzenna FACS w mapowaniu procesu jelit lub funkcji pasożytów w naczyniach mózgu ujawniają role specyficzne dla lokalizacji i cele terapeutyczne. Aby rozpocząć, spryskaj głowę i szyję eutanatyzowanego myszy 75% etanolem.Za pomocą skalipela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy od potylicznej do czołowej części, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj przekrojowe nacięcie przed dwuboczną orbitą, następnie boczne nacięcia wzdłuż dolnych krawędzi móżdżku, aby odłączyć podstawę czaszki. Wyciąć ciemieniówkę wzdłuż szwu strzałkowego od tyłu do przodu.Podnieś klapkę czaszki wraz z oponówką, aby odsłonić mózg. Za pomocą chirurgicznych nożyczek delikatnie uniesi j mózg, odciągając nerwy wzrokowe i połączenie rdzenia kręgowego z rdzeniem przedłużonym. Umieść nietknięty mózg delikatnie w naczyniu o średnicy 10 centymetrów zawierającym 10 mililitrów lodowatego PBS, unikając jakiejkolwiek szkody.Przenieś mózg na folię aluminiową. Odsłonij przestrzeń podpajęczynówkową. Po usunięciu oponówki za pomocą kleszczy wypłucz ją roztworem soli równoważącej Hanka.Przenieś tkankę na papier filtracyjny i usuń płaszcz twardówkowy przez przewracanie. Za pomocą ostrza ocieraczowego wytnij i wyrzuć nerw węchowy oraz ogonowe sekcje, a następnie przekroj mózg na kawałki o grubości dwóch do trzech milimetrów. Izolu j korę mózgową wzdłuż ciała łączystego.Przenieś tkankę kory do ampułek zawierających trzy mililitry lodowego buforu do pobierania tkanek. Za pomocą chirurgicznych skalpeli pokrój tkankę i ampułki na fragmenty o wymiarach około jeden na jeden milimetr i zakończ krojenie w ciągu pięciu minut, aby zachować świeżość tkanki. Wstępnie spłucz końcówki pipet z buforem do pobierania tkanek.Następnie powoli zasysaj pokrojone fragmenty w kierunku szczytu końcówki, trzymając pipetę pionowo. Delikatnie wydal fragmenty do wstępnie schłodzonych 15-mililitrowych probówek do wirówki. Przepłucz oryginalne ampułki 2% FBS w buforze PBS.Przenieś płuczkę do tych samych probówek i wiruj w wirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy prędkości 300G. Po wirowaniu wyrzuć nadstan. Ponownie zawieś każdą osadziną w trzech mililitrach roztworu enzymatycznego CD.Podziel zawiesinę równo na trzy probówki i dodaj dodatkowy roztwór enzymatyczny, aby osiągnąć końcową objętość pięciu mililitrów na probówkę. Wykorzystaj probówki w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 100 minut z mieszaniem orbitalnym przy prędkości 100G. Podczas inkubacji dodaj jeden mililitr roztworu dnase one do 10 mililitrów 2% FBS w PBS.Zakończ trawienie wirowaniem przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś każdą osadziną w jednym mililitrze roztworu do dysocjacji tkanek. Pipetuj roztwór 100 razy, aby pomóc w mechanicznym dysocjowaniu.Następnie połącz wszystkie zawiesiny w jedną 50-mililitową probówkę do wirówki. Przepłucz każdą probówkę dwoma mililitrami buforu i połącz płuczki. Po wirowaniu przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i odrzuceniu najwyższej warstwy dodaj 12,5 mililitra 20% BSA i wywróć, aby wymieszać.Wiruj przy prędkości 1000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Teraz odbierz dolną osadziną i przenieś nadstan do nowej 50-mililitrowej probówki do wirówki. Delikatnie ponownie zawieś przed ponownym wywirowaniem.Ponownie zawieś każdą osadziną w dwóch mililitrach 2% FBS w PBS. Następnie połącz obie zawiesiny w jedną probówkę. Wykorzystaj połączoną zawiesinę w wirówce przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Po odrzuceniu nadstanu ponownie zawieś końcową osadziną w dwóch mililitrach PBS z 2% FBS. Przygotuj cztery 15-mililitowe probówki do wirówki zawierające po cztery mililitry 22% roztworu per call. Delikatnie osadz j 0,5-mililitowe alikwoty zawiesiny komórkowej na każdym gradientzie i wykorzystaj wirówkę przy prędkości 560G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odsysaniu nadstanu ponownie zawieś każdą osadziną w jednym mililitrze buforu HBSS BSA glukozy. Następnie przenieś zawiesiny do nowej 15-mililitrowej probówki. Przepłucz probówki perkolacyjne dwoma mililitrami buforu i połącz płuczki przed wykorzystaniem wirówki przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.W przypadku cytometrii przepływowej ponownie zawieś osadziną w jednym mililitrze buforu HBSS BSA glukozy po odsysaniu nadstanu. Dodaj pięć mikrolilitrów reagentu blokującego receptor FC i inkubujej w temperatur

isolation-pericytes-from-mouse-cortical-tissue-using-facs-for-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Ta praca opisuje protokół oparty na FACS, który pozwala na łatwą i jednoczesną izolację perycytów typu I i II od mięśni szkieletowych.

Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Perycyty kapilarne mózgu odgrywają kluczową rolę w regulacji właściwości bariery krew-mózg i przepływu krwi. Protokół ten opisuje, w jaki sposób perycyty naczyń włosowatych mózgu mogą być izolowane, hodowane, charakteryzowane w odniesieniu do typu komórki i stosowane do badań wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej za pomocą sond fluorescencyjnych.

Posiew perycytów naczyń włosowatych mózgu do cytozolowych pomiarów wapnia i badań obrazowych wapnia

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Naucz się izolować perycyty z kory mózgu myszy metodą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Zoptymalizowany protokół zapewnia wysoką żywotność komórek i jakość RNA, umożliwiając badanie heterogeniczności perycytów w chorobach neuro-naczyniowych.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów