Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek
30 stycznia 2026
Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.
Nasze badania koncentrują się na pasożytach mózgu, ich roli naczyniowej oraz ich interakcjach w jednostce naczyniowo-mózgowej, aby zrozumieć funkcjonowanie mózgu. Niskie obrazowanie i przestrzenna FACS w mapowaniu procesu jelit lub funkcji pasożytów w naczyniach mózgu ujawniają role specyficzne dla lokalizacji i cele terapeutyczne. Aby rozpocząć, spryskaj głowę i szyję eutanatyzowanego myszy 75% etanolem.
Za pomocą skalipela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy od potylicznej do czołowej części, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj przekrojowe nacięcie przed dwuboczną orbitą, następnie boczne nacięcia wzdłuż dolnych krawędzi móżdżku, aby odłączyć podstawę czaszki. Wyciąć ciemieniówkę wzdłuż szwu strzałkowego od tyłu do przodu.
Podnieś klapkę czaszki wraz z oponówką, aby odsłonić mózg. Za pomocą chirurgicznych nożyczek delikatnie uniesi j mózg, odciągając nerwy wzrokowe i połączenie rdzenia kręgowego z rdzeniem przedłużonym. Umieść nietknięty mózg delikatnie w naczyniu o średnicy 10 centymetrów zawierającym 10 mililitrów lodowatego PBS, unikając jakiejkolwiek szkody.
Przenieś mózg na folię aluminiową. Odsłonij przestrzeń podpajęczynówkową. Po usunięciu oponówki za pomocą kleszczy wypłucz ją roztworem soli równoważącej Hanka.
Przenieś tkankę na papier filtracyjny i usuń płaszcz twardówkowy przez przewracanie. Za pomocą ostrza ocieraczowego wytnij i wyrzuć nerw węchowy oraz ogonowe sekcje, a następnie przekroj mózg na kawałki o grubości dwóch do trzech milimetrów. Izolu j korę mózgową wzdłuż ciała łączystego.
Przenieś tkankę kory do ampułek zawierających trzy mililitry lodowego buforu do pobierania tkanek. Za pomocą chirurgicznych skalpeli pokrój tkankę i ampułki na fragmenty o wymiarach około jeden na jeden milimetr i zakończ krojenie w ciągu pięciu minut, aby zachować świeżość tkanki. Wstępnie spłucz końcówki pipet z buforem do pobierania tkanek.
Następnie powoli zasysaj pokrojone fragmenty w kierunku szczytu końcówki, trzymając pipetę pionowo. Delikatnie wydal fragmenty do wstępnie schłodzonych 15-mililitrowych probówek do wirówki. Przepłucz oryginalne ampułki 2% FBS w buforze PBS.
Przenieś płuczkę do tych samych probówek i wiruj w wirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy prędkości 300G. Po wirowaniu wyrzuć nadstan. Ponownie zawieś każdą osadziną w trzech mililitrach roztworu enzymatycznego CD.
Podziel zawiesinę równo na trzy probówki i dodaj dodatkowy roztwór enzymatyczny, aby osiągnąć końcową objętość pięciu mililitrów na probówkę. Wykorzystaj probówki w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 100 minut z mieszaniem orbitalnym przy prędkości 100G. Podczas inkubacji dodaj jeden mililitr roztworu dnase one do 10 mililitrów 2% FBS w PBS.
Zakończ trawienie wirowaniem przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś każdą osadziną w jednym mililitrze roztworu do dysocjacji tkanek. Pipetuj roztwór 100 razy, aby pomóc w mechanicznym dysocjowaniu.
Następnie połącz wszystkie zawiesiny w jedną 50-mililitową probówkę do wirówki. Przepłucz każdą probówkę dwoma mililitrami buforu i połącz płuczki. Po wirowaniu przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i odrzuceniu najwyższej warstwy dodaj 12,5 mililitra 20% BSA i wywróć, aby wymieszać.
Wiruj przy prędkości 1000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Teraz odbierz dolną osadziną i przenieś nadstan do nowej 50-mililitrowej probówki do wirówki. Delikatnie ponownie zawieś przed ponownym wywirowaniem.
Ponownie zawieś każdą osadziną w dwóch mililitrach 2% FBS w PBS. Następnie połącz obie zawiesiny w jedną probówkę. Wykorzystaj połączoną zawiesinę w wirówce przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.
Po odrzuceniu nadstanu ponownie zawieś końcową osadziną w dwóch mililitrach PBS z 2% FBS. Przygotuj cztery 15-mililitowe probówki do wirówki zawierające po cztery mililitry 22% roztworu per call. Delikatnie osadz j 0,5-mililitowe alikwoty zawiesiny komórkowej na każdym gradientzie i wykorzystaj wirówkę przy prędkości 560G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po odsysaniu nadstanu ponownie zawieś każdą osadziną w jednym mililitrze buforu HBSS BSA glukozy. Następnie przenieś zawiesiny do nowej 15-mililitrowej probówki. Przepłucz probówki perkolacyjne dwoma mililitrami buforu i połącz płuczki przed wykorzystaniem wirówki przy prędkości 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.
W przypadku cytometrii przepływowej ponownie zawieś osadziną w jednym mililitrze buforu HBSS BSA glukozy po odsysaniu nadstanu. Dodaj pięć mikrolilitrów reagentu blokującego receptor FC i inkubujej w temperatur
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany i powtarzalny protokół izolacji pericytów mózgu myszy, odpowiedni do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq). Poprzez udoskonalenie uznanej strategii sortowania CD13+/CD31- oraz wprowadzenie kluczowych ulepszeń, metoda ta umożliwia skuteczną izolację żywotnych pericytów, co ułatwia badanie ich heterogeniczności oraz roli w chorobach naczyniowo-nerwowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Biologia naczyniowa
Wstęp
- Perycyty są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg.
- Regulują one homeostazę hemodynamiczną mózgowia poprzez modulowanie napięcia mikro naczyniowego.
- Dysfunkcja perycytów jest powiązana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi.
- Zrozumienie heterogeniczności perycytów jest kluczowe dla wyjaśnienia ich roli w chorobach naczyniowo-nerwowych.
Cel badania
- Opracowanie zoptymalizowanego protokołu izolacji pericytów mózgu myszy odpowiedniego do analizy scRNA-seq.
- Umożliwienie wysokojakościowej analizy pojedynczych komórek w celu zbadania heterogeniczności pericytów.
- Dostarczenie narzędzia do badania mechanizmów działania pericytów w chorobach naczyniowo-mózgowych.
Zastosowane metody
- Pobieranie mózgów od dorosłych myszy C57BL/6.
- Mechaniczna dysocjacja i enzymatyczne trawienie tkanki mózgowej w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek.
- Sekwencyjne etapy wirowania.
- Resuspensja końcowego osadu komórkowego w 20% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu zminimalizowania stresu i agregacji.
- Sortowanie komórek metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS) z wykorzystaniem strategii CD13+/CD31-.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie żywotnych perycytów mózgu mysiego odpowiednich do scRNA-seq.
- Zastosowanie 20% BSA poprawia żywotność komórek oraz jakość RNA.
- Metoda ta jest powtarzalna i skuteczna w izolacji perycytów.
- Umożliwia szczegółowe badanie heterogeniczności perycytów w rozdzielczości pojedynczych komórek.
Wnioski
- Ten zoptymalizowany protokół umożliwia wysokiej jakości izolację pericytów mózgu myszy do sekwencjonowania scRNA-seq.
- Stanowi on cenne narzędzie do analizy różnorodności pericytów oraz ich roli patologicznej w chorobach naczyniowo-nerwowych.
- Opisane podejście może przyczynić się do postępu w badaniach nad mechanizmami związanymi z pericytami w zaburzeniach neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skuteczna izolacja żywych pericytów z tkanki kory mózgu myszy z wykorzystaniem FACS bezpośrednio odpowiada na zapotrzebowanie na wysokiej jakości materiał komórkowy w procesie odkrywania celów naczyniowo-nerwowych. Protokół ten zwiększa wiarygodność predykcyjną w badaniach sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek poprzez minimalizację stresu i agregacji komórek, co wspiera rygorystyczną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków na schorzenia OUN. Podejście to umożliwia skalowalne i powtarzalne przepływy pracy, które są niezbędne do selekcji projektów w portfolio oraz zachowania ciągłości badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę heterogeniczności pericytów w kontekście mechanizmów chorób naczyniowo-nerwowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez dostarczanie wysokiej jakości materiału z pojedynczych komórek do profilowania transkrypcyjnego.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnej izolacji określonych populacji komórek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Dostarcza zwalidowane populacje perycytów do późniejszych analiz pojedynczych komórek oraz przesiewów molekularnych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analiz poprzez minimalizację agregacji i stresu komórkowego.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników niezbędnych do wiarygodnej oceny związków w procesach badawczych skoncentrowanych na ośrodkowym układzie nerwowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność z modelowaniem systemów istotnych dla chorób poprzez izolację perycytów zaangażowanych w patologię naczyniowo-nerwową.
- Umożliwienie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki generowaniu wysokiej jakości danych na poziomie pojedynczych komórek.
- Zapewnienie platformy do identyfikacji translacyjnych biomarkerów powiązanych z dysfunkcją perycytów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół izolacji pericytów oparty na metodzie FACS łączy etap wczesnych odkryć z badaniami przedklinicznymi, dostarczając wysokiej jakości materiał komórkowy do sekwencjonowania pojedynczych komórek oraz późniejszych badań funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy transkrypcyjnej perycytów na poziomie pojedynczych komórek.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, żywotne populacje komórek do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki RNA z pojedynczych komórek do analizy porównawczej różnych warunków.
- Badania translacyjne: Ułatwia odkrywanie biomarkerów i wyjaśnianie mechanizmów chorobowych w modelach naczyniowo-nerwowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany schemat postępowania, który po optymalizacji markerów można dostosować do innych typów komórek OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowo-nerwowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów izolacji pojedynczych komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową w rozwoju portfolio CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów naczyniowo-nerwowych i programów translacyjnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze FACS oraz w doborze markerów komórek naczyniowo-nerwowych.
- Wymaga dostępu do wysokiej jakości infrastruktury do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania pojedynczych komórek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przetwarzania tkanek i sortowania komórek pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji paneli markerów dla innych typów komórek OUN lub modeli chorobowych.
- Żywotność komórek i integralność RNA zależą od precyzyjnej obsługi oraz zapobiegania agregacji za pomocą BSA.
