Name: Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę oceny integralności bariery jelitowej u noworodkowych myszy za pomocą gawacji doustnej i komór Ussinga. Technika umożliwia badanie wpływu mikroRNA na funkcję bariery jelitowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wykonane przy wsparciu finansowym ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, nagrody przyznanej przez Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012) oraz grantów ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). Badanie zostało przeprowadzone w ramach konsorcjum INFIBREX i skorzystało z wsparcia planu inwestycyjnego "France 2030", uruchomionego przez rząd francuski i realizowanego przez Université Paris Cité w ramach programu "Initiative of Excellence" IdEx (ANR-18-IDEX-0001). Z wdzięcznością dziękujemy Ussing Chamber Technical Platform w Inflammation Research Center za ich nieocenione wsparcie oraz składamy szczególne podziękowania Alexandrze Willemtz i Maude Le Gall za ich fachową pomoc. Chcielibyśmy również wyrazić szczere podziękowania dla Platformy Obiektów Zwierząt w Centrum Badań nad Zapaleniem za ich niezbędne wsparcie, ze szczególnym podziękowaniem dla Isabelle Renault i Guillaume'a Anselmeta.

<ol><li>Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota%2C+intestinal+permeability%2C+and+systemic+inflammation%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Intern+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review.</a> Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).</li>
<li>Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaky+gut+as+a+danger+signal+for+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases.</a> Front Immunol. 8, 598(2017).</li>
<li>Sorini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+gut+barrier+integrity+triggers+activation+of+islet-reactive+T+cells+and+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).</li>
<li>An, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+mucosal+barrier+in+autoimmune+disease%3A+a+potential+target%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target.</a> Front Immunol. 13, 871713(2022).</li>
<li>Picco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gut+permeability+in+juvenile+chronic+arthritides%3A+a+multivariate+analysis+of+the+diagnostic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters.</a> Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).</li>
<li>Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+inflammatory+bowel+disease%3A+underpinning+pathogenesis+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics.</a> Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).</li>
<li>Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+gut+microbiome+development+and+its+potential+long-term+impact+on+health+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome+Res+Rep%22%5BJournal%5D)">Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes.</a> Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).</li>
<li>Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate%3A+A+link+between+early+life+nutrition+and+gut+microbiome+in+the+development+of+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy.</a> Life (Basel). 11 (5), 384(2021).</li>
<li>Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infant+gut+microbiota+and+environment+associate+with+juvenile+idiopathic+arthritis+many+years+prior+to+disease+onset%2C+especially+in+genetically+vulnerable+children%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children.</a> eBioMedicine. 93, 104654(2023).</li>
<li>Borowitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+inflammatory+bowel+disease%3A+clues+to+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis.</a> Front Pediatr. 10, 1103713(2023).</li>
<li>Leete, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+age+on+the+progression+and+severity+of+type+1+diabetes%3A+potential+effects+on+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diab+Rep%22%5BJournal%5D)">The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms.</a> Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).</li>
<li>Francis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+studies+in+neonatal+mice+using+gavage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probiotic studies in neonatal mice using gavage.</a> J Vis Exp. (143), e59074(2019).</li>
<li>McClain, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+mouse+model%3A+review+of+methods+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neonatal mouse model: review of methods and results.</a> Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).</li>
<li>Thomson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ussing+chamber+system+for+measuring+intestinal+permeability+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease.</a> BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li>
<li>Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterhout%2C+J+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. , (2015).</li>
<li>Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+intestinal+tight+junction+barrier+and+ion+permeability+in+native+tissue+by+Ussing+chamber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique.</a> J Vis Exp. (171), e62468(2021).</li>
<li>Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excised+segments+of+rat+small+intestine+in+Ussing+chamber+studies%3A+A+comparison+of+native+and+stripped+tissue+viability+and+permeability+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs.</a> Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).</li>
<li>Moussaoui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intestinal+glucocorticoid+sensitivity+in+early+life+shape+the+risk+of+epithelial+barrier+defect+in+maternal-deprived+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats.</a> PLoS One. 9 (2), e88382(2014).</li>
<li>Gleeson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhanced+intestinal+permeability+of+infant+mice+enables+oral+protein+and+macromolecular+absorption+without+delivery+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology.</a> Int J Pharm. 593, 120120(2021).</li>
<li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+the+small+intestinal+mucosa+drives+age-dependent%2C+regio-selective+susceptibility+to+Escherichia+coli+K1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection.</a> Sci Rep. 7 (1), 83(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Doustne gavage umożliwia powtarzane podawanie precyzyjnej, określonej dawki luminalnej pojedynczym noworodkowym myszom. Natomiast dobrowolne karmienie, choć jest realną alternatywą, wymaga dłuższego czasu podawania na zwierzę, aby dostarczyć niższą ilość związku i zmniejszoną precyzją dawkowania12. Ponadto doustny gavage przyjmuje większe ilości niż możliwe za pomocą iniekcji, co ułatwia wyższe całkowite dawki przy niższych stężeniach i minimalizuje potencjalną toksyczność przy podaniu<su...

Integralność bariery jelitowej odgrywa fundamentalną rolę w utrzymaniu ogólnego zdrowia poprzez koordynację odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej oraz regulację selektywnej przepuszczalności nabłonka jelitowego. Ten system barierowy kontroluje przepływ składników odżywczych, jednocześnie zapobiegając translokacji patogenów, antygenów i toksyn do ogólnoustrojowego krążenia1. Przewlekłe zaburzenia tego interfejsu, związane ze zwiększoną przepuszczalnością jelit, powszechnie nazywane "przeciekającym jelitem", są obecnie identyfikowane nie tylko jako konsekwencja, ale także jako czynnik napędzający przewlekłe stany zapalne oraz szereg patologii pozajelitowych2.
Na przykład wykazano, że osłabiona funkcja bariery jelitowej jest kluczowym składnikiem chorób autoimmunologicznych i metabolicznych, takich jak zapalne choroby jelit (IBD), młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (JIA) oraz cukrzyca typu 1 (T1D). Podkreśla to stan bariery jelitowej jako kluczowy biomarker, ale także jako cel terapeutyczny, aby zapobiec jak najwcześniejszemu rozpoczęciu procesów patofizjologicznych oraz zapobiec postępowi ostrego stanu zapalnego do stanu przewlekłego 3,4,5,6.
W tym kontekście okres noworodkowy stanowi unikalne i bardzo wrażliwe okno rozwoju, podczas którego ustanowienie i dojrzewanie interfejsu jelita z mikrobiotą głęboko wpływa na całe życie na zdrowie jelit i układu7. Na tym wczesnym etapie nabłonek jelit i układ odpornościowy wykazują zwiększoną wrażliwość zarówno na czynniki endogenne, jak i egzogenne, przechodząc szybki wzrost i różnicowanie, jednocześnie adaptując się do kolonizacji mikroorganizmów i zmian żywieniowych. Zakłócenia osłabiające integralność bariery jelitowej w tym kluczowym oknie rozwojowym mogą odegrać kluczową rolę w pojawieniu się szerokiego spektrum ostrych i przewlekłych chorób w późniejszym życiu. Do tych schorzeń należą choroby immunologiczne, takie jak alergia pokarmowa, oraz poważniejsze choroby przewlekłe, takie jak IBD, JIA i T1D 7,8,9. Choroby te podkreślają, że procesy patofizjologiczne często pojawiają się wcześnie, ponieważ pierwotny początek zwykle następuje między dzieciństwem a wczesną dorosłością10,11. Dlatego zrozumienie mechanizmów regulujących funkcjonowanie bariery jelitowej u noworodków jest niezbędne do opracowania strategii profilaktycznych i terapeutycznych mających na celu zmniejszenie obciążenia wieloma chorobami przewlekłymi.
W tym kontekście istnieje pilna potrzeba wiarygodnych, fizjologicznie istotnych narzędzi do badania integralności bariery jelitowej, mechanizmów chorób przewlekłych oraz stanów zapalnych, szczególnie w środowisku neonatologicznym. Takie narzędzia muszą umożliwiać replikację eksperymentalnych testów już udowodnionych w kontekście dorosłych, nie tracąc przy tym precyzji i skuteczności. Dodatkowo, coraz pilniejsze staje się badanie zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych efektów wielu interesujących nas kandydatów molekularnych, które mają mieć korzystny lub szkodliwy wpływ na homeostazę jelit w kontekście noworodkowym. Wśród dostępnych narzędzi doustne podawanie gavage u noworodkowych myszy stanowi bardzo wiarygodną metodę dostarczania interesujących cząsteczek na określonym etapie rozwoju. Umożliwia kontrolowane badania wpływu różnych związków bioaktywnych, leków lub metabolitów mikroorganizmów na dojrzewanie jelit i funkcję bariery.
Pierwsza część tego artykułu opisuje metodę oddawania młodych myszy już od Day Of Life (DOL) 6, umożliwiającą badanie interwencji przed, w trakcie i po masowym rozszerzeniu liczby gatunków mikrobioty jelitowej wywołanej dywersyfikacją żywności. Dzięki temu technika ta umożliwia analizy podłużne wpływu leczenia na zdrowie jelit w miarę wzrostu i rozwoju młodych.
W drugiej części tego artykułu, uzupełniając to podejście, ex vivo ocena funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy okrężnicowej z wykorzystaniem komór Ussinga dostarcza czułej i ilościowej miary charakterystyki przepuszczalności. Ocena przepuszczalności zarówno parakomórkowej, jak i transkomórkowej w biopsjach jelita grubego u noworodków myszy (np. młodych DOL 10) pozwala precyzyjnie określić wpływ kilku kluczowych kandydatów na integralność i funkcjonowanie bariery nabłonkowej. Transport parakomórkowy to zasadniczo pasywny mechanizm zachodzący w przestrzeni międzykomórkowej warstwy nabłonkowej. Pozwala na przepuszczenie małych substancji rozpuszczonych przez gradienty elektrochemiczne i osmotyczne z lumenu do strony bazolateralnej. Mechanizm ten jest głównie regulowany przez białka z rodziny złączy ścisłych, takie jak klaudyny i okklidyny. Transport transkomórkowy, w przeciwieństwie do tego, jest aktywnym mechanizmem, umożliwiającym wchłanianie większych substancji rozpuszczonych i zachodzącym przez komórki nabłonkowe za pośrednictwem określonych kanałów, nośników i pomp.
Fluoresceinowy izotiocjanian (FITC)-dekstran (4 kDa) przeważnie podlega transportowi parakomórkowemu ze względu na swój rozmiar, podczas gdy nadtlenek chrzanu (HRP; 44 kDa) jest selektywnie przekazywany na stronę bazolateralną drogami transkomórkowymi. Ilościowa identyfikacja tych nieendogennych markerów umożliwia zatem odrębną ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej, odpowiednio. Test komory Ussinga z FITC i HRP zachowuje architekturę tkanek i umożliwia pomiar w czasie rzeczywistym odpowiednio przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej dowolnego odcinka przewodu jelitowego. To połączenie analizy komory noworodkowej i komory Ussinga oferuje potężną strategię badania, jak konkretne cząsteczki wpływają na funkcjonowanie bariery jelitowej zarówno natychmiast, jak i przez dłuższy czas, dostarczając strategii łagodzenia stanu zapalnego i zapobiegania chorobom przewlekłym od najwcześniejszych etapów życia.
Podsumowując, protokół ten opisuje dwie uzupełniające się procedury eksperymentalne umożliwiające: (1) podanie cząsteczek interesujących w okresie wczesnym noworodkowym u młodych myszy (krok 1); (2) ocenę zarówno przepuszczalności parakomórkowej, jak i transkomórkowej w segmentach przewodu jelitowego od noworodków do odstawiających młode za pomocą komór Ussinga (kroki 2-6).

<table><tbody><tr><td>10x DPBS bez Ca i Ca Mg</td><td>Dulbeccos</td><td>14200091</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw HRP</td><td>Nordic Biosite</td><td>GTX10183</td><td>Monoklonalna peroksydaza chrzanowa IgG [2H11]</td></tr><tr><td>Lupa lornetki</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZ61</td><td>Nie wymaga specyfikacji.</td></tr><tr><td>płytka z płytą 96 dołków o płaskim dnie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>137101</td><td>Płytki muszą być czarne i dostosowane do odczytów fluorescencji. Pokrywka musi być zdjęta podczas czytania.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Rzeka Charles</td><td>632C57BL/6J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste 96-dołkowe płaskie wiązanie</td><td>Corning</td><td>9018</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Merck</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Destylowany H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze cienkie</td><td>FST</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4Kd</td><td>FD4</td><td>TdB Labs</td><td>Wrażliwy na fotodegradację.</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Minerve</td><td>20 031 01</td><td></td></tr><tr><td>HRP</td><td>Merck</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 6H2O</td><td>Merck</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System i system EasyMount Ussing P2300 Izba Izb</td><td>Instrumenty fizjologiczne</td><td>EM6-C-CE</td><td>Systemy, komory i suwaki muszą być kompatybilne.</td></tr><tr><td>P2306 Suwak komory Ussing</td><td>Instrumenty fizjologiczne</td><td>PI-P2306</td><td>Dostępne są różne modele suwaków dla różnych rozmiarów i form tkanek.</td></tr><tr><td>Zestaw podłoża QuantaBlu do fluorogenowej peroksydazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Igły do karmienia wielorazowego użytku z okrągłym końcówką</td><td>FST</td><td>18061-24</td><td>Kaliber 24, średnica grotu 1,25 mm, końcówka okrągła. Trzeba go umyć sterylną wodą, poddać 70% etanolowi i poddać autoklawowi przed użyciem.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Merck</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>TECAN&nbsp;</td><td>Spark 10M</td><td>Czytnik tablic z możliwością pozyskania od góry jest wymagany, jeśli używa się 137101 czarnych płytek.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P7949</td><td></td></tr></tbody></table>

oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Oral Gavage in Neonatal Mouse Pups and Functional Assessment of Gut Barrier Integrity Using Ussing Chambers

Rosnące dowody podkreślają znaczenie pierwszych 1000 dni życia w kształtowaniu osi jelit-mikrobiom. To okno wczesnego życia jest kluczowe dla wyznaczania długoterminowych trajektorii fizjologicznych i adaptacji immunologicznych, potencjalnie wpływając na podatność na choroby związane z dysbiozą i dysfunkcją bariery. Głębsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wymaga kompleksowej oceny kluczowych parametrów fizjologicznych, w tym przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej jelita noworodkowego. Ocena tych parametrów jest kluczowa, aby wyjaśnić, jak wczesne narażenie na cząsteczki obce może wpływać na integralność jelit i długoterminowe wyniki zdrowotne. Dlatego pierwsza część tego artykułu opisuje doustne podawanie interesujących cząsteczek u młodych myszy już od wieku 6 lat, przy jednoczesnym minimalizowaniu stresu, ryzyka urazów i kanibalizmu. Do odcinania szczeniąt o wadze co najmniej 2,5 g używa się nawilżonych, zaokrąglonych igieł karmowych 24 g. Druga część przedstawia ocenę per vivo przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej z wykorzystaniem testów komorowych Ussinga na próbkach okrężnicy od młodych od DOL-10 do odstawienia. Bezszpilkowe slidery przystosowane do małych biopsji są stosowane w połączeniu z komorami Ussinga do montażu próbek okrężnicy noworodkowej. Na początku badania do przedziału wierzchołkowego układu dodaje się parakomórkowy sonda FITC-Dextran 4 kDa 4 kDa oraz transkomórkowy marker peroksydaza chrzanowa typu VI na początku badania. Próbki pobierane są w przedziale bazolateralnym w czasie 0 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, aby ilościowo określić przejście sondy. Przejście obu markerów jest ilościowe bezpośrednio (FITC) i pośrednio (HRP) za pomocą czytnika płyt, obliczane za pomocą krzywych standardowych i wyrażane jako strumień.

Kwantyfikacja na podstawie krzywej standardowej i stężenia studni Średnia wartość blanków była odejmowana od każdego wgłębienia płyty. Przy wartościach absorpcji na osi Y i stężeniach na osi X, utworzono standardową krzywą za pomocą funkcji "Interpoluj krzywą standardową" z GraphPad Prism. Jeśli wszystkie punkty standardowe są wyrównane, najlepsze wyniki daje model "liniowy". Alternatywnie, model "Sigmoidal, 4 PL, X to koncentracja" oferuje dużą elastyczność i dokładność dzięki nieliniowej interpolacj...

W tym artykule opisano: (1) dostarczanie cząsteczek testowych do noworodków już od DOL 6; oraz (2) ocenę ex vivo funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy w biopsjach od DOL 10 do młodych odstawianych od odstawienia (DOL 20) poprzez ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej za pomocą komór Ussinga.

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Growing evidence underscores the importance of the first 1,000 days of life in shaping the gut-microbiome axis. This early-life window is critical in the ...

Badaliśmy rolę mikroRNA w interakcjach mikroorganizmów gospodarzy i badaliśmy ich potencjał jako nowych terapii w leczeniu IBD. Obecne metody nie mają wiarygodnych narzędzi do oceny integralności bariery jelitowej we wczesnym okresie życia. Protokół ten wypełnia tę lukę, umożliwiając dokładne badanie czynników rozwojowych leżących u podstaw chorób przewlekłych.Na początek połóż czyste ręczniki papierowe na zdezynfekowanej poduszce grzewczej, ustawionej na około 38 stopni Celsjusza. Przed otwarciem klatek dla zwierząt myj rękawice w 70% etanolu, aby ograniczyć przenoszenie zapachów na szczenięta i ograniczyć ryzyko kanibalizacji. Teraz przenieś matkę do osobnej klatki i przenieś do innego pomieszczenia, aby zminimalizować stres spowodowany wokalizacjami szczeniaka.Pocieraj czyste rękawiczki materiałami do gniazdowania, aby zapobiec przenoszeniu zewnętrznych zapachów na szczenięta podczas gavage. Przymocuj główkę igły do strzykawki techniką sterylną. Zmierz odległość od wyrostka ksunofowego do pyska szczeniaka myszy w wieku sześciu dni lub więcej, aby oznaczyć maksymalną długość włożenia na igłę karmiącą.Nabierz więcej niż pożądana objętość roztworu gavage, aby uniknąć podawania pęcherzyków powietrza. Kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki delikatnie uszczypnij skórę między łopatkami, aby podnieść szczeniaka. Po nawilżeniu trzymaj szczenię niemal poziomo i włóż igłę do jamy ustnej, przesuwając ją prostopadle w stronę gardła, aż dotrze do tyłu gardła.Następnie przesuń igłę na obie strony jamy ustnej, aby uniknąć języka, zachowując ten sam kąt głębokości. Powoli przechylaj głowę szczeniaka do tyłu, regulując kąt igły, aż strzykawka, główka i plecy będą ustawione z główką lekko pochyloną do tyłu. Następnie pozwól strzykawce powoli opaść pod własnym ciężarem, nie wywierając nacisku, aż miejsce włożenia zbliży się do poziomu pyska.Szybko podawaj pożądaną objętość roztworu gavage, gdy już dotrzesz do miejsca włożenia lub go prawie osiągniesz. Następnie delikatnie wyciągnij igłę, zachowując ten sam kąt co podczas wbijania. Połóż szczeniaka na ręczniku papierowym, który wcześniej położył na poduszce grzewczej, i obserwuj powrót do zdrowia, aby prawidłowo oddychać w ciągu 20 sekund.Gdy szczeniak się zregeneruje, umieść je z powrotem w gnieździe i zgrupuj z tamą. Umieść uśpione szczenię w wieku od 10 do 20 dni, które wcześniej było poddane doustnemu gavage, pod sekcją lornetki i nałóż 70% etanolu na odwłok zwierzęcia. Za pomocą kleszczy uszczypnij skórę brzucha i otrzewną, a następnie wykonaj duże poprzeczne nacięcie cienkimi nożyczkami ustawione prostopadle do osi rostralno-ogonowej, nie przecinając jelit.Teraz delikatnie włóż cienkie nożyczki do nacięcia i przesuń cięcie bocznie przez otrzewną po obu stronach. Za pomocą kleszczy i cienkich nożyczek otwórz górną i dolną część otrzewnej, przecinając od okolicy piersiowej do dolnej części miednicy. Następnie zidentyfikuj dalsze jelito grube i wykonaj nacięcie równoległe do jego osi, przesuwając się w kierunku odbytu.Następnie wykonaj nacięcie w końcowej części jelita grubego, aby je uruchomić, i delikatnie pociągnij jelito, aby przejść w stronę ceku, usuwając wszelkie tkanki łączne lub tłuszczowe. Uwolnij jelito grube od odwłoka, przecinając w miejscu połączenia kościowo-kościowego tuż nad polewką. Usuń cecum oraz pierwsze kilka milimetrów okrężnicy bliższej, a następnie pobierz jedną lub dwie próbki jelita grubego większe niż apertura suwaka Ussinga.Z zamkniętymi nożyczkami delikatnie naciskaj i przesuwaj od bliższego do dalszego końca, aby usunąć kał z spłaszczonej biopsji. Następnie umieść opróżniony kawałek jelita grubego do lodowatego buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera. Lekko wysusz wyczyszczoną próbkę jelita grubego ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wilgoci.Następnie umieść próbkę jelita grubego pod lupą i ostrożnie włóż ostrze cienkich nożyczek do części luminalnej, aby ją rozciąć. Za pomocą cienkich kleszczy zamontuj tkankę na białej części suwaka tak, że strona świetlna jest skierowana w górę w stronę operatora. Na koniec zamknij suwak pod mikroskopem binokularnym i wizualnie potwierdzisz, że suwak jest szczelnie zamknięty.Utrzymując delikatny nacisk, aby zamknąć suwak, włóż go do komory Ussinga z lumenem, oznaczonym przezroczystą częścią suwaka, skierowaną w lewo. Wykonaj test przepuszczalności okrężnicy za pomocą FITC-dektranu i HRP. Zbieraj próbki strumienia w czasie, aby ocenić funkcję bariery.Przepuszczalność okrężnicy została zmierzona poprzez obliczenie zależnego od czasu strumienia FITC-dekstranu z pomiarów w komorze Ussinga dla każdej grupy eksperymentalnej. Wartości strumienia istotnie wzrosły w biopsjach zwierząt leczonych mikroRNA-B, ale nie mikroRNA-A, w porównaniu z kontrolą. Ewolucja strumienia poszczególnych próbek została zweryfikowana w celu identyfikacji potencjalnych anomalii, ponieważ wartości strumienia miały pozostać stabilne w różnych punktach czasowych.Dodanie 10-milimolowego EDTA w czasie zerowym spowodowało wyraźny wzrost strumienia w porównaniu z próbkami kontrolnymi, przy zachowaniu podobnego ogólnego wzorca ewolucji strumienia. Ten protokół to potężna strategia badania, jak konkretne cząsteczki wpływają na funkcjonowanie bariery jelitowej noworodków. Obok szkolenia wymagana jest szybkość i precyzja, aby zapewnić prawidłowe traktowanie zwierząt i optymalne warunki do testu przepuszczalności.Zmiany przepuszczalności okrężnicy można zweryfikować za pomocą niezależnych testów, takich jak kwantyfikacja qPCR transkrypcji powiązanych tangencialnie, aby potwierdzić modulację barierową.

oral-gavage-neonatal-mouse-pups-functional-assessment-gut-barrier

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.

Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy...

Mysi model martwiczego zapalenia jelit u noworodków BALB/c

Aby zbadać, jak jelito cienkie radzi sobie z cząstkami o różnych rozmiarach, zmodyfikowaliśmy ustaloną metodę in vivo, aby określić pasaż jelita cienkiego.

Badanie mechanowykrywania cząstek świetlnych w jesionym jelicie cienkim

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Poznaj metodę oceny integralności bariery jelitowej u noworodkowych myszy za pomocą gawacji doustnej i komór Ussinga. Technika umożliwia badanie wpływu mikroRNA na funkcję bariery jelitowej.

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Przeglądaj więcej filmów