Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA
6 lutego 2026
Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.
Nasz protokół umożliwia tę samą ilościową ocenę globalnych poziomów m6A przy użyciu kropki krwi. Protokół ten można zastosować do rutynowych badań przesiewowych oraz wstępnej funkcjonalnej weryfikacji m6A. Na początek usuń z inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza z komórek SNHG 21 knockdown z komórek kontrolnych z udziałem 3-deazaadenozyny i kwasu meklofenamiczowego.
Sprawdź, czy konfluencja komórek wynosi około 80 do 90% pod mikroskopem. Po usunięciu podłoża przepłucz komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Zamień PBS na 1 ml trypsyny na naczynie o wymiarze 6 cm.
Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby trypsyna rozprowadziła się równomiernie, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez minutę. Następnie zamień roztwór trypsyny na 1 milę podłoża zawierającego 10% FBS, aby zakończyć trawienie. Pipetuj zawiesinę komórkową kilkakrotnie, aby rozproszyć komórki.
Przenieś zawiesinę komórkową do mikrowirówki wolnej od rybonukleazy o pojemności 1,5 ml. Wiruj probówkę przy 1000 G przez trzy minuty i pipetuj supernatant. Do ekstrakcji RNA należy dodać 600 mikrolitrów buforu lizyzowego z zestawu do oczyszczania RNA do osadu komórkowego.
Dokładnie przeprowadź wiry, aby rozłożyć komórki i pozwolić roztworowi stać przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj równą ilość 100% etanolu do lizatu i dokładnie przeprowadź wir. Następnie pipetować 600 mikrolitrów mieszaniny na kolumnę spinową złożoną z probówki zbiorczej.
Wiruj kolumnę w 12 000 G przez minutę. Wyrzuć płyn z probówki. Po wirowaniu pozostałej mieszanki dodaj 500 mikrolitrów buforu do oczyszczania RNA do kolumny spinowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez minutę.
Następnie wiruj kolumnę w 12 000 G przez minutę. Wyrzuć płyn z probówki zbiorczej i ponownie wirować pustą kolumnę, aby usunąć resztki płynu. Teraz przenieś kolumnę spinową do nowej rurki wolnej od rybonukleazy o pojemności 1,5 mililitra.
Otwórz pokrywkę, żeby wyschła na powietrzu przez dwie minuty. Dodaj 25 do 50 mikrolitrów wody wolnej od enzymów do środka kolumny spinowej. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej wiruj kolumnę w 12 000 G przez minutę, aby wydzielić RNA.
Odrzuć kolumnę spinową i umieść eluowane RNA na lodzie. Następnie zmierz stężenie RNA próbek kontrolnych i knockdownowych za pomocą spektrofotometru. Przygotuj jeden mikrogram całkowitego RNA z każdej linii komórkowej.
Następnie seryjnie rozcieńczaj RNA do 400 nanogramów, 200 nanogramów i 100 nanogramów, używając wody impregnowanej dietylopirowęglanami. Podgrzej rozcieńczone próbki RNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Natychmiast przełóż rurki na lód, aby ostygły.
Aby wykonać dot blotting, najpierw narysuj linie odniesienia na dodatnio naładowanej membranie nylonowej. Oznacz membranę nazwami próbek. Teraz dokładnie wymieszaj każdą próbkę RNA poprzez delikatne wirowanie lub pipetowanie.
Następnie umieść 1 do 2 mikrolitrów każdej próbki RNA na wyznaczonych miejscach na błonie. Napromieniowanie błony w ultrafioletowym sieciatorze o średnicy 254 nanometrów i 120 milidżulach na centymetr kwadratowy, aby wykonać sieci RNA. Następnie przelać błonę do naczynia zawierającego 10 ml soli trisbuforowanej z Tween 20 i inkubować ją na bujanej platformie przez pięć minut.
Następnie przygotuj świeży 5% roztwór blokujący albuminę w surowicy bydłej tuż przed użyciem i inkubuj błonę w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie inkubuj membranę przeciwciałem przeciw m6A w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc na bujanej platformie ustawionej na 50 obrotów na minutę. Następnego dnia myj błonę trzy razy 10 ml soli fizjologicznej z buforem tris-buforowanym z Tween 20 przez 10 minut na platformie bujanej.
Następnie inkubuj błonę przeciwciałem wtórnym sprzężonym z nadoksydazą chrzanu przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech ponownych umyciach membrany równomiernie nałóż chemiluminescencyjne podłoże z peroksydazy chrzanu kropelo na membranę i inkubuj przez minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc się. Wykrywaj sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.
Wykonaj wstępne skanowanie za pomocą funkcji automatycznej ekspozycji. W przypadku barwienia na błękit metylenowy inkubuj błonę w roztworze błękitu metylenowego przez jedną minutę. Płucz błonę trzy razy 10 ml soli fizjologicznej z trisbuforem w dawce Tween 20 przez pięć minut każdy.
Obraz jako kontrola ładowania. Usuń błonę za pomocą roztworu zawierającego 1% siarczanu sodu dodecylowego na platformie bujającej przez 15 minut. Następnie zaimportuj pobrany obraz do oprogramowania Image J i dostosuj format.
Odejmij tło, wybierając Proces i wybierając Tło. Ustaw promień na 50,0 pikseli i włącz jasne tło. Użyj narzędzia prostokąta, aby wybrać obszar analizy.
Następnie zdefiniuj tory kolejno, wybierając Analizuj, Żeluj i wybierając Wybierz Pierwszy Pas. Następnie klikaj kolejno na Analizuj, Żel, Wykresuj Pasy, a następnie mierz szczyty, aby wygenerować profile intensywności. Zmierz wartości w skali szarości sygnałów N6-metyladenozyny i błękitu metylenowego.
Skopiuj dane ilościowe do tabeli do analizy. Porównaj intensywność sygnału, aby ocenić globalne poziomy modyfikacji N6-metyladenozyny. Leczenie inhibitorem metyltransferazy 3-deazaadenozyną znacząco zmniejszyło globalny sygnał N6-metyladenozyny w komórkach 143B.
Obniżenie poziomu SNHG 21 spowodowało porównywalną obniżkę bazowego globalnego poziomu N6-metyladenozyny. Dodatkowe leczenie 3-dezaadenozyną dodatkowo obniżyło globalny sygnał N6-metyladenozyny w komórkach SHSNHG 21. Leczenie inhibitorem demetylazy kwasem meclofenamiczowym istotnie zwiększyło globalny poziom N6-metyladenozyny w komórkach 143B.
Pomimo niższego poziomu podstawowej N6-metyladenozyny, komórki SHSNHG 21 wykazały wyraźny wzrost poziomu N6-metyladenozyny po leczeniu kwasem meclofenamiowym. Najważniejsze wyzwania to wybór błony, precyzyjne rozcieńczenie RNA oraz jednolity rozmiar obu parametrów. Wykonaj sekwencjonowanie w celu precyzyjnej identyfikacji stanu i zastosowanie cech widma mas, aby osiągnąć kompleksową globalną analizę ilościową.
Przyszłe badania mogą badać mechanizmy m6A w rozwoju i progresji chorób.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół półilościowej oceny globalnych poziomów N6-metyloadenozyny (m6A) w RNA z zastosowaniem analizy dot blot. Metoda ta została opracowana do rutynowego przesiewania i wstępnych badań funkcjonalnych, stanowiąc szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla sekwencjonowania lub podejść opartych na spektrometrii mas w celu oceny modyfikacji m6A.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia RNA
- Epigenetyka
- Biologia molekularna
Wstęp
- m6A jest najliczniejszą wewnętrzną modyfikacją w eukariotycznym mRNA.
- Odegruje ona kluczową rolę w potranskrypcyjnej regulacji genów.
- W celu detekcji m6A istnieją metody globalne oraz specyficzne dla poszczególnych transkryptyw.
- Analizy dot blot stanowią prostą, półilościową metodę globalnej analizy m6A.
Cel badania
- Zapewnienie powtarzalnego schematu postępowania w celu oceny globalnych poziomów m6A w próbkach RNA.
- Umożliwienie analizy porównawczej modyfikacji m6A w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Ułatwienie rutynowego przesiewu i wstępnej weryfikacji funkcjonalnej zmian m6A.
Zastosowane metody
- Hodowla i traktowanie komórek 143B poprzez wyciszenie genu SNHG21, zastosowanie 3-deazaadenozyny (inhibitora metylotransferazy) oraz kwasu meclofenamowego (inhibitora demetylazy).
- Ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu do oczyszczania opartego na kolumnach wirowych.
- Rozcieńczenia seryjne i denaturacja próbek RNA.
- Dot blotting na dodatnio naładowanej membranie nylonowej, sieciowanie promieniami UV i blokowanie.
- Inkubacja z przeciwciałem anty-m6A oraz wtórnym przeciwciałem sprzężonym z HRP.
- Detekcja chemiluminescencyjna i barwienie błękitem metylenowym jako kontrola ładowania.
- Kwantyfikacja intensywności sygnału przy użyciu oprogramowania ImageJ.
Główne wyniki
- Leczenie 3-deazaadenozyną znacząco obniżyło globalne poziomy m6A w komórkach 143B.
- Wyciszenie genu SNHG21 również zredukowało bazowe poziomy m6A.
- Połączone wyciszenie SNHG21 i leczenie 3-deazaadenozyną dodatkowo zmniejszyło sygnały m6A.
- Leczenie kwasem meclofenamowym zwiększyło globalne poziomy m6A, nawet w komórkach z niższym bazowym poziomem m6A wynikającym z wyciszenia SNHG21.
Wnioski
- Analiza dot blot jest skuteczna w półilościowej ocenie globalnego poziomu m6A.
- Jest ona odpowiednia do rutynowych i porównawczych badań modyfikacji m6A.
- Do precyzyjnych, specyficznych dla konkretnych miejsc lub kompleksowych analiz zaleca się dalsze badania z wykorzystaniem sekwencjonowania lub spektrometrii mas.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Globalna kwantyfikacja modyfikacji RNA N6-metyloadenozyny (m6A) ma kluczowe znaczenie dla wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w odkrywaniu leków opartych na epitranskryptomice. Test dot blot umożliwia szybki, półilościowy screening poziomów m6A w różnych warunkach eksperymentalnych, wspierając selekcję projektów w portfolio oraz testowanie hipotez funkcjonalnych. Jego dostępność i powtarzalność czynią go wartościowym narzędziem do analiz porównawczych i rutynowego screeningu w translacyjnych i przedklinicznych etapach opracowywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie modulacji szlaku m6A oraz walidację funkcjonalną celu.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez ilościowe określenie globalnych zmian metylacji RNA po zaburzeniach genetycznych lub farmakologicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad zaangażowaniem celu i badaniach mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki RNA do dalszych etapów analizy i badań porównawczych.
- Standaryzuje półilościowe odczyty w celu powtarzalnego screeningu modulatorów metylacji.
- Umożliwia skalowalną i kosztowo efektywną ocenę wpływu związków chemicznych lub interwencji genetycznych na poziom m6A.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami chorób poprzez umożliwienie oceny globalnych zmian m6A w odpowiedzi na potencjalne interwencje.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając badania funkcjonalne regulacji epitranskrypcyjnej.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju dzięki szybkiemu, porównawczemu profilowaniu metylacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza dot blot wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkryć do badań przedklinicznych, łącząc walidację celu, screening oraz badania translacyjne w zakresie celów epitranskrypcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację globalnych zmian m6A po manipulacji eksperymentalnej.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, półilościowe wyniki dla kampanii przesiewowych związków chemicznych lub genetycznych.
- Analityka: Dostarcza pomiary intensywności w skali szarości dla rzetelnego porównania poziomów metylacji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Umożliwia ocenę efektów interwencji w systemach istotnych dla chorób przy wsparciu odpowiedniego doboru modelu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, szeroko stosowalny przepływ pracy do rutynowych przesiewów metylacji w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach szlaków m6A.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, reprodukowalne i skalowalne ilościowe oznaczanie metylacji przy minimalnym zapleczu sprzętowym.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie szybkiego screeningu funkcjonalnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów epitranskryptomicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z RNA oraz w ilościowej analizie obrazu.
- Wymaga dostępu do podstawowej aparatury biologii molekularnej i systemów obrazowania chemiluminescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji ilości wprowadzanego RNA, doboru membran oraz protokołów ilościowania pomiędzy zespołami.
- Może zostać dostosowany do różnych typów komórek i warunków eksperymentalnych w celu szerszego zastosowania.
- Ma charakter półilościowy i nie jest specyficzny dla konkretnych miejsc; pełne mapowanie wymaga sekwencjonowania lub spektrometrii mas.
