Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej
13 stycznia 2026
Przedstawiono tutaj ustandaryzowany protokół wizualizacji tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórnymi a fibroblastami dermalnymi za pomocą znakowania błonowego i F-aktynowego za pomocą obrazowania konfokalnego stosu z, z opcjonalnym współbarwieniem α-tubuliny, umożliwiającym powtarzalne wykrywanie i charakteryzację cytoszkieletu dla zastosowań inżynierii tkankowej.
Opracowaliśmy metody niezawodnego wykrywania i analizy tunelujących nanorurek między ludzkimi komórkami skóry oraz badania ich potencjalnej roli w regeneracji skóry. Nasz protokół jest zaprojektowany dla stałych próbek lub dla pierwotnych komórek ludzkiej skóry. Jest przydatna w badaniach związanych z biologią skóry i regeneracją tkanek.
Na początek rozmroz i hoduj ludzkie keratynocyty naskórkowe oraz włókniki skórne w naczyniach o średnicy 60 milimetrów zawierających odpowiedni podłoże wzrostu. Uzupełnij posiewki keratinocytów Y-27632 do końcowego stężenia pięciu mikrotrzonowców podczas resuscytacji. Wszystkie hodowle utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze, aż osiągną około 80% konfluencji.
Następnie usuń podłoże z naczynia do hodowli. Krótko przepłucz komórki jednym mililitrem PBS, aby utrzymać fizjologiczne pH i osmolarność podczas mycia. Całkowicie zasysać PBS.
Dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny EDTA i równomiernie rozprowadz go na powierzchni komórki. Inkubuj potrawę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 do 2,5 minuty. Delikatnie zawiesz komórki, pipetując w górę i w dół.
Dodaj dwa mililitry podłoża wzrostowego, aby zneutralizować trypsynę. Przełóż zawiesinę ogniwową do rurki o pojemności 15 mililitrów i wiruj w wirówce 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu wyrzuć supernatant z rurki wirówki.
Ponownie zawiesij granulek komórkowy w jednym do dwóch mililitrach pożywki i policz komórki za pomocą automatycznego licznika. Następnie zasiać 12 000 fibroblastów skórnych lub 20 000 keratynocytów w każdej dołce szkła z ośmiodołkami w końcowej objętości 400 mikrolitrów. Po zasiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 24 godziny.
Po inkubacji potwierdz, czy konfluencja komórek wynosi około 80% pod mikroskopem. Gdy hodowle osiągną 80% konfluencję, delikatnie dodaj kilka kropel roztworu utrwalającego, jedna bezpośrednio do studni komory, aby prefiksować komórki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty, aby utrwalacz rozprzestrzeniał się równomiernie bez zakłócania komórek.
Następnie zasysaj prefiksator z dołku i dodaj 140 mikrolitrów świeżego roztworu utrwalającego jeden raz, zapewniając pełne pokrycie powierzchni studni. Inkubuj zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie usuń utrwalacz z komory i dodaj 140 mikrolitrów 100 milimolowych chlorków amonu, aby schłodzić pozostałe aldehydy.
Inkubuj preparat w temperaturze pokojowej przez 10 do 30 minut. Przepłucz próbki trzy razy PBS przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Podczas każdego płukania delikatnie pipetuj bufor wzdłuż ściany komory, aby nie zmywać komórek ani nie uszkadzać tunelujących nanorurek.
Inkubuj komórki 140 mikrolitrami rozcieńczenia objętościowo-objętościowego w stosunku 1:300 z aglutyny zarodków pszenicy Alexa Flour w PBS. Wykonaj inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby oznaczać glikoproteiny błony plazmatycznej i wizualizować nanorurki tunelujące pochodzące z błony. Następnie myj komórki trzy razy PBS przez 30 sekund każdy.
Następnie inkubuj komórki 140 mikrolitrami sprzężonego falloidyny rozcieńczonego do 250 razy w 1% BSA przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu komórek PBS, inkubuj je w 140 mikrolitrach roztworu DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec dodaj dwie do trzech kropli medium montażowego do każdego dołka i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Przechowuj preparaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez co najmniej 20 minut do czasu rozpoczęcia obrazowania. W hodowlach fibroblastów skórnych nanorurki tunelujące obserwowano jako długie, cienkie wypustki łączące sąsiednie komórki z błonami barwionymi aglutyną z kiełków pszenicy oraz F-aktyną oznaczaną falloidiną. W posiewkach keratinocytów naskórnych zaobserwowano także tunelujące nanorurki z charakterystycznymi dodatnimi wypustkami F-aktyny, które łączyły sąsiednie komórki.
W współhodowlach fibroblastów skórnych i keratynocytów naskórkowych konsekwentnie wykrywano tunelujące nanorurki pomiędzy fibroblastami skórnymi a keratynocytami naskórnymi, co było widoczne za pomocą barwienia błonowego i cytokeratynowego 5. Tunelujące nanorurki w współkulturach wykazywały zróżnicowaną organizację cytoszkieletu, z przykładami zawierającymi jedynie F-aktynę, oba włókna, F-aktynę z częściową alfa-tubuliną lub niskie poziomy alfa-tubuliny. Największym wyzwaniem jest zachowanie tunelu w nanorurkach.
Wymaga to delikatnego utrwalenia, odpowiedniego wyczucia czasu oraz użycia świeżo przygotowanych stałych dodatków. Korzystając z naszego protokołu, nanorurki tunelujące można mierzyć w różnych warunkach komórkowych, aby zbadać ich potencjalne funkcje. W przyszłości będziemy fluorescencjonalnie oznaczać mitochondria, aby badać ich transfer za pomocą tunelujących nanorurek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowany protokół wizualizacji nanorurek tunelowych pomiędzy ludzkimi keratynocytami naskórka a fibroblastami skóry właściwej. Metoda wykorzystuje znakowanie błony oraz F-aktyny z obrazowaniem konfokalnym w stosie z (z-stack), co umożliwia powtarzalną detekcję i charakterystykę cytoszkieletu w kontekście zastosowań w inżynierii tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Regeneracja skóry
Wprowadzenie
- Nanorurki tunelowe to struktury komórkowe, które ułatwiają komunikację międzykomórkową.
- Zrozumienie ich roli w biologii skóry jest kluczowe dla postępów w medycynie regeneracyjnej.
- Badanie koncentruje się na ludzkich komórkach skóry, a konkretnie na keratynocytach i fibroblastach.
- Niezawodne metody detekcji są niezbędne do analizy tych struktur.
Cel badania
- Opracowanie protokołu wizualizacji tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry.
- Pogłębienie zrozumienia roli tych struktur w regeneracji skóry.
- Zapewnienie powtarzalnej metody dla przyszłych badań w dziedzinie inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Rozmrażanie i hodowla ludzkich keratynocytów naskórka oraz fibroblastów skóry właściwej.
- Suplementacja hodowli inhibitorem Y-27632 podczas reanimacji komórek.
- Utrzymywanie hodowli w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.
- Wykorzystanie konfokalnego obrazowania z-stack do wizualizacji.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczną wizualizację nanorurek tunelowych.
- Podwójne barwienie z α-tubulną usprawnia charakterystykę cytoszkieletu.
- Wyniki potwierdzają potencjalną rolę nanorurek tunelowych w regeneracji skóry.
- Metoda jest powtarzalna i możliwa do zastosowania w różnych kontekstach badawczych.
Wnioski
- Opracowany protokół stanowi cenny instrument w badaniach nad nanorurkami tunelowymi.
- Przyczynia się on do zrozumienia komunikacji międzykomórkowej w biologii skóry.
- Wyniki te mogą mieć znaczenie dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niezawodna detekcja nanorurek tunelowych (TNTs) w ludzkich komórkach skóry wypełnia krytyczną lukę w zrozumieniu komunikacji międzykomórkowej istotnej dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Standaryzowana wizualizacja TNT umożliwia ograniczenie ryzyka mechanistycznego w terapiach opartych na komórkach poprzez wyjaśnienie dróg transportu organelli i sygnałów. Ten postęp metodologiczny zwiększa pewność prognostyczną wczesnych etapów odkryć oraz w badaniach translacyjnych skoncentrowanych na regeneracji skóry.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów komunikacji międzykomórkowej w pierwotnych ludzkich komórkach skóry.
- Wspiera walidację funkcjonalną transportu ładunku za pośrednictwem TNT między keratynocytami a fibroblastami.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka poprzez odróżnianie TNT od filopodiów i innych wypustek.
- Zapewnia odtwarzalną strukturę dla badań opartych na hipotezach dotyczących szlaków regeneracji skóry.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia standaryzowane warunki kokultury i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności detekcji TNT.
- Dostarcza wyników ilościowych dzięki systematycznemu obrazowaniu konfokalnemu w stosie z (z-stack) oraz znakowaniu cytoszkieletu.
- Umożliwia przygotowanie analizy do oceny modulatorów tworzenia lub funkcji TNT.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w różnych systemach komórek skóry oraz w zróżnicowanych warunkach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób dzięki zastosowaniu pierwotnych ludzkich komórek skóry w ko-kulturze.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji komunikacji zapośredniczonej przez TNT w naprawie tkanek.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój strategii regeneracyjnych celujących w mechanizmy transferu międzykomórkowego.
- Wspiera przyszły rozwój biomarkerów poprzez charakteryzację składu cytoszkieletu TNT.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych w zakresie biologii skóry i inżynierii tkankowej, umożliwiając rzetelną walidację celów oraz badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji pośredniczonej przez TNT oraz transfer organelli w komórkach skóry.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do badań porównawczych.
- Analityka: Umożliwia pomiar częstotliwości występowania TNT, ich morfologii oraz składu cytoszkieletu w określonych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z przedklinicznymi modelami regeneracji skóry.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zstandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla szerszych zastosowań w inżynierii tkankowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dotyczącą komunikacji za pośrednictwem TNT jako mechanizmu regeneracyjnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne obrazowanie i analizę w układach pierwotnych komórek skóry.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go w przypadku interwencji celowanych w TNT w ramach portfeli inżynierii tkankowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii regeneracyjnych z uwzględnieniem ryzyka, wykorzystujących transfer międzykomórkowy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli pierwotnych komórek oraz zaawansowanej mikroskopii konfokalnej.
- Wymagany jest dostęp do wysokiej jakości platform obrazowania oraz zwalidowanych odczynników do barwienia.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów fiksacji, znakowania i obrazowania.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla innych typów tkanek lub zastosowań w żywych komórkach.
- Niezbędna jest ostrożna manipulacja, aby zachować delikatne struktury TNT i uniknąć powstawania artefaktów.
