Name: Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj standaryzowaną metodę wykrywania tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórkowymi i fibroblastami skóry właściwej. Protokół wykorzystuje barwienie błonowe i F-aktyny z obrazowaniem konfokalnym z-stack, umożliwiając powtarzalną detekcję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten został sfinansowany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82273554). Autorzy dziękują Laboratorium Biomateriałów i Regeneracji Tkanek w Szpitalu Stomatologicznym w Ningbo za nieustanne wsparcie oraz dziękują zarówno obecnym, jak i byłym członkom zespołu za cenne rozmowy. Autorzy dziękują także nauczycielowi Feng Li z Centrum Badań i Eksperymentów Hangzhou Medical College za hojną pomoc i silne wsparcie ułatwiające dostęp do mikroskopu konfokalnego.

Wszystkie komórki skóry użyte w tym badaniu były wcześniej zamrożonymi komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z ludzkich tkanek skóry pozyskanymi jako odrzucone próbki napletka podczas procedur obrzezania, i zostały w pełni zdeidentyfikowanejako 22. Pozyskanie próbek skóry ludzkiej przeprowadzono w Katedrze Urologii Szpitala Ludowego Uniwersytetu Ningbo, a protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyki instytucjonalnej (Protokół nr 2024104; data zatwierdzenia: 30 października 2024).
1. Identyfikacja TNT w ludzkiej pierwotnej skórze, keratynocytach naskórkowych i fibroblastach skórnych
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu<ol>
		<li>Przygotuj roztwór utrwalający 1 (200 μL), dodając 4% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehydu (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) oraz 1x PBS (56 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj roztwór utrwalający 2 (200 μL), dodając 8% PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj roztwór utrwalający 3 (200 μL), dodając 8% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehydu (4 μL) oraz 1x PBS (96 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórkowa<ol>
		<li>Rozmrażaj i hoduj ludzkie keratynocyty naskórkowe oraz fibroblasty skórne w naczyniach o średnicy 60 mm, używając odpowiedniego podłoża wzrostowego. Uzupełnij hodowle keratynocytów Y-27632 w końcowym stężeniu 5 μM podczas resuscytacji. Utrzymuj hodowle w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze do osiągnięcia ~80% konfluentności.</li>
		<li>Usuń podłoże i krótko umyj komórki 1 mL 1x PBS (używanego do utrzymania pH fizjologicznego i osmolarności podczas mycia). Aspiruj PBS.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA, rozprowadz równomiernie i inkubuj w 37 °C przez 1,5-2,5 minuty.</li>
		<li>Delikatnie zawieszaj komórki przez pipetowanie. Dodaj 2 mL podłoża wzrostowego, przelej do probówki 15 mL i wiruj w 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w 1-2 mL medium. Liczenie komórek za pomocą automatycznego licznika.</li>
		<li>Zasiej 12 000 fibroblastów skórnych lub 20 000 keratynocytów w każdej jamie szkiełka komorowego z 8 dołkami w końcowej objętości 400 μL. Po wysiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki. Inkubować przez ~24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po około 24 godzinach inkubacji obserwuj zbieg komórek pod mikroskopem. Jeśli osiągnie ~80%, przejdź do kolejnych etapów fiksacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiksacja<ol>
		<li>Gdy hodowle osiągną ~80% konfluencję, delikatnie dodaj kilka kropel roztworu utrwalacza 1 bezpośrednio do komory, aby prefiksować komórki. Inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że utrwalacz rozprowadza się równomiernie, nie zakłócając komórek. UWAGA: Obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zakłóceń TNT. Ponieważ roztwory utrwalające zawierają toksyczne składniki, takie jak PFA i glutaraldehyd, zawsze noś rękawice ochronne, odzież ochronną i maseczkę, a obchodz się z nimi w okapie oparowym. Pamiętaj, aby dokładnie umyć ręce po zabiegu. Zbieraj PFA i utrwalające odpady utrwalające glutaraldehyd osobno w oznaczonych pojemnikach do utylizacji substancji niebezpiecznych.</li>
		<li>Aspiruj prefiksator i zamień go na 140 μL świeżego roztworu utrwalacza 1, zapewniając pokrytie całej studni. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń Roztwór Utrwalający 1 i dodaj 140 μL Roztworu Utrwalającego 2. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa komórki, aby utrzymać równomierne utrwalenie.</li>
		<li>Usuń utrwalający, a następnie dodaj 140 μL 100 mM NH₄Cl, aby schłodzić pozostałe aldehydy. Inkubuj przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukuj próbki 3 razy 1x PBS przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując wzdłuż ściany komory, aby nie zmyć komórek ani nie rozbić TNT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie błonowe i cytoszkieletowe<ol>
		<li>Inkubuj komórki 140 μL konjugatu 1:300 (v/v) WGA (aglutininy z kiełków pszenicy)-fluoru Alexa, który oznacza glikoproteiny błony plazmatycznej do wizualizacji TNT pochodzących z błony, w 1x PBS przez 20 minut w ciemności i temperaturze pokojowej. UWAGA: Kolejne kroki muszą być wykonane w ciemnym środowisku.</li>
		<li>Umyj 3 razy z 1 PBS (po 30 sekund każdy). Inkubować 140 μL sprzężonej falloidyny rozcieńczonej w 1:250 (v/v) w 1% BSA przez 30 minut w ciemności i temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj 3 razy z 1 PBS (po 30 sekund każdy). Inkubuj z 140 μL roztworu DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyj 3 razy z 1× PBS. Dodaj 2-3 krople medium mocujących, inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przechowuj co najmniej 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C aż do wykonania obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie<ol>
		<li>Uzyskuj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40x. Wybierz losowe pola i zbieraj stosy Z (10-20 warstw) od dołu do góry komórek. Szczegółowe parametry mikroskopu używane do akwizycji obrazu przedstawiono poniżej: Konfokalny mikroskop laserowy skanujący: ZEISS LSM 900 Linie laserowe: Ścieżka 1 (561 nm, 4,0%), Ścieżka 2 (488 nm, 16,0%), Ścieżka 3 (405 nm, 60,0%) Wzmocnienie detektora: 525 V Rozmiar kroku Z: 20 sekcji optycznych (całkowita głębokość: 5,32 μm)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Współhodowla komórek naskórnych i skórnych
<ol>
	<li>Przygotuj keratinocyty i fibroblasty zgodnie z krokami 1.2.1-1.2.5.</li>
	<li>Zasiać 10 000 keratynocytów i 6 000 fibroblastów na komorę w dołku 400 μL podłoża. Po wysiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po około 24 godzinach inkubacji obserwuj zbieg komórek pod mikroskopem. Jeśli osiągnie ~80%, przejdź do kolejnych etapów fiksacji.</li>
	<li>Utrwal i barwił błony zgodnie z krokami 1.3-1.4.</li>
	<li>Przepuszcza komórki 0,1% Triton X-100, aby umożliwić dostęp przeciwciał do celów wewnątrzkomórkowych, przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie 3x myje się 1x PBS. UWAGA: 0,1% Triton X-100 powinien być świeżo przygotowany przed użyciem. UWAGA: Triton X-100, szkodliwy dla organizmów wodnych, również musi być wyrzucany jako odpady chemiczne i nigdy nie wylewany do odpływu.</li>
	<li>Blokuj z 140 μL 2% BSA w PBS, aby zmniejszyć wiązanie przeciwciał niespecyficznych na 20 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: 2% BSA powinno być świeżo przygotowane przed użyciem.</li>
	<li>Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem antycytokeratyny 5 rozcieńczonym w 1:200 (v/v) w 2% BSA.</li>
	<li>Przemyj 3x 1x PBS, a następnie inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Alexa Fluor 594 przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj 3 razy z 1× PBS. Barw jąder DAPI i obraz, zgodnie z krokami 1.4.5-1.5.2.</li>
</ol>
3. Identyfikacja składników cytoszkieletowych TNT
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa<ol>
		<li>Hoduj i utrwalaj komórki zgodnie z krokami 1.2-1.3. Przepuszczać z 0,1% Triton X-100 przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przeprać 1x PBS.</li>
		<li>Blokuj z 2% BSA przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem przeciw α-tubulina.</li>
		<li>Przemyj 3x 1x PBS i inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorem Alexa przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. UWAGA: Kolejne kroki muszą być wykonane w ciemnym środowisku.</li>
		<li>Myj 3 razy 1 razem PBS. Oznaczenie F-aktyny falloidyną i obrazem zgodnie z krokami 1.4.3-1.5</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współkultywacja komórek<ol>
		<li>Przygotuj kokultury zgodnie z krokami 2.1-2.2. Napraw roztworem utrwalacza 3 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąpić 140 μL 100 mM NH4Cl i inkubować przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Myj 3 razy 1 razem PBS.</li>
		<li>Najpierw zidentyfikować komórki naskórkowe poprzez permeabilizację, blokowanie i barwienie immunobarwne CK5 dokładnie zgodnie z krokami 2.4-2.8.</li>
		<li>Następnie wykonaj immunobarwienie α-tubuliną zgodnie z krokami 3.1.2-3.1.4.</li>
		<li>Na koniec barw F-aktynę falloidyną i kontynuuj obrazowanie zgodnie z krokami 1.4.2-1.5.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%3A+Diversity+in+morphology+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).</li>
<li>Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer%2Ftransplantation%3A+an+emerging+therapeutic+approach+for+multiple+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases.</a> Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+Nanotube-Mediated+Mitochondrial+Transfer+Rescues+Nucleus+Pulposus+Cells+from+Mitochondrial+Dysfunction+and+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis.</a> Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+transfer+from+early+stages+of+erythroblasts+to+their+macrophage+niche+via+tunnelling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes.</a> Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).</li>
<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+dysfunction+and+loss+of+interpericyte+tunneling+nanotubes+promote+neurovascular+deficits+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).</li>
<li>Zhu, C., Shi, Y., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Cell+Connection+by+Tunneling+Nanotubes%3A+The+Impact+of+Intercellular+Cross-Talk+on+the+Immune+Response+and+Its+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications.</a> Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFAM-Mediated+mitochondrial+transfer+of+MSCs+improved+the+permeability+barrier+in+sepsis-associated+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury.</a> Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+of+mesenchymal+stem+cells+effectively+protects+corneal+epithelial+cells+from+mitochondrial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage.</a> Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+mediate+KRas+transport%3A+Inducing+tumor+heterogeneity+and+altering+cellular+membrane+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties.</a> Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).</li>
<li>Dilsizoglu Senol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+fibrils+subvert+lysosome+structure+and+function+for+the+propagation+of+protein+misfolding+between+cells+through+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes.</a> PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).</li>
<li>Scheiblich, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+rescue+neurons+from+aggregate-induced+neuronal+dysfunction+and+death+through+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes.</a> Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).</li>
<li>Solimando, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+between+bone+marrow+stromal+cells+support+transmitophagy+and+resistance+to+apoptosis+in+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma.</a> Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).</li>
<li>Korenkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+enable+intercellular+transfer+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+enhances+tunneling+nanotubes-mediated+mitochondrial+transfer+in+mesenchymal+stromal+cells+to+accelerate+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing.</a> J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).</li>
<li>Sahinbegovic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Mitochondrial+Transfer+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment.</a> Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).</li>
<li>Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+cellular+communication%3A+tunneling+nanotubes+bridge+the+divide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide.</a> Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).</li>
<li>Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+BMP+functions+in+the+hair+follicle+by+conditional+ablation+of+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA.</a> J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).</li>
<li>Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+stem+cells+are+specified+and+function+in+early+skin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).</li>
<li>Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).</li>
<li>Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Tunneling+Nanotubes+for+Intercellular+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking.</a> Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+Nanotubes%3A+Intimate+Communication+between+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells.</a> Front Immunol. 9, 43(2018).</li>
<li>Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%2C+an+emerging+intercellular+communication+route+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development.</a> Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).</li>
<li>Sartori-Rupp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-electron+microscopy+reveals+the+structure+of+TNTs+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 342(2019).</li>
<li>Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+and+related+structures%3A+molecular+mechanisms+of+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function.</a> Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurujących interesów finansowych do zgłoszenia.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest zachowanie TNT podczas utrwalania i barwienia, ponieważ struktury te są niezwykle delikatne i łatwo ulegają uszkodzeniu. Delikatne obchodzenie się podczas stabilizacji, odpowiednie wyczucie czasu oraz użycie świeżych utrwalających są niezbędne do zachowania integralności TNT. Zastosowanie obrazowania konfokalnego stosu Z jest równie istotne, aby odróżnić TNT zawieszone powyżej podłoża od filopodiów lub innych przyczepnych wypustków, które w przeciwnym razie mogłyby prowadzić do błęd...

Tunelujące nanorurki (TNT) to nanoskalowe, aktynowe kanały umożliwiające bezpośredni międzykomórkowy transfer organelli i cząsteczek sygnałowych. Zazwyczaj mają długość 6-100 μm i średnicę 50-500 nm, niektóre osiągają grubośćnawet 700 nm. W przeciwieństwie do pustych wypustek błony, TNT zawierają włókna cytoszkieletowe, najczęściej F-aktynę, która zapewnia sztywność strukturalną i wspiera transport mitochondrialny 2,3,4. W hodowli dwuwymiarowej TNT definiuje się przez trzy cechy: cienkie (20-700 nm), proste wypustki zawieszone nad podłożem łączące dwie lub więcej komórek; obecność filamentów F-aktyny; oraz możliwość przeładunku ładunku.

Od pierwszej identyfikacji w komórkach PC-12 przez Rustoma i in.5, TNT były badane w wielu układach, w tym układachukładów sercowo-naczyniowych 6, odporności7 iukładów oddechowych 8, nabłonku rogówki9, guzach10 oraz układzie nerwowym11,12. Przyczyniają się one do procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak sygnalizacja immunologiczna, apoptoza, transport materiałów oraz angiogeneza 13,14,15. TNT mogą pośredniczyć w długodystansowym transferze różnorodnych ładunków, w tym mitochondriów, siatkówki endoplazmatycznej, kwasów nukleinowych, jonów, a nawet wirusów 5,16,17.
Skóra jest narządem strukturalnie złożonym, a naskórek i skóra skórna polegają na stałej komunikacji dla homeostazy, gojenia ran i regeneracji kończyn 18,19,20. Chociaż TNT zostały opisane w wielu tkankach, w tym w układzie odpornościowym, nerwowym oraz nabłonku rogówki 7,9,12, ich obecność w ludzkich komórkach skóry nie została opisana w opublikowanej literaturze. Opierając się na ramach metodologicznych opisanych przez Sáenz-de-Santa-María i in.21, przedstawiamy ustandaryzowany i zoptymalizowany protokół wykrywania TNT między keratynocytami naskórka a fibroblastami skórnymi22, wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne w połączeniu z odwróconą mikroskopią konfokalną.
W porównaniu z alternatywnymi metodami wykrywania TNT, protokół ten oferuje praktyczną równowagę między czułością a dostępnością. Obrazowanie żywymi komórkami może rejestrować dynamikę TNT, ale jest ograniczone przez fototoksyczność oraz krótkotrwałość TNT 1,23. Mikroskopia elektronowa dostarcza szczegółów ultrastrukturalnych, ale często nie zachowuje długich rozpięć TNT i nie jest praktyczna do rutynowej analizy pierwotnych komórek skóry24,25. Systemy nanorurek oparte na reporterze umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym, ale wymagają manipulacji genetycznej, która zazwyczaj jest nieefektywna w przypadku pierwotnych keratynoocytów i fibroblastów24,26. Dla porównania, niniejszy protokół wykorzystuje standardową mikroskopię immunofluorescencyjną i konfokalną, umożliwiając powtarzalną detekcję TNT w niezależnie przygotowanych hodowlach komórek skóry, zachowując jednocześnie kompatybilność z delikatnymi komórkami pierwotnymi.
Metoda ta jest szczególnie odpowiednia do analizy próbek stałych, gdzie interesujący jest skład cytoszkieletu i częstość występowania TNT. Ponieważ tronie jest bardzo delikatne, kluczowe są ograniczenia związane z unieruchomieniem i obsługą TNT, a podejście to nie jest w stanie uchwycić dynamiki TNT w czasie rzeczywistym. Niemniej jednak, dla laboratoriów pracujących z pierwotnymi komórkami ludzkiej skóry, ten ustandaryzowany workflow zapewnia dostępny i spójny sposób wizualizacji TNT oraz wspiera dalsze badania ich potencjalnych funkcji w inżynierii tkankowej i regeneracji.

<table><tbody><tr><td>Rurka 15 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>Bezpłodny, wolny od RNazy/DNAZ i pirogeniczny</td></tr><tr><td>37 i stopni; Inkubator C</td><td>Thermo Scientific</td><td>51032877</td><td>Inkubator CO2 o temperaturze 37 stopni zapewnia idealne warunki in vitro.</td></tr><tr><td>Actin-Tracker Red-Rhodamina</td><td>Beyotime</td><td>C2207</td><td>Sonda Actin-Tracker Red-Rhodamine to falloidyna oznaczona fluorescencyjnym barwnikiem Rhodamine, o maksymalnej długości fali wzbudzenia 540nm i maksymalnej długości emisji 565nm.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor sprzężony aglutyniną z kiełków pszenicznych (WGA)</td><td>Sondy molekularne</td><td>W11261</td><td>&nbsp; Alexa Fluor 488 Sprzężony</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyalfa-tubulinowe</td><td>Abcam</td><td>ab7291</td><td>Przeciwciało anty-alfa Tubulina - Load Control (ab7291) to mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające alfa-tubulinę. Odpowiedni dla człowieka, myszy, szczura.</td></tr><tr><td>Przeciwciało antycytokeratyna 5 & nie;</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>Przeciwciało anty-cytokeratyna 5 - Marker cytoszkieletowy (ab52635) to przeciwciało monoklonalne dla królika wykrywające cytokeratynę 5. Odpowiedni dla człowieka, myszy, szczura.</td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Montaż</td><td>Nauki polinaukowe</td><td>18606</td><td>Rozpuszczalne w wodzie, niefluorescujące medium montażowe opracowane do montażu sekcji z roztworów wodnych. Przydatne w technikach immunofluorescencyjnym, ponieważ wzmacnia i zatrzymuje fluorescencyjne barwy.</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek komórkowych</td><td>Countstar</td><td>IC1000</td><td>Automatyczny licznik komórek do szybkiego i precyzyjnego liczenia komórek</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>BIORIDGE</td><td>TD5</td><td>Wirówka stołowa do szybkiego i efektywnego oddzielania próbek w warunkach laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>1379</td><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego to sterylne urządzenie zabezpieczające, które chroni operatorów, próbki i środowiska przed zagrożeniami biologicznymi poprzez filtrowanie patogenów przenoszonych w powietrzu i zapobieganie zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas pracy mikrobiologicznej.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła (BSA)</td><td>YOBIBIO</td><td>U5010-10g</td><td>BSA to globulina w surowicy bydła, zawierająca 583 reszty aminokwasowe o masie cząsteczkowej 66,430 kDa i punktie izoelektrycznym 4,7</td></tr><tr><td>Talerz do hodowli komórek (60x15 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Hodowla tkankowa jest poddana bezpłodności, wolna od wykrywalnych pirogenów, RNazy i DNAZA, DNA.</td></tr><tr><td>Komora Cellvis Slide-8</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td>Zaprojektowany do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takiego jak mikroskopia konfokalna.</td></tr><tr><td>Roztwór barwienia DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006-10 mL</td><td>Roztwór barwienia DAPI nadaje się do barwienia jądrowego wszystkich powszechnych komórek i tkanek.</td></tr><tr><td>IgG H& IgG dla kóz przeciwmyszy L (Alexa Fluor 405) &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab175660</td><td>IgG H& IgG dla kóz przeciwmyszy L (Alexa Fluor 405) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 401nm i maksymalnej emisji 421nm.</td></tr><tr><td>IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L sprzężony z Alexa Fluor 405</td><td>Abcam</td><td>ab175652</td><td>IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L (Alexa Fluor 405) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 401nm i maksymalnej emisji 421nm.</td></tr><tr><td>IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L sprzężony z Alexa Fluor 594</td><td>Abcam</td><td>ab150080</td><td>IgG H& przeciwkrólikowy IgG & IgG L (Alexa Fluor 594) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 590 nm i maksymalnej emisji 617 nm.</td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 X</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP8 X zapewnia niezrównane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z zaawansowanymi możliwościami wykrywania fluorescencji i analizy komórek na żywo.</td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Andor</td><td>BC43</td><td>Andor BC43 to kompaktowy, wysokoobrotowy mikroskop konfokalny, oferujący obrazowanie 10 razy szybsze niż tradycyjne systemy, z możliwością obrazowania 2D/3D jednym kliknięciem</td></tr><tr><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-Y1269&nbsp;</td><td>Chlorek amonu jako związek polarny regulujący pH.</td></tr><tr><td>Falloidyna koniuguje Oregon GreenTM488</td><td>Technologie życia</td><td>O7466</td><td>Kolor: zielony. Zakres długości fal wzbudzenia: 496/520.</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Niech żyją biologie komórek</td><td>C3582-0500</td><td>Jego funkcją jest utrzymanie pH ośrodka w zakresie fizjologicznym oraz utrzymanie równowagi ciśnienia osmotycznego wewnątrz i na zewnątrz komórki.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200-100ml</td><td>Jest to wszechstronny niejonowy surfaktant stosowany do odnawiania składników membranowych w łagodnych warunkach denaturacji.</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300054</td><td>Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego przekazywania hodowli komórek oraz dysocjacji tkanek pierwotnych.</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Y-27632 jest doustnie aktywnym, konkurencyjnym ATP-inhibitorem ROCK-I i ROCK-II</td></tr></tbody></table>

standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej

Standardized Method to Detect Tunneling Nanotubes in Human Skin Cells for Tissue Engineering Applications

Tunelujące nanorurki (TNT) to cienkie, na bazie aktyny kanały międzykomórkowe, które umożliwiają dalekosiężny transfer organelli i ładunku sygnalizacyjnego. Chociaż szeroko opisywane w wielu typach komórek, ich obecność w ludzkich komórkach skóry nie została dobrze opisana. Niniejszy artykuł opisuje ustandaryzowany protokół wykrywania i charakteryzowania TNT in vitro pomiędzy ludzkimi keratynocytami naskórnymi a włóknistymi skórami. Metoda obejmuje przygotowanie współhodowli komórek pierwotnych, delikatne utrwalanie w celu zachowania delikatnych TNT, znakowanie błonowe aglutininą zarodków pszenicy, barwienie F-aktyną falloidyną oraz systematyczne obrazowanie stosu Z za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej w celu odróżnienia TNT zawieszonych nad podłożem od przylegających filopodii. Opcjonalne immunobarwienie dla α-tubuliny pozwala ocenić włączenie mikrotubul. TNT definiuje się przez trzy cechy: cienkie, proste wypustki łączące dwie lub więcej komórek, obecność F-aktyny oraz ciągłość między parami komórek w sekcjach optycznych szeregowych. Reprezentatywne wyniki wykazują TNT łączące pary skóra-skóra, naskórka-naskórka oraz skóra-naskórka, o zmiennym składzie cytoszkieletu (F-aktyna sama lub F-aktyna plus α-tubulina). Kluczowe kroki obejmują delikatne utrwalanie, użycie świeżych odczynników oraz zdobycie wystarczającej liczby z-płaszczyzn, aby uniknąć błędnej klasyfikacji, natomiast powszechne artefakty to pęknięcie TNT i niepełne barwienie. Te zoptymalizowane kroki umożliwiają powtarzalne wykrywanie TNT w systemach komórek skóry i stanowią podstawę metodologiczną do przyszłych badań nad komunikacją pośredniczoną za pomocą TNT w biologii i regeneracji skóry.

Korzystając z tego ustandaryzowanego protokołu, tunelujące nanorurki (TNT) zostały pomyślnie zidentyfikowane w ludzkich komórkach skóry zarówno w warunkach pojedynczej, jak i współhodowlanej. Aby zweryfikować specyficzność przeciwciał, przed analizami eksperymentalnymi przeprowadzono zarówno pozytywne, jak i ujemne barwienia kontrolne dla wszystkich przeciwciał, jak pokazano na Rysunku Uzupełniającym 1, Rysunku Uzupełniającym 2, Rysunku Uzupełniającym 3 oraz Rysunku Uzupełniającym 4. Rep...

Przedstawiono tutaj ustandaryzowany protokół wizualizacji tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórnymi a fibroblastami dermalnymi za pomocą znakowania błonowego i F-aktynowego za pomocą obrazowania konfokalnego stosu z, z opcjonalnym współbarwieniem α-tubuliny, umożliwiającym powtarzalne wykrywanie i charakteryzację cytoszkieletu dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej

Tunneling nanotubes (TNTs) are thin, actin-based intercellular conduits that enable long-range transfer of organelles and signaling cargo. Although widely ...

Opracowaliśmy metody niezawodnego wykrywania i analizy tunelujących nanorurek między ludzkimi komórkami skóry oraz badania ich potencjalnej roli w regeneracji skóry. Nasz protokół jest zaprojektowany dla stałych próbek lub dla pierwotnych komórek ludzkiej skóry. Jest przydatna w badaniach związanych z biologią skóry i regeneracją tkanek.Na początek rozmroz i hoduj ludzkie keratynocyty naskórkowe oraz włókniki skórne w naczyniach o średnicy 60 milimetrów zawierających odpowiedni podłoże wzrostu. Uzupełnij posiewki keratinocytów Y-27632 do końcowego stężenia pięciu mikrotrzonowców podczas resuscytacji. Wszystkie hodowle utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze, aż osiągną około 80% konfluencji.Następnie usuń podłoże z naczynia do hodowli. Krótko przepłucz komórki jednym mililitrem PBS, aby utrzymać fizjologiczne pH i osmolarność podczas mycia. Całkowicie zasysać PBS.Dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny EDTA i równomiernie rozprowadz go na powierzchni komórki. Inkubuj potrawę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 do 2,5 minuty. Delikatnie zawiesz komórki, pipetując w górę i w dół.Dodaj dwa mililitry podłoża wzrostowego, aby zneutralizować trypsynę. Przełóż zawiesinę ogniwową do rurki o pojemności 15 mililitrów i wiruj w wirówce 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu wyrzuć supernatant z rurki wirówki.Ponownie zawiesij granulek komórkowy w jednym do dwóch mililitrach pożywki i policz komórki za pomocą automatycznego licznika. Następnie zasiać 12 000 fibroblastów skórnych lub 20 000 keratynocytów w każdej dołce szkła z ośmiodołkami w końcowej objętości 400 mikrolitrów. Po zasiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 24 godziny.Po inkubacji potwierdz, czy konfluencja komórek wynosi około 80% pod mikroskopem. Gdy hodowle osiągną 80% konfluencję, delikatnie dodaj kilka kropel roztworu utrwalającego, jedna bezpośrednio do studni komory, aby prefiksować komórki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty, aby utrwalacz rozprzestrzeniał się równomiernie bez zakłócania komórek.Następnie zasysaj prefiksator z dołku i dodaj 140 mikrolitrów świeżego roztworu utrwalającego jeden raz, zapewniając pełne pokrycie powierzchni studni. Inkubuj zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie usuń utrwalacz z komory i dodaj 140 mikrolitrów 100 milimolowych chlorków amonu, aby schłodzić pozostałe aldehydy.Inkubuj preparat w temperaturze pokojowej przez 10 do 30 minut. Przepłucz próbki trzy razy PBS przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Podczas każdego płukania delikatnie pipetuj bufor wzdłuż ściany komory, aby nie zmywać komórek ani nie uszkadzać tunelujących nanorurek.Inkubuj komórki 140 mikrolitrami rozcieńczenia objętościowo-objętościowego w stosunku 1:300 z aglutyny zarodków pszenicy Alexa Flour w PBS. Wykonaj inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby oznaczać glikoproteiny błony plazmatycznej i wizualizować nanorurki tunelujące pochodzące z błony. Następnie myj komórki trzy razy PBS przez 30 sekund każdy.Następnie inkubuj komórki 140 mikrolitrami sprzężonego falloidyny rozcieńczonego do 250 razy w 1% BSA przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu komórek PBS, inkubuj je w 140 mikrolitrach roztworu DAPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec dodaj dwie do trzech kropli medium montażowego do każdego dołka i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Przechowuj preparaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez co najmniej 20 minut do czasu rozpoczęcia obrazowania. W hodowlach fibroblastów skórnych nanorurki tunelujące obserwowano jako długie, cienkie wypustki łączące sąsiednie komórki z błonami barwionymi aglutyną z kiełków pszenicy oraz F-aktyną oznaczaną falloidiną. W posiewkach keratinocytów naskórnych zaobserwowano także tunelujące nanorurki z charakterystycznymi dodatnimi wypustkami F-aktyny, które łączyły sąsiednie komórki.W współhodowlach fibroblastów skórnych i keratynocytów naskórkowych konsekwentnie wykrywano tunelujące nanorurki pomiędzy fibroblastami skórnymi a keratynocytami naskórnymi, co było widoczne za pomocą barwienia błonowego i cytokeratynowego 5. Tunelujące nanorurki w współkulturach wykazywały zróżnicowaną organizację cytoszkieletu, z przykładami zawierającymi jedynie F-aktynę, oba włókna, F-aktynę z częściową alfa-tubuliną lub niskie poziomy alfa-tubuliny. Największym wyzwaniem jest zachowanie tunelu w nanorurkach.Wymaga to delikatnego utrwalenia, odpowiedniego wyczucia czasu oraz użycia świeżo przygotowanych stałych dodatków. Korzystając z naszego protokołu, nanorurki tunelujące można mierzyć w różnych warunkach komórkowych, aby zbadać ich potencjalne funkcje. W przyszłości będziemy fluorescencjonalnie oznaczać mitochondria, aby badać ich transfer za pomocą tunelujących nanorurek.

standardized-method-to-detect-tunneling-nanotubes-human-skin-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół produkcji i pomiaru urządzeń dla biosensorów wysokiej częstotliwości opartych na nanorurkach węglowych. Technika wykrywania wysokiej częstotliwości łagodzi podstawowy efekt ekranowania jonowego (Debye) i umożliwia pracę biosensora z nanorurkami w roztworach o wysokiej sile jonowej, w których zawodzą konwencjonalne bioczujniki elektroniczne. Nasza technologia stanowi unikalną platformę dla elektronicznych bioczujników przyłóżkowych (POC) działających w warunkach fizjologicznie...

Wytwarzanie nanoelektronicznego biosensora wysokiej częstotliwości z nanorurek węglowych do wykrywania w roztworach o wysokiej sile jonowej

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Tutaj prezentujemy technikę obrazowania opartą na fluoroforach, która pozwala na wykrywanie żywotności komórek na nieprzezroczystym tytanowym rusztowaniu, jak również wykrywanie przebłysków zanieczyszczeń rusztowania. Ten protokół rozwiązuje problem z obrazowaniem interakcji komórka-komórka lub komórka-metal na nieprzezroczystych rusztowaniach.

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Przedstawiamy protokół inżynierii fazy koronowej w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych (SWNT) przy użyciu amfifilowych polimerów i DNA do opracowania czujników dla celów molekularnych bez znanych elementów rozpoznających.

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Nanorurki tunelowe (TNT) to przede wszystkim otwarte nanorurki z membraną F-aktyny, które łączą sąsiednie komórki, ułatwiając komunikację międzykomórkową. Godną uwagi cechą, która odróżnia TNT od innych wypukłości komórek, jest unosząca się natura nanorurek między komórkami. W tym miejscu scharakteryzujemy TNT, konstruując widok objętościowy 3D konfokalnych obrazów z-stack.

Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości

Poznaj standaryzowaną metodę wykrywania tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórkowymi i fibroblastami skóry właściwej. Protokół wykorzystuje barwienie błonowe i F-aktyny z obrazowaniem konfokalnym z-stack, umożliwiając powtarzalną detekcję.

Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów