Name: Elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych Montala–Muellera do rejestracji syntetycznego kanału K2P (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj miniaturową platformę BLMchipMM do elektrofizjologii jednokanałowej z zminiaturyzowanym systemem błon lipidowych Montala–Muellera. Ta metoda umożliwia rekonstytucję i analizę kanałów jonowych przy zmniejszonym zużyciu odczynników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Sofii Diletta Guzzeloni za pomoc w procedurze transfekcji komórek. Jesteśmy wdzięczni pracownikom firmy Elements, dr Leonowi Juarezi i dr Michelangelo Paciemu. Praca ta była wspierana przez Departament Medycyny Molekularnej Uniwersytetu w Pawii we Włoszech w ramach inicjatywy Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), przez Fundację Cariplo (#2019-1809) oraz przez program badawczy PNRR CN00000013 „National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing” dla M.L.

F.T. oraz A.P. są odpowiednio dyrektorem generalnym i pracownikiem firmy Elements S.r.l. Pozostali autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy technikę PLB do oceny właściwości elektrofizjologicznych syntetycznego kanału K2P na poziomie pojedynczej cząsteczki. Spośród różnych płaskich modeli lipidowych opisanych w literaturze naukowej, skoncentrowaliśmy się na tworzeniu BLMs, które są nanoszone na otwór o średnicy od 50 do 140 µm, wykonany w pionowej powierzchni niepolarnej oddzielającej dwa przedziały wodne. Konfiguracja ta pozwala na symulację środowiska błony komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu kontroli nad parametrami eksperymentalnymi, w tym nad przygotowaniem błony lipidowej i składem elektrolitu (np. siłą jonową i pH)3. Odtworzyliśmy BLMs, stosując metodę Montala–Muellera (składania)5, w której błona formuje się spontanicznie, gdy dwie monowarstwy lipidowe, wcześniej rozprzestrzenione na granicy powietrze–woda dwóch roztworów wodnych, łączą się nad otworem po podniesieniu poziomu wody.
Przedstawiony tutaj protokół tworzenia membrany jest bardzo intuicyjny, jednak kilka krytycznych kroków ma silny wpływ na sukces eksperymentu. Aby zapewnić prawidłowe połączenie elektryczne między BLMchipMM a wzmacniaczem, niezbędne jest unikanie chlorowania końcówek drutów Ag/AgCl wkładanych do gniazd PCB. Podczas montażu BLMchipMM niewłaściwe rozmieszczenie drutów może doprowadzić do kontaktu z obudową wzmacniacza, co skutkuje zwarciami i nasyceniem sygnału. Innym krytycznym czynnikiem jest procedura wstępnego przygotowania otworu: nadmierna siła podczas nakładania roztworu do wstępnego przygotowania może uszkodzić przegrodę poliimidową, natomiast niewłaściwa obsługa roztworu elektrolitu – w szczególności namoczenie obszaru otworu – może utrudnić tworzenie membrany. Ponadto, dla zapewnienia powtarzalności niezbędne jest dokładne czyszczenie komory pomiarowej BLMchipMM. Zastosowanie 100% alkoholu izopropylowego, a następnie dokładne płukanie i całkowite osuszenie gwarantuje, że pozostałości nie będą zakłócać kolejnych eksperymentów.
Możliwe są liczne modyfikacje protokołu. Choć chlorowanie poprzez moczenie w wybielaczu stanowi praktyczne i powszechnie stosowane podejście, można również zastosować alternatywne metody, takie jak galwanizacja43. Podobnie możliwe są modyfikacje w zakresie wstępnego przygotowania i preparacji lipidów. Standardowe roztwory do wstępnego przygotowania zazwyczaj składają się z długołańcuchowych alkanów rozpuszczonych w lotnych rozpuszczalnikach węglowodorowych36; mimo że powszechnie stosuje się 1% roztwór heksadekanu w n-heksanie, odpowiednie mogą być również inne rozpuszczalniki. Skład lipidów można również dostosować w zależności od wymagań eksperymentalnych. Podczas gdy lipidy DPhPC zapewniają optymalną stabilność błony, można stosować alternatywne mieszaniny lipidów, w tym składniki naturalne lub syntetyczne36. Kluczową zaletą pionowych dwuwarstw lipidowych formowanych metodą składania jest możliwość tworzenia błon asymetrycznych, w których każda warstwa składa się z innych gatunków lipidów5,22, co jest cechą znaną z wpływania na funkcję białek błonowych.
Rozwiązywanie problemów z formowaniem się błony zazwyczaj polega na regulacji poziomów fazy wodnej. Jeśli błona nie utworzy się początkowo, wielokrotne obniżanie i podnoszenie poziomu buforu w jednej komorze może ułatwić montaż dwuwarstwy. W przypadku niepowodzenia, wprowadzenie pęcherzyka powietrza nad otworem może wspomóc redystrybucję lipidów i formowanie błony. Utrzymujące się problemy zazwyczaj wskazują na kwestie związane z przygotowaniem wstępnym lub zanieczyszczeniem, w takim przypadku zaleca się oczyszczenie komory pomiarowej i ponowne rozpoczęcie eksperymentu.
Podstawowe elementy tej konfiguracji obejmują kompaktowy wzmacniacz eNPR 100 kHz oraz BLMchipMM. Wzmacniacz jest kompaktowym, niskoszumowym systemem do zaciskania napięcia (voltage-clamp), który eliminuje potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń zewnętrznych, w tym zewnętrznych klatek Faradaya, ponieważ obudowa wzmacniacza zapewnia skuteczne ekranowanie elektromagnetyczne. BLMchipMM to wstępnie zmontowana, zminiaturyzowana komora rejestracyjna zintegrowana z płytką PCB w celu bezpośredniego połączenia ze wzmacniaczem. Składa się ona z dwóch przedziałów w kształcie litery C, oddzielonych polimidową przegrodą z lejkowatym otworem wykonanym laserowo, w którym tworzona jest sztuczna membrana. Zredukowane wymiary systemu, z objętością przedziałów wynoszącą około 110 µL, znacząco zmniejszają zużycie odczynników i redukują pojemność wewnętrzną, co poprawia jakość sygnału. Ponadto urządzenie można wielokrotnie wykorzystywać bez konieczności demontażu, pod warunkiem przestrzegania odpowiednich procedur czyszczenia, co zmniejsza zmienność i zwiększa powtarzalność eksperymentów.
Mimo tych zalet należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Obecna konfiguracja nie zawiera zintegrowanych modułów kontroli temperatury, ciśnienia ani perfuzji. Wykazano, że wewnętrzne napięcie błony wpływa na kanały mechanosensytywne, takie jak TREK144,45,46; jednakże obecny układ nie obejmuje kontrolowanej manipulacji napięciem błony, w związku z czym nie wyciągnięto tutaj wniosków mechanistycznych. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta stanowi niezawodny i dostępny system do rejestracji aktywności kanałów jonowych w błonach sztucznych. W niniejszym badaniu zbadaliśmy syntetyczny kanał K2P ancTREK1, będący obliczeniowo zrekonstruowanym kanałem przodkiem podrodziny TREK. Dane z rejestracji wykazują, że oczyszczone białko ancTREK1 zrekonstytuowane w PLB wykazuje zachowanie pojedynczego kanału zgodne z raportowanymi właściwościami przewodnictwa typu TREK1. W symetrycznych warunkach 200 mM potasu, bez Mg2+, kanał wykazuje mierzalną zależność I–V, z wartościami amplitudy wynoszącymi około 13 pA przy 80 mV i −19 pA przy −80 mV. Dodatkowo ancTREK1 wykazuje charakterystyczny tryb wysokiego przewodnictwa obserwowany w kanałach TREK1, z wyższym przewodnictwem przy potencjałach ujemnych (~205,6 pS) w porównaniu do potencjałów dodatnich (~112,8 pS). Co istotne, ancTREK1 wykazuje zwiększone NPo przy potencjałach dodatnich (0,78 przy 80 mV) i zmniejszone NPo przy potencjałach ujemnych (0,53 przy −80 mV i 0,28 przy −120 mV), co różni się od obserwacji w konfiguracjach wyciętego patcha42. Wyniki te potwierdzają przydatność tego systemu do dowodowej rejestracji pojedynczych kanałów zrekonstytuowanych białek błonowych.

Rekonstytucja kanałów jonowych w sztucznych błonach lipidowych, znanych również jako czarne błony lipidowe (BLM), jest jedną z uznanych technik służących do elektrofizycznej charakterystyki kanałów jonowych na poziomie pojedynczych cząsteczek1. Zalety BLM wynikają z ich budowy. Płaska błona lipidowa (PLB) powstaje w porze w powierzchni niepolarnej, oddzielając dwa roztwory ciekłe. Dzięki temu, naśladując błonę biologiczną, umożliwia ona rejestrację aktywności kanałów jonowych w ściśle kontrolowanych warunkach, w tym przy określonym składzie lipidowym błony oraz stężeniach elektrolitów lub związków chemicznych, pozostając jednocześnie dostępną z obu stron. Taka dostępność pozwala również na bezpośrednie wprowadzanie kanałów jonowych, na przykład z roztworu micelarnego lub poprzez fuzję indukowaną liposomami2,3.
Pierwszy opisany system sztucznej błony został stworzony przy użyciu techniki malowania4, w której kropla lipidów rozpuszczonych w nietulnym organicznym rozpuszczalniku jest nanoszona pędzlem na niewielki otwór. Następnie dodanie roztworu wodnego po obu stronach otworu prowadzi do spontanicznego utworzenia się lipidowej dwuwarstwy. Istotną wadą tej metody jest jednak obecność śladów rozpuszczalnika, które mogą wpływać na właściwości błony. Aby zmniejszyć ilość pozostałego organicznego rozpuszczalnika w lipidowych dwuwarstwach, opracowano metodę składania5, umożliwiającą tworzenie BLM „wolnych od rozpuszczalnika”. W tym podejściu roztwór lipidów w lotnym rozpuszczalniku rozprowadza się na powierzchni wody w celu utworzenia dwóch monowarstw, a poprzez stopniowe podnoszenie poziomu fazy wodnej powyżej otworu, monowarstwy lipidowe składają się nad otworem, tworząc dwuwarstwę. Jednak mimo że otrzymana BLM jest definiowana jako wolna od rozpuszczalnika, pomyślne utworzenie dwuwarstwy wymaga wstępnego potraktowania otworu cienką warstwą nietulnego rozpuszczalnika. Podstawowym elementem wymaganym do tych eksperymentów jest komora pomiarowa z dwiema przegrodami wodnymi (zazwyczaj określanymi jako cis i trans), oddzielonymi lipofilną przegrodą z niewielkim otworem (średnicy 50–250 µm) (Rysunek 1). Do każdej przegrody wprowadza się elektrody srebro/chlorek srebra (Ag/AgCl). Po zanurzeniu w roztworze elektrolitu elektrody te ustanawiają połączenie elektrochemiczne między lipidową dwuwarstwą a aparaturą pomiarową. Ta ostatnia składa się z wzmacniacza clamp napięciowego, który umożliwia precyzyjną kontrolę potencjału przezbłonowego oraz jednoczesny pomiar prądów jonowych przepływających przez wbudowane białka tworzące pory.
<img alt="Schemat kanału jonowego w lipidowej dwuwarstwie; układ elektrofizjologiczny; analiza stanów zamkniętego/otwartego kanału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat układu elektrofizjologicznego do badania płaskich dwuwarstw lipidowych (PLB). Schemat niezbędnych komponentów wymaganych do eksperymentów PLB. Komora pomiarowa składa się z dwóch przedziałów wodnych (cis i trans) oddzielonych lipofilową przegrodą zawierającą otwór, w którym tworzy się dwuwarstwa lipidowa. Elektrody srebrowe/chlork srebru (Ag/AgCl) są zanurzone w roztworze elektrolitu w każdym z przedziałów. Jedna elektroda przykłada bodźce napięciowe (np. przebiegi sinusoidalne, prostokątne lub trójkątne), podczas gdy druga, uziemiona, jest połączona z przetwornikiem prąd-napięcie, który przekształca prąd jonowy w proporcjonalny sygnał napięcia. Sygnał jest wzmacniany, opcjonalnie filtrowany, digitalizowany i rejestrowany w celu monitorowania i analizy w czasie rzeczywistym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Opracowano również inne metody tworzenia BLM. Jednym z powszechnych podejść jest tworzenie dwuwarstw lipidowych zawieszonych na końcówce pipety do patch-clampu. Odpowiednio, metoda „tip-dip”6 umożliwia utworzenie zawieszonej, wolnej od rozpuszczalnika dwuwarstwy lipidowej na otworem szklanej mikropipety o średnicy ~4 µm poprzez wielokrotne zanurzanie końcówki w monowarstwie lipidowej na granicy fazy powietrze-woda, co pozwala na przechwycenie pojedynczej warstwy podczas każdego przejścia. Technika patch-clamp była również stosowana do pomiarów pojedynczych kanałów w dwuwarstwach lipidowych. Na przykład w metodzie „punch-out”7 szklana pipeta o średnicy od 10 do 80 µm jest wykorzystywana do „załatania” dużej membrany, która została pierwotnie naniesiona na otwór w komorze rejestracyjnej. Alternatywnie, metoda liposomalnego patchu polega na wykorzystaniu wcześniej utworzonego pęcherzyka o rozmiarze od nano- do mikroskalowego jako BLM wolnego od rozpuszczalnika8,9. W szczególności gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe były szeroko stosowane do rejestracji pojedynczych kanałów w różnych konfiguracjach patch-clampu, w tym w trybach cell-attached oraz excised patch10,11.
Powstało również kilka platform umożliwiających równoległe i zautomatyzowane tworzenie wielu dwuwarstw. Jednym z takich podejść jest technika dwuwarstwy na styku kropel (DIB, droplet interface bilayer)12, w której krople wodne umieszcza się w mieszaninie lipidowo-rozpuszczalnikowej. W tej metodzie monowarstwy lipidowe samoistnie gromadzą się wokół kropel, a tworzenie dwuwarstwy następuje w momencie zetknięcia się dwóch kropel. W niektórych konfiguracjach DIB mogą być tworzone na hydrożelach w celu poprawy stabilności błony13. Alternatywnym podejściem opartym na tworzeniu DIB na końcówce szklanej pipety jest metoda dwuwarstwy bąbelkowej kontaktowej (CBB, contact bubble bilayer)14, w której bąbelki wodne są wprowadzane do fazy olejowej za pomocą dwóch mikropipet. Podobnie jak w podejściu DIB, dwuwarstwa lipidowa tworzy się samoistnie, gdy dwa pokryte lipidami bąbelki zostaną ze sobą zetknięte. Inną platformę reprezentują systemy BLM w układach macierzowych, które składają się z macierzy dobrze zdefiniowanych porów o rozmiarach od mikro- do nanometrycznych, rozmieszczonych w układzie siatki. W systemach tych zawieszone dwuwarstwy lipidowe mogą być tworzone albo ręcznie — stosując techniki malowania lub składania, albo poprzez pękanie pęcherzyków liposomalnych15,16,17 — albo automatycznie poprzez sekwencyjne wstrzykiwanie roztworów lipidów i buforów w połączeniu ze strukturami kanałów mikrofluidycznych18,19.
Choć opracowano wiele metod tworzenia bezrozpuszczalnikowych BLM, w niniejszej pracy skupiamy się na metodzie składania (folding method) zaimplementowanej w zminiaturyzowanej i zintegrowanej platformie w celu zbadania zachowania pojedynczych kanałów białek błonowych osadzonych w sztucznej dwuwarstwie lipidowej. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu zestawu Elements, który składa się z dwóch komponentów: czytnika nanoporów Elements (wzmacniacz eNPR) oraz BLMchipMM (Ryc. 2A i Ryc. 2B). Pierwszy z nich jest kompaktowym, niskoszumowym wzmacniaczem typu voltage-clamp, który upraszcza przestrzeń roboczą, stanowiąc kompletną i niezależną jednostkę, co eliminuje potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń zewnętrznych. BLMchipMM to wstępnie zmontowany i zminiaturyzowany system zaprojektowany dla techniki Montala–Muellera, pełniący funkcję interfejsu eksperymentalnego. Składa się on z przezroczystej komory pomiarowej z polimetakrylanu metylu (PMMA) zintegrowanej z płytką drukowaną (PCB), która zawiera dwa gniazda przeznaczone na druty Ag/AgCl służące jako elektrody do bezpośredniego połączenia ze wzmacniaczem. Rdzeń struktury komory stanowi przegroda polimidowa uszczelniona między dwoma przezroczystymi komponentami PMMA. Przegroda ma grubość 50 µm, z wyjątkiem niewielkiego obszaru centralnego (3,78 mm2), gdzie grubość została zredukowana do 25 µm w celu ułatwienia formowania dwuwarstwy. W centrum tego cieńszego obszaru, za pomocą wiercenia laserowego, wykonano stożkową aperturę, co zwiększa stabilność mechaniczną dwuwarstwy lipidowej20,21. Dostępne są cztery średnice apertur (50, 75, 100 i 140 µm), co umożliwia dostrojenie pojemności błony (Tabela 1). Każdy komponent PMMA posiada jamę w kształcie litery C o objętości 110 µL, tworząc dwie komory fluidyczne po obu stronach przegrody polimidowej do przechowywania roztworu elektrolitu. W każdym bloku PMMA, po przeciwnych stronach, wywiercono dwa skośne kanały fluidyczne: jeden służy do wprowadzenia elektrody Ag/AgCl, a drugi umożliwia ręczną regulację poziomu buforu w zbiorniku za pomocą pipetowania.
<img alt="Urządzenie mikrofluidyczne z modułową komorą; schemat przedstawia stronę PMMA, elektrody, PCB do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: System Elements Nanopore Reader i BLMchipMM. (A) Fotografia przedstawiająca BLMchipMM włożony do dedykowanego gniazda wzmacniacza Elements Nanopore Reader (eNPR). (B) Schematyczne przedstawienie komponentów BLMchipMM, w tym komory pomiarowej z polimetakrylanu metylu (PMMA), przegrody polimidowej zawierającej mikroaperturę oraz płytki drukowanej (PCB) z gniazdami dla elektrod Ag/AgCl i szczeliną do wyrównania komory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Średnica otworu (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grubość otworu (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typowa pojemność błony (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Charakterystyka dostępnych formatów apertur BLMchipMM. Średnica otworu, grubość przegrody w obszarze apertury oraz typowe wartości pojemności błony dla urządzeń BLMchipMM z aperturami 50, 75, 100 i 140 µm. Wartości pojemności błony przedstawiono dla dwuwarstw utworzonych z lipidów 1,2-difitanoylo-sn-glycero-3-fosfocholinowych.
Komory pomiarowe stosowane zazwyczaj w laboratoriach są albo jednostkami wykonanymi samodzielnie, albo urządzeniami dostępnymi w sprzedaży. W pierwszym przypadku budowa systemu wiąże się z montażem różnych komponentów oraz opracowaniem niezawodnej metody tworzenia otworu w przegrodzie, co może ograniczać dostępność takiej metody dla wielu laboratoriów. Nawet w przypadku korzystania z urządzeń komercyjnych często wymagana jest ręczna integracja wielu elementów przed każdym eksperymentem. W przeciwieństwie do nich, BLMchipMM jest wstępnie zmontowany i nie wymaga demontażu pomiędzy eksperymentami w celu przeprowadzenia rutynowych procedur czyszczenia. Ta sama jednostka może być myta i wykorzystywana wielokrotnie w wielu eksperymentach bez pogorszenia jakości tworzenia błony, pod warunkiem, że stosowane rozpuszczalniki są kompatybilne z materiałami urządzenia. Zmniejsza to zmienność zależną od użytkownika i minimalizuje ryzyko wycieków związanych z ręcznymi elementami uszczelniającymi. Zastosowanie zewnętrznych, wymiennych i regenerowalnych elektrod z drutu srebrnego dodatkowo wydłuża czas użytkowania systemu, szczególnie w warunkach eksperymentalnych przyspieszających zużycie elektrod.
Co więcej, urządzenia wykonane domowymi sposobami często charakteryzują się dużymi objętościami komór, co zwiększa ilość komponentów biologicznych i chemicznych wymaganych do przeprowadzenia eksperymentów. W przeciwieństwie do nich, miniaturyzacja BLMchipMM pozwala na zminimalizowanie objętości doświadczalnych, co znacząco redukuje zużycie odczynników, białek i innych związków. Jest to szczególnie korzystne w przypadku pracy z białkami błonowymi, których ekspresja jest utrudniona lub które charakteryzują się niską wydajnością, a także gdy wysoki koszt syntezy związków testowych zwiększa całkowity koszt badań. Co istotne, BLMchipMM umożliwia tworzenie dwuwarstw z minimalną ilością rozpuszczalnika i wspiera asymetryczne konfiguracje błon, w których każda warstwa może składać się z innych gatunków lipidów5,22, co ułatwia badanie funkcji białek błonowych w kontrolowanych warunkach.
Tradycyjnie pomiary prądu wykonuje się przy użyciu wzmacniaczy przeznaczonych do eksperymentów patch-clamp, które często wymagają podłączenia do osobnego digitalizera w celu akwizycji danych i sterowania za pomocą interfejsów graficznych. Systemy te są nie tylko nieporęczne i kosztowne, ale często wiążą się również z nieintuicyjnymi procedurami konfiguracji dla użytkowników niebędących ekspertami. Ponadto, ze względu na rozmiar komory rejestracyjnej i konstrukcję standardowych wzmacniaczy — które zazwyczaj nie posiadają wbudowanego ekranowania chroniącego wejście stopnia przedwzmacniacza przed zakłóceniami elektrostatycznymi — często niezbędne jest zastosowanie zewnętrznej klatki Faradaya. Jakość i uziemienie takiej klatki mogą znacząco wpływać na poziom szumów systemu. BLMchipMM, stosowany z kompaktowym zintegrowanym wzmacniaczem, upraszcza tę konfigurację, ograniczając potrzebę stosowania zewnętrznych komponentów. Digitalizacja sygnału odbywa się wewnątrz urządzenia, a obudowa systemu zapewnia ekranowanie, które zmniejsza podatność na zakłócenia elektromagnetyczne z otoczenia.
Aby zademonstrować przydatność tej platformy, jako białko testowe do walidacji skutecznej rekonstytucji i rejestracji pojedynczych kanałów wykorzystano ancTREK1 — kanał typu K2P będący obliczeniowo wyznaczonym przodkiem podrodziny TREK (Supplementary Figure 1). Kanały K2P tworzą dimeryczne kanały przeciekowe dla potasu, które regulują spoczynkowy potencjał błonowy oraz pobudliwość komórkową, przy czym kanały TREK stanowią dobrze scharakteryzowaną podrodzinę.

<table><tbody><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholina (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Tworzenie sztucznych dwuwarstw lipidowych</td></tr><tr><td>2-Propanol (&amp;ge;99,5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Czyszczenie urządzenia BLMchipMM</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Przygotowanie żeli agarozowych</td></tr><tr><td>System poziomej elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Rozdział fragmentów DNA</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Selekcja bakterii transformowanych</td></tr><tr><td>Żywica Sepharose z nanociałem przeciw-GFP (własna produkcja)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Oczyszczanie powinowactwa białek z etykietą GFP</td></tr><tr><td>Anza Alkaline Phosphatase</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Defosforylacja wektora</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Trawienie restrykcyjne</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Trawienie restrykcyjne</td></tr><tr><td>Anza Red Buffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Bufor do trawienia restrykcyjnego</td></tr><tr><td>Aprotynina (inhibitor proteaz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Zapobieganie degradacji białek</td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Wirowanie komórek i przygotowanie próbek</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Tworzenie płaskich dwuwarstw lipidowych</td></tr><tr><td>Hemisukcynian cholesterolu (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Stabilizacja białek błonowych</td></tr><tr><td>Błękit Coomassie (Coomassie Brilliant Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Barwienie białek</td></tr><tr><td>Zwykły domowy wybielacz</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Chlorowanie drutów Ag</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Zmniejszenie lepkości lizatu</td></tr><tr><td>Woda dwukrotnie destylowana</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Przygotowanie buforów i roztworów</td></tr><tr><td>Etanol (czysty, 99,9%)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Czyszczenie drutów Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Papier ścierny o bardzo drobnej ziarnistości</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Usuwanie powłoki Ag/AgCl z drutów</td></tr><tr><td>Wzmacniacz eNPR 100 kHz</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Rejestracje elektrofizjologiczne</td></tr><tr><td>Zestaw Gel-Out do ekstrakcji DNA z agarozy</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Marker wielkości DNA GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>Referencja wielkości DNA</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Ekspresja białka ancTREK1</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td> substancja buforująca</td></tr><tr><td>Heksadekan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Obróbka wstępna otworu</td></tr><tr><td>Heksan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Rozpuszczalnik lipidowy</td></tr><tr><td>Własny barwnik do ładowania DNA 5&amp;times;</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Przygotowanie próbek DNA</td></tr><tr><td>Własny bufor SDS Laemmli 6&amp;times; (redukujący)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Przygotowanie próbek białek</td></tr><tr><td>Własny roztwór do odbarwiania</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Odbarwianie żeli SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Własna proteaza HRV-3C</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Odcinanie białek fuzyjnych</td></tr><tr><td>Własny bufor do prowadzenia SDS-PAGE (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Bufor do elektroforezy SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Elucja białek z etykietą His</td></tr><tr><td>Kolumny do oczyszczania in-batch</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Procedury oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsowy Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Wzrost kultur komórkowych</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Przygotowanie elektrolitów i buforów</td></tr><tr><td>Pożywka LB (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Kultura bakteryjna</td></tr><tr><td>Leupeptyna (inhibitor proteaz)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Zapobieganie degradacji białek</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Składnik buforu</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Ilościowe oznaczanie DNA i białek</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-maltosyd (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilizacja białek błonowych</td></tr><tr><td>Żywica Ni Sepharose High Performance</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>Oczyszczanie IMAC</td></tr><tr><td>Notebook (komputer)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Sterowanie instrumentami i akwizycja danych</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima LE-80K</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Izolacja frakcji błonowej</td></tr><tr><td>Pentan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Rozpuszczalnik lipidowy</td></tr><tr><td>Pepstatyna A (inhibitor proteaz)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Zapobieganie degradacji białek</td></tr><tr><td>Bufor Phusion GC (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>Bufor do PCR</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>PMSF (inhibitor proteaz)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Ochrona białek podczas lizy</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Gotowy żel ProteinEle Tris-Glicyna (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Rozdział białek</td></tr><tr><td>System elektroforezy żelowej SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Elektroforeza białek</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Wzmacniacz ekspresji białek</td></tr><tr><td>Ligaza T4 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>Ligacja DNA</td></tr><tr><td>Bufor do ligazy T4 DNA (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Bufor do ligacji</td></tr><tr><td>Termocykler (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>Amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Przygotowanie buforów</td></tr><tr><td>Agar sojowy Tryptone SOYA z lecytyną i polisorbatem 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Wysiew bakterii</td></tr><tr><td>Dwa druty Ag</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektrody do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Koncentrator Ultra-spin (cutoff 50 kDa)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Koncentracja białek</td></tr><tr><td>Wektor ekspresyjny pEG BacMam</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Ekspresja białek</td></tr><tr><td>Kabel USB</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Połączenie między wzmacniaczem a komputerem</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych montala–muellera do rejestracji syntetycznego kanału k2p

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

Funkcjonalna rekonstytucja kanałów jonowych w płaskich dwuwarstwach lipidowych stanowi strategię badania aktywności kanałów na poziomie pojedynczych cząsteczek. Jednak konwencjonalne systemy dwuwarstw Montala-Muellera zazwyczaj wymagają rozbudowanych układów eksperymentalnych, ręcznego montażu komór oraz stosunkowo dużych objętości rejestracyjnych, co zwiększa zużycie odczynników i może wprowadzać dodatkowe źródła szumów elektrycznych ze względu na rozległe okablowanie i zewnętrzne przedwzmacniacze. W niniejszej pracy przedstawiamy zminiaturyzowaną, gotową do użycia platformę dwuwarstwową (BLMchipMM) zintegrowaną z kompaktowym wzmacniaczem, która umożliwia stabilne pomiary pojedynczych kanałów przy zmniejszonym zużyciu odczynników i uproszczonej obsłudze. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tego systemu do przeprowadzania elektrofizjologicznych pomiarów pojedynczych kanałów. Wykorzystując ten system, dokonaliśmy rekonstytucji syntetycznego kanału K2P (ancTREK1), który posłużył jako białko testowe w celu walidacji rekonstytucji oraz rejestracji pojedynczych kanałów. Pomiary pojedynczych kanałów wykazują zależność prądowo-napięciową w symetrycznych roztworach K+ wolnych od Mg2+, z wartościami przewodnictwa zgodnymi z tymi raportowanymi dla kanałów TREK1. Pomyślna rekonstytucja tego kanału typu K2P demonstruje użyteczność tego systemu do analizy pojedynczych kanałów w membranach sztucznych.

Charakterystyka prądowo-napięciowa (I–V) błon PLB
Wewnętrzna hydrofobowa natura błon dwuwarstwowych sprawia, że są one nieprzepuszczalne dla gatunków naładowanych. Jednakże przyłożenie zewnętrznego pola elektrycznego może indukować tworzenie się przejściowych porów o rozmiarach nanometrycznych, wpływając tym samym na przepuszczalność i przewodnictwo błony33. Aby ocenić jakość sztucznych dwuwarstw utworzonych z lipidów 1,2-difitanoylo-sn-glicero-3-fosfocholiny, wyznaczono pojemność, opór oraz charakterystyki I-V błony wykluczając obecność wbudowanych białek. Zastosowano serię skoków napięcia w zakresie od ±20 do ±200 mV (w przyrostach ±20 mV) i zarejestrowano wynikające z nich prądy transbłonowe. Próbkowanie danych odbywało się z częstotliwością 5 kHz, a następnie zastosowano filtr dolnoprzepustowy o odcięciu 2,5 kHz.
Pojemność błony (Cm) oraz oporność błony (Rm) stanowią kluczowe parametry służące do oceny jakości dwuwarstwy. PLB można opisać za pomocą równoważnego obwodu rezystorowo-kondensatorowego (RC), w którym błona zachowuje się jak kondensator połączony równolegle z rezystorem34. Komponent pojemnościowy odzwierciedla zdolność błony do magazynowania ładunku, natomiast komponent rezystywny odzwierciedla przepuszczalność jonową. Przyłożenie trójkątnego przebiegu napięcia generuje prostokątny prąd pojemnościowy, który jest proporcjonalny do pojemności błony zgodnie z zależnością:
<img alt="Wzór na prąd pojemnościowy I_c=C_m(dv/dt), ilustrujący analizę obwodu elektrycznego." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Równanie 1">    (1)
Tutaj Cm oznacza pojemność błony, V jest przyłożonym napięciem, a t to czas. Po sformowaniu błony wartości pojemności mogą zwiększać się w czasie z powodu stopniowego cieńczenia dwuwarstwy35. Przyjmując, że błona stanowi kondensator płytkowy, pojemność jest powiązana z powierzchnią i grubością błony zgodnie z zależnością:
<img alt="Wzór na pojemność z lipidami, równanie, schemat edukacyjny, przenikalność dielektryczna." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Równanie 2">    (2)
Tutaj εlipids to stała dielektryczna rdzenia lipidowego (~2), ε0 to przenikalność elektryczna próżni, A to powierzchnia błony, a d to grubość błony36,37.
Oporność membrany wyznaczono zgodnie z prawem Ohma33:
<img alt="Równanie siły elektromotorycznej Ir=V/Rm, schemat edukacyjny dla oporu elektrycznego." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Równanie 3">    (3)
Tutaj V oznacza przyłożone napięcie, a Rm oporność błony. W przypadku braku kanałów jonowych prąd błonowy pozostaje bliski 0 pA, co odpowiada wartościom oporności z zakresu gigaomów (GΩ)33.
Zależność I–V wykazywała liniową charakterystykę (ohmiczną) w zakresie od 0 do ±200 mV dla urządzeń BLMchipMM z aperturami o średnicach 75 i 100 µm. Liniowe dopasowanie danych pozwoliło uzyskać wartości oporu błony wynoszące 847 ± 16 GΩ (n = 6) dla apertury 75 µm (Ryc. 8A, koła) oraz 980 ± 32 GΩ (n = 7) dla apertury 100 µm (Ryc. 8A, kwadraty). Wartości szumów RMS, mierzone w 3 s segmentach zapisu prądu, wynosiły 3,1 ± 2 pA (n = 7) dla apertury 100 µm oraz 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) dla apertury 75 µm. Stabilność błony oceniano poprzez pomiar oporu w odstępach około 2 min przez całkowity czas 1 h (Ryc. 8B). Prawidłowo uformowane błony pozostawały stabilne konsekwentnie przez ponad 1 h, co jest wystarczające dla większości eksperymentów elektrofizjologicznych. Błony zazwyczaj tolerowały przyłożone potencjały do ±200 mV bez oznak niestabilności, podczas gdy przebicie następowało między ±220 a ±300 mV, w zależności od poszczególnej dwuwarstwy. Błony uznawano za odpowiednie do insercji białek, gdy wartości pojemności mieściły się w zakresie od 40 do 60 pF dla apertur 75 µm oraz od 60 do 90 pF dla apertur 100 µm, przy wartościach prądu ≤0,5 pA przy 100 mV.
<img alt="Wykresy napięcie-prąd i oporność-czas, badanie chipa z membraną dwuwarstwową, wyniki analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Charakterystyka elektryczna PLB. (A) Zależności prąd–napięcie (I–V) dla dwuwarstw utworzonych na otworach o średnicy 75 µm i 100 µm, wykazujące liniowe (ohmiczne) zachowanie w zakresie ±200 mV. Regresja liniowa pozwala wyznaczyć wartości oporności membrany odpowiednio 847 ± 16 GΩ (n = 6) i 980 ± 32 GΩ (n = 7). (B) Stabilność membrany oceniona poprzez monitorowanie oporności przez 1 h w odstępach 2 min. Membrany pozostają stabilne do ±200 mV i ulegają przerwaniu przy napięciach między ±220 a ±300 mV. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Wstępna charakterystyka zachowania pojedynczego kanału ancTREK1
Syntetyczny ancTREK1 został oczyszczony i wbudowany w PLB, a aktywność pojedynczego kanału monitorowano przy użyciu protokołów skoków napięcia w zakresie od −120 do 120 mV w przyrostach 20 mV. Rejestracje pojedynczych kanałów (Rycina 9A i Rycina 9B) ujawniły charakterystyczne zachowanie typu „flickering” kanałów K2P38. Przy 80 mV średnia amplituda prądu wynosiła 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), podczas gdy przy −80 mV amplituda prądu wzrosła do −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Rycina 9C). Wynikowa relacja I–V wykazała mierzalne prądy pojedynczego kanału zarówno przy potencjałach dodatnich, jak i ujemnych w symetrycznych warunkach 200 mM potasu bez Mg2+ (Rycina 9D). Ponieważ amplitudy prądu szacowano na podstawie histogramów wszystkich punktów z rejestracji nabytych przy 5 kHz i przefiltrowanych filtrem dolnoprzepustowym przy 2,5 kHz, powyższa relacja I–V jest przedstawiona jako opisowy dowód koncepcji, a nie jako wyczerpująca charakterystyka biofizyczna.
<img alt="Analiza aktywności kanałów jonowych; wykres przebiegów prądowych i histogramy amplitud przy +80mV, -80mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Aktywność pojedynczego kanału syntetycznego ancTREK1. (A i B) Reprezentatywne zapisy prądów pojedynczego kanału zarejestrowane odpowiednio przy 80 mV i −80 mV. Linie przerywane wskazują poziom zamknięcia kanału. (C) Histogramy amplitud wszystkich punktów dla potencjałów dodatnich (lewo) i ujemnych (prawo). (D) Zależność I–V dla ancTREK1 w symetrycznych warunkach 200 mM potasu (K+) bez kationów dwuwartościowych. Krzywą dopasowano za pomocą wielomianu czwartego stopnia, a wartości przewodności wyliczono z nachylenia przy ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Mimo że ancTREK1 nie posiada rozbudowanych regionów N- i C-terminalnych w porównaniu do ssaczych kanałów TREK1, pozostał on funkcjonalnie aktywny po rekonstytucji. W przeciwieństwie do ssaczego TREK1, który wykazuje tryby wysokiej i niskiej przewodności (odpowiednio 132 ± 5 pS i 41 ± 5 pS przy potencjałach dodatnich)39, ancTREK1 wykazywał jedynie tryb dużej przewodności. Przewodność pojedynczego kanału przy potencjałach dodatnich wynosiła 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), co jest zgodne z raportowanymi wartościami dla kanałów TREK (85–130 pS w symetrycznych warunkach potasowych)38,39,40,41. Przy potencjałach ujemnych przewodność wzrosła do 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), co zgadza się z wcześniej opisanym zachowaniem TREK139. Co istotne, ancTREK1 wykazywał wyższe znormalizowane prawdopodobieństwo otwarcia (NPo) w porównaniu do pomiarów TREK1 uzyskanych przy użyciu konfiguracji wyciętego patcha (excised patch)42. Zależność NPo od napięcia wykazała zwiększoną aktywność kanałów przy potencjałach dodatnich, osiągając wartość 0,78 ± 0,02 (n = 5) przy 80 mV. W przeciwieństwie do tego, NPo spadało przy potencjałach ujemnych, osiągając wartości 0,53 ± 0,04 przy −80 mV oraz 0,28 ± 0,03 przy −120 mV (Rycina 10).
<img alt="Wyniki elektrofizjologii kanałów jonowych, wykres NPo w funkcji napięcia (mV), porównanie na wykresie słupkowym, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 10"> 
Rysunek 10: Analiza zależności napięciowej aktywności pojedynczych kanałów ancTREK1. Znormalizowane prawdopodobieństwo otwarcia (NPo) jako funkcja potencjału błonowego (lewo) oraz porównanie NPo przy 80 mV i −80 mV (prawo), wykazujące zwiększone otwieranie kanałów przy potencjałach dodatnich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1. Sekwencja aminokwasowa syntetycznego przodka kanału potasowego z dwiema domenami porów (K2P) (ancTREK1). Pełna sekwencja aminokwasowa ancTREK1 wykorzystana do pomiarów elektrofizjologicznych. Sekwencja została zrekonstruowana poprzez wnioskowanie o sekwencji przodka z wyselekcjonowanego zbioru danych członków rodziny TREK/TRAAK, obejmującego sekwencje ortologiczne pobrane z baz danych UniProt i NCBI, przefiltrowane pod kątem konserwowanych motywów porów, dopasowane i przeanalizowane przy użyciu filogenetyki metodą największej wiarygodności.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie zminiaturyzowanego systemu płaskich dwuwarstw lipidowych Montala–Muellera z wbudowanym wzmacniaczem do przeprowadzania stabilnych pomiarów z pojedynczego kanału. Metoda została zademonstrowana poprzez rekonstytucję oczyszczonego syntetycznego kanału K2P w celu walidacji wydajności systemu.

Elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych Montala–Muellera do rejestracji syntetycznego kanału K2P

Funkcjonalna rekonstytucja kanałów jonowych w płaskich dwuwarstwach lipidowych stanowi strategię umożliwiającą badanie aktywności kanałów na poziomie pojedynczych cząsteczek. ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu funkcjonowania kanałów jonowych i transporterów z wykorzystaniem zintegrowanych technik biologii strukturalnej i elektrofizjologicznych. Konwencjonalne układy dwuwarstwowe wymagają złożonej aparatury i ręcznego montażu, podczas gdy niniejsza platforma jest zminiaturyzowanym, gotowym do użycia systemem integrującym kompaktowy wzmacniacz.Na początek przygotuj układ elektrofizjologiczny, wykonując kalibrację instrumentów oraz przygotowując elektrody srebrowe lub srebrowo-chlorkowe. Włóż niechlorowane końce dwóch srebrnych drutów do gniazd płytki drukowanej (PCB). Umieść chlorowane końce drutów w kanałach płynowych wywierconych w komponencie z polimetakrylanu metylu (PMMA). Delikatnie obróć chip z czarną błoną lipidową (BLMchipMM) i zamontuj go na płytce PCB, dopasowując dolny ząb komory rejestracyjnej PMMA do odpowiedniego gniazda. Upewnij się, że drut sięga końca kanałów płynowych. Przygotuj 100 µL 1% (v/v) roztworu heksadekanu w 100% n-heksanie do wstępnego przygotowania otworu septa. Resuspenduj lipidy 1,2-difitanoylo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPhPC) w 100% n-pentanie do końcowego stężenia 15 mg/mL. Przygotuj w temperaturze pokojowej el

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K+. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K+ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj miniaturową platformę BLMchipMM do elektrofizjologii jednokanałowej z zminiaturyzowanym systemem błon lipidowych Montala–Muellera. Ta metoda umożliwia rekonstytucję i analizę kanałów jonowych przy zmniejszonym zużyciu odczynników.

Elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych Montala–Muellera do rejestracji syntetycznego kanału K2P (Wideo) | JoVE Journal

Elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych Montala–Muellera do rejestracji syntetycznego kanału K_2P

Przeglądaj więcej filmów