Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown
16 stycznia 2026
Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.
Moje badania koncentrują się na osteosarcomie i mają na celu zbadanie, jak LncRNA-knockdown wpływa na długoterminową zdolność proliferacji za pomocą testów informacji o kolonii. Na początek nasiaj 5 razy 10 do potęgi 5 komórek osteosarcoma 143B do dwóch misek hodowlowych o średnicy 10 centymetrów. Hodować komórki w pełnym DMEM uzupełnionym o surowicy płodowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze 5% dwutlenku węgla.
Przygotuj odczynniki transfekcyjne 24 godziny później, w tym plazmidy, polietyliminę i OptiMinium Essential Medium. Każdy odczynnik zawortuj i pozwól mu wyrównać się do temperatury pokojowej przed użyciem. Teraz oznacz cztery mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra na plazmidy i polietyminę za pomocą markera.
Podaj pipetę 500 mikrolitrów OptiMinium Essential Medium do każdej rurki. Następnie dodaj 10 mikrogramów plazmidu do odpowiedniej probówki plazmidowej i pipetuję 30 mikrolitrów polietyliminy do każdej rurki z polietyliminą. Delikatnie mieszaj każdą probówkę, pipetując w górę i w dół, i inkubuj.
Teraz połącz każdą probówkę plazmidową z odpowiadającą jej rurką polietyliminową. Delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Delikatnie zasysaj pożywkę hodowlową z misek zawierających komórki 143B.
Dodaj siedem mililitrów medium wolnego od surowicy do każdej misy i oznaczaj naczynia zgodnie z plazmidem, który ma być dodany. Dodaj przygotowaną mieszankę transfekcyjną kroplami do odpowiedniego naczynia kulturowego. Dodaj mieszankę powoli, okrężnym ruchem od zewnętrznej krawędzi w kierunku środka naczynia.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z dwutlenkiem węgla o stężeniu 5%. Odrzuć supernatant 8 do 12 godzin później. Następnie dodaj 10 mililitrów kompletnego DMEM do naczynia hodowlanego i inkubuj.
Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym 72 godziny po wymianie podłoża, usuń podłoże z misek hodowlanych. Dodaj 1,5 mililitra trypsyny-EDTA, aby trawić komórki. Komórki delikatnie pipetują, aby je odłączyć.
Następnie dodaj pięć mililitrów kompletnego medium, aby zakończyć trawienie. Przełóż zawiesinę komórkową do rurki mikrowirówki o pojemności 15 milimetrów. Następnie pipetować 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do hemocytometru, aby policzyć komórki.
Zbierz 3 razy 10 do mocy 5 komórek do ekstrakcji kwasu rybonukleinowego, aby zweryfikować skuteczność knockdown. Teraz zasiej 2 razy 10 do potęgi 3 komórek na odwiert do płyty z sześcioma dołami. Pipette kompletuje DMEM do końcowej objętości dwóch mililitrów.
Hodować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenku węgla. Codziennie monitoruj formowanie się kolonii. Zakończ hodowlę, gdy większość kolonii w grupie kontrolnej zawiera co najmniej 50 komórek lub po 10 do 14 dniach inkubacji.
Po odrzuceniu supernatantu przemyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS na dołek, odrzucając roztwór po każdym przemyciu. Utrwal komórki w jednym mililitrze roztworu 10% formaliny przez 15 minut. Usuń utrwalający, a następnie dwukrotnie umyj komórki jednym mililitrem PBS na dołek.
Barw komórki jednym mililitrem roztworu fioletu o stężeniu 0,5% kryształów przez 10 do 30 minut. Następnie delikatnie myj talerz powoli płynącą wodą z kranu. Susz ogniwa na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Uchwyć zdjęcia kolonii aparatem. Skuteczność transfekcji 143B komórek została potwierdzona mikroskopią fluorescencyjną 72 godziny po transfekcji, co wskazuje na efektywne dostarczanie plazmidów w obu warunkach. Analiza reakcji RT-qPCR wykazała, że ekspresja SNHG6 była istotnie obniżona w 143B komórkach transfekowanych shSNHG6 w porównaniu z grupą shNC.
Testy formowania kolonii wykazały istotny spadek liczby i wielkości kolonii w grupie z SNHG6 w porównaniu do grupy kontrolnej. Protokół ten ocenia długoterminową proliferację pojedynczych komórek, zapewniając wyższą istotność biologiczną i bardziej definitywne wyniki niż krótkoterminowe testy proliferacji oparte na metabolizmie. Przyszłe badania rozszerzyą ten protokół o dodatkowe LncRNA i modele nowotworów, aby systematycznie badać mechanizmy regulujące potencjał proliferacyjny komórek nowotworowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół eksperymentalny przedstawia metodę badania wpływu wyciszenia lncRNA na proliferację komórek osteosarcoma za pomocą testów tworzenia kolonii. Podejście to zostało zaprojektowane tak, aby było stabilne, kosztowo efektywne i wydajne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
Wstęp
- Osteosarcoma to rodzaj nowotworu kości, który dotyka przede wszystkim nastolatków i młodych dorosłych.
- Długie niekodujące RNA (lncRNAs) odgrywają istotną rolę w regulacji ekspresji genów i procesów komórkowych.
- Zrozumienie roli lncRNAs w nowotworach może dostarczyć informacji na temat potencjalnych celów terapeutycznych.
- Testy tworzenia kolonii są niezbędne do oceny długoterminowej zdolności proliferacyjnej komórek nowotworowych.
Cel badania
- Ilościowe określenie wpływu wyciszenia lncRNA na proliferację komórek osteosarcoma.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu przeprowadzania testów tworzenia kolonii w tym kontekście.
- Zbadanie mechanizmów regulujących proliferację komórek nowotworowych poprzez oddziaływania lncRNA.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek osteosarkomu 143B plazmidami celującymi w lncRNA.
- Zastosowanie pożywki bezsurowiczej do transfekcji oraz późniejsza hodowla w pełnej pożywce DMEM.
- Analiza tworzenia kolonii w celu monitorowania proliferacji komórek w okresie od 10 do 14 dni.
- Mikroskopia fluorescencyjna oraz RT-qPCR w celu oceny wydajności transfekcji i poziomów ekspresji lncRNA.
Główne wyniki
- Znacząca redukcja ekspresji SNHG6 w komórkach transfekowanych w porównaniu z grupą kontrolną.
- Testy tworzenia kolonii wykazały zmniejszoną liczbę i rozmiar kolonii w grupie z knockdownem lncRNA.
- Protokół wykazał wyższą istotność biologiczną w porównaniu z testami krótkoterminowymi.
- Przyszłe badania rozszerzą to podejście na inne lncRNA oraz modele nowotworowe.
Wnioski
- Niniejszy protokół pozwala skutecznie ocenić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniakokomiarkowca.
- Stanowi on podstawę do dalszych badań nad funkcjami lncRNA w biologii nowotworów.
- Wyniki wskazują, że wyciszenie lncRNA może znacząco wpływać na wzrost i żywotność komórek nowotworowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy tworzenia kolonii stanowią solidną platformę do oceny długoterminowej zdolności proliferacyjnej komórek osteosarcoma po wyciszeniu lncRNA, co bezpośrednio wpływa na walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków w onkologii. Ilościowa ocena proliferacji pojedynczych komórek umożliwia wysoką pewność w rozróżnianiu funkcjonalnych i niefunkcjonalnych celów lncRNA, co wspiera decyzje portfelowe dostosowane do ryzyka. Ten schemat postępowania ma szerokie zastosowanie w ocenie proliferacji regulowanej przez lncRNA w różnorodnych modelach nowotworowych, zwiększając ciągłość translacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę celów lncRNA w modelach osteosarcoma istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera weryfikację mechanistyczną poprzez powiązanie wyciszenia lncRNA z mierzalnymi zmianami zdolności proliferacyjnej.
- Ułatwia priorytetyzację kandydatów lncRNA do dalszej oceny przedklinicznej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia powtarzalny, ilościowy test długoterminowej proliferacji komórek.
- Zapewnia zestandaryzowane wyniki do porównania efektów wyciszenia lncRNA.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków chemicznych lub zaburzeń genetycznych na tworzenie kolonii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki proliferacji in vitro z biologią nowotworu istotną dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu walidacji celu w fazie odkrycia do wyboru modelu przedklinicznego.
- Wspiera rozwój biomarkerów poprzez powiązanie ekspresji lncRNA z funkcjonalnymi skutkami komórkowymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w proces od odkrycia do etapu przedklinicznego, dostarczając zwalidowaną metodę funkcjonalnej oceny celu oraz ilościowych odczytów potencjału proliferacyjnego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji lncRNA w proliferacji komórek osteosarkoma.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane, powtarzalne dane dotyczące tworzenia kolonii w celu selekcji kandydatów.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary liczby i wielkości kolonii do porównań statystycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z doborem modeli in vivo oraz strategiami biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalny test, który można dostosować do innych lncRNA i typów nowotworów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów lncRNA i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje długoterminową ocenę proliferacji przy wysokiej powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie jednoznacznych danych funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów lncRNA do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, transfekcji oraz analizie ilościowej testów.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej, RT-qPCR oraz infrastruktury do obrazowania kolonii.
- Wymaga standaryzacji konfiguracji testów i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych linii komórek nowotworowych i celów lncRNA poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od rygorystycznej analizy statystycznej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności wyników.
