Name: Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj niepromieniotwórczą metodę kolorymetryczną do oceny aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe badania toksykologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcą podziękować dr. Andreasowi Weberowi za jego pracę podczas początkowego opracowania testu DIO1-SK.

<ol><li>Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+endocrine+disruptors+and+their+possible+impacts+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health.</a> Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).</li>
<li>Yue, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exposure+to+a+mixture+of+endocrine+disruptors+and+serum+levels+of+thyroid+hormones%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study.</a> J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).</li>
<li>Köhrle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deiodinase+family%3A+selenoenzymes+regulating+thyroid+hormone+availability+and+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action.</a> Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).</li>
<li>Zhang, J., Lazar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+action+of+thyroid+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of action of thyroid hormones.</a> Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).</li>
<li>França, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+type+1+iodothyronine+deiodinase+%28DIO1%29+mutations+cause+abnormal+thyroid+hormone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism.</a> Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).</li>
<li>Weber, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+predictivity+of+the+DIO1-SK+assay+to+investigate+DIO1+inhibition+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Vitro+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes.</a> Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).</li>
<li>Weber, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+method+to+study+thyroid+hormone+disruption%3A+optimization+and+standardization+of+an+assay+to+assess+the+inhibition+of+DIO1+enzyme+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Vitro+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes.</a> Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).</li>
<li>Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+iopanoic+acid+as+substrate+of+type+1+deiodinase+by+a+novel+nonradioactive+iodide-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay.</a> Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).</li>
<li>Renko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+nonradioactive+screening+method+identifies+genistein+and+xanthohumol+as+potent+inhibitors+of+iodothyronine+deiodinases%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases.</a> Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).</li>
<li>Olker, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+ToxCast+phase+1%2C+phase+2%2C+and+e1k+chemical+libraries+for+inhibitors+of+iodothyronine+deiodinases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases.</a> Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).</li>
<li>Sane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+highly+potent+and+isoenzyme-selective+inhibitors+of+deiodinase+type+I+via+a+nonradioactive+high-throughput+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method.</a> Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).</li>
<li>Visser, T. J., Van Overmeeren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+radioiodinated+propylthiouracil+to+rat+liver+microsomal+fractions%3A+stimulation+by+substrates+for+iodothyronine+5%E2%80%B2-deiodinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase.</a> Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).</li>
<li>Hindrichs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+fast+online+SPE-LC-MS%2FMS+method+to+quantify+thyroid+hormone+metabolites+in+rat+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma.</a> Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).</li>
<li>Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+persulfate-arsenite+method+for+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A modified persulfate-arsenite method for manganese.</a> Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).</li>
<li>Stefanidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+robustness+and+accuracy+of+the+deiodinase+1+Sandell%E2%80%93Kolthoff+assay%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Vitro+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis.</a> Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).</li>
<li>Satya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+standardised+test+guidelines+for+evaluating+chemicals+for+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22OECD+Environ+Health+Saf+Publ%22%5BJournal%5D)">Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption.</a> OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).</li>
<li>Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+in+urine+that+interfere+with+the+Sandell%E2%80%93Kolthoff+assay+for+urinary+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Trace+Elem+Res%22%5BJournal%5D)">Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine.</a> Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).</li>
<li>May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+automated+urinary+iodine+methods%3A+problems+of+interfering+substances+identified%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified.</a> Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).</li>
</ol>

Autorzy K.S., N.H, D.F.-W. oraz R.L. są pracownikami BASF SE, firmy chemicznej, która w przyszłości może wykorzystać test DIO1 do opracowywania i rejestracji produktów komercyjnych.

Test DIO1-SK stanowi nieradioaktywną, opłacalną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnych metod oceny aktywności DIO1, takich jak testy znakowane radioaktywnie czy spektrometria mas. Jego wstępna weryfikacja dla ludzkich mikrosomów wątroby oraz silna zgodność z pomiarami SPE-LC-MS/MS poziomu hormonów tarczycy potwierdzają jego wiarygodność i znaczenie regulacyjne, co odzwierciedla włączenie do planu pracy OECD dotyczącego wytycznych testowych. Prostota reakcji Sandella-Kolthoffa (SK) sprawia, że test jest dostępny dla laboratoriów bez zaawansowanego wyposażenia.
W niniejszym protokole określono kilka praktycznych aspektów bardziej szczegółowo niż wcześniej opublikowane procedury DIO1-SK, aby dodatkowo wspierać odporność i powtarzalność w rutynowym formacie 96-dołkow. Te wyjaśnienia koncentrują się na uzasadnieniu koncepcji kontroli (rozpuszczalnik, kontrola ujemna i dodatnia), decyzji o użyciu świeżo przygotowanych płyt żywicy jonowowymiennej zamiast ponownego użycia wcześniej odlanych płyt oraz warunkach reakcji SK, które poprawiają wytrzymałość obsługi podczas pomiarów wielodołowych płytek, przy jednoczesnym zachowaniu biologicznej interpretacji zgodnej z wcześniejszymi pracami standaryzacyjnymi 6,7.
Pomimo swoich mocnych stron, należy podjąć kilka kluczowych kroków, aby dokładnie określić ilość jodku uwalnianego podczas konwersji rT3 do T2 za pośrednictwem DIO1. Osiąga się to dzięki reakcji Sandella-Kolthoffa, która wymaga precyzyjnego wyczucia czasu i konsekwentnego manipulowania z odczynnikami, aby zapewnić powtarzalność. Reakcja SK to szybki proces kataliczny, w którym jodek przyspiesza redukcję żółtego ceru (IV) do bezbarwnego cerium (III) przez arsenit; Szybkość zmiany koloru jest bezpośrednio proporcjonalna do stężenia jodku. Ponieważ reakcja przebiega szybko po dodaniu roztworu arsenu, niezbędne jest, aby pomiar został rozpoczęty bez zwłoki. W formacie płyty 96-dołowej powolne lub nieregularne dodawanie roztworu arsenu może wprowadzać znaczną zmienność między odwiertami. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej lub automatycznego dozownika, aby zapewnić równomierne i szybkie dodawanie odczynników we wszystkich dołkach.
Aby zmaksymalizować porównywalność między dołkami i między płytkami, kolejność dodawania odczynników w reakcji SK powinna być zgodna z opisanym procesem: cer jest obecny jako podłoże chromogeniczne, a reakcja jest inicjowana przez dodatek arsenitu, który definiuje czas rozpoczęcia i dlatego wymaga szybkiego, zsynchronizowanego dozowania. Kolejność dodawania alternatywnych odczynników nie była oceniana w tym układzie; dlatego zmiana kolejności nie jest zalecana podczas odtwarzania protokołu. Ponadto stężenie cerium może wpływać na praktyczne parametry odczytu SK (np. okno sygnału i odporność). Podczas gdy 25 mM ceru zostało zdefiniowane jako zwalidowany warunek standardowy podczas wcześniejszej standaryzacji testów, wyższe stężenia, takie jak 40 mM, wykazano, że wydłużają okno sygnału i czynnik z′ bez wpływu na wartości IC50 czy interpretację biologiczną, jak opisano już w poprzednich badaniach6. W tym protokole stosuje się cerium 40 mM, aby zapewnić pełną i szybką kompleksację jodku w warunkach testu oraz poprawić odporność i stabilność sygnału podczas rutynowych pomiarów płytowych. Kryteria akceptacji (np. czynnik z′, wartości IC50 referencyjnego inhibitora) opierają się na historycznych wynikach obserwowanych w wcześniejszych badaniach walidacyjnych i mają służyć jako rutynowa kontrola wydajności testu.
Zastosowanie ludzkich mikrosomów wątroby wprowadza zmienność biologiczną, co sprawia, że standaryzacja aktywności uwalniania jodku specyficznego dla mikrosomów jest niezbędna. Staranne przygotowanie płyt filtracyjnych wypełnionych żywicą jonowowymienną jest konieczne, aby uniknąć nierównomiernego rozłożenia żywicy na całej płycie filtracyjnej oraz zapewnić całkowite oddzielenie jodku od potencjalnie interferujących substancji. W odniesieniu do przepływu pracy z żywicą, wybrano świeżo odlewane płyty filtracyjne wypełnione żywicą jonową, aby zminimalizować potencjalne ryzyko dodatkowej zmienności wynikającej z nasycenia żywicą, przenoszenia jodku lub białka oraz potencjalnej utraty efektywności wiązania przy ponownym użyciu. Ponowne wykorzystanie żywicy i płyt filtrujących jest technicznie wykonalne, jednak może wiązać się z pewnymi ryzykami, które nie zostały systematycznie ocenione w tym badaniu. Może to powodować dryf między partiami, jeśli zdolność wiązania żywicy zostanie zmniejszona lub jeśli pozostałości składników matrycy pozostają w warstwie żywicy po wcześniejszych przebiegach. Dla laboratoriów rozważających recykling pragmatyczną rekomendacją jest weryfikacja wydajności żywicy po ponownym użyciu (np. poprzez monitorowanie zachowania tła i standardowych krzywych oraz zapewnienie spójnego wychwytywania jodku) oraz zaprzestanie ponownego użycia, jeśli zaobserwowane jest zwiększone tło, zmniejszony zakres dynamiczny lub nieregularne rozdzielenie. Zaleca się stosowanie płyt filtracyjnych wypełnionych żywicą do jednorazowego użytku, ponieważ protokół ten został opracowany specjalnie na podstawie tej metodologii.
Dodatkowo, rozpuszczalność każdego testowanego elementu musi być określona w odpowiednim nośniku, ponieważ maksymalne stężenie testowane jest ograniczone rozpuszczalnością (zazwyczaj do 1 mM przy 1% DMSO). Ponieważ wszystkie związki testowe są stosowane w DMSO jako rozpuszczalnik, kontrola rozpuszczalnika definiuje bazową aktywność DIO1 w warunkach istotnych dla testu i stanowi najbardziej odpowiednie warunki odniesienia do normalizacji i porównania. Natomiast sól sodowa 1-tio-β-D-glukozy została uwzględniona jako kontrolę ujemną, ponieważ jest strukturalnie podobna do dodatniej kontroli aurogioglukozy (ATG), ale chemicznie obojętna względem dejodynacji jodotyroniny i nie zakłóca mikrosomalnych systemów redoksowych ani aktywności katalitycznej DIO1. Jego obecność pomaga odróżnić prawdziwie specyficzne dla DIO1 efekty od niespecyficznych związanych z dodawaniem, przetwarzaniem lub interakcjami macierzy testowych. Kontrola bez leczenia/bez pojazdu nie była podstawowym warunkiem odniesienia, ponieważ nie odzwierciedlała rzeczywistego środowiska testowego, w którym DMSO występuje we wszystkich studniach objętych związkiem chemicznym; dlatego kontrola rozpuszczalnika jest odpowiednim punktem odniesienia do interpretacji testu.
Rozwiązywanie problemów koncentruje się na identyfikacji zakłóceń w reakcji SK. Substancje zawierające jod, chelatujące lub silnie utleniające mogą sztucznie wpływać na odczyt kolorymetryczny 14,17,18. Aby temu zaradzić, protokół obejmuje testy interferencyjne bez mikrosomów. Ponadto stosowanie ditiotreitolu (DTT) jako kofaktora może również prowadzić do uwalniania jodku nieenzymatycznego z niektórych substancji testowych. W takich przypadkach zaleca się metody ortogonalne, takie jak SPE-LC-MS/MS, aby potwierdzić hamowanie DIO1. Niespecyficzne interferencje poprzez ogólne efekty denaturacji (np. surfaktanty) mogą generować fałszywie pozytywne wyniki, dlatego ogólna strategia identyfikacji częstych atakujących czynniki, wykorzystując narzędzia in silico lub zintegrowane podejścia testowe, może być cenna.
Test ma kilka ograniczeń. Jest podatny na interferencję ze strony substancji testowych, które reagują z komponentami testu lub uwalniają jodek niezależnie od aktywności DIO1. Test nie rozróżnia specyficznej inhibicji DIO1 od niespecyficznej interferencji z funkcją enzymu lub integralnością strukturalną. Aby poprawić swoistość, równolegle można analizować hamowanie dodatkowych enzymów mikrosomalnych, a porównanie sił hamujących w różnych testach enzymatycznych może dostarczyć dodatkowych dowodów.
Kolejną strategią identyfikacji możliwych artefaktów jest włączenie testów integralności lub żywotności, jak często wykonywane w testach in vitro na komórkach, aby określić maksymalne stężenie testowe. Chociaż bezpośredni test integralności nie istnieje dla testu DIO1-SK, jego zastosowanie w baterii testów in vitro umożliwia integrację danych o cytotoksyczności z innych testów komórkowych w celu doboru stężenia. Jeśli takie informacje z testu krzyżowego nie są dostępne, górne stężenie w teście DIO1-SK jest ograniczone rozpuszczalnością, która może nie odzwierciedlać istotnych ekspozycji in vivo. Jednak podejścia toksykokinetyczne mogą być stosowane do lepszego określenia i interpretacji stężeń in vitro testowych.
Test DIO1-SK jest szczególnie cenny w badaniach toksykologicznych oraz mechanistycznych badaniach zaburzeń hormonalnych. Dotyczy kluczowego zdarzenia w homeostazie hormonów tarczycy i może być zintegrowany z bateriami testów in vitro. Jego odporność, powtarzalność i zdolność adaptacji do różnych warunków laboratoryjnych i potrzeb przepustowych czynią go cennym narzędziem do oceny bezpieczeństwa chemicznego i walidacji regulacyjnej. Test ten dostarcza solidnego pomiaru in vitro hamowania DIO1 w warunkach standaryzowanych i wspiera klasyfikację substancji testowych względem dobrze scharakteryzowanego inhibitora referencyjnego (6-PTU). Jednak dane in vivo dotyczące hamowania DIO1 są skąpe, dlatego bezpośrednia korelacja między wynikami hamowania DIO1 in vitro a efektami in vivo nie jest obecnie stosowalna do szacowania predykcyjności in vivo. W związku z tym wyniki testów należy interpretować jako mechanistyczne dowody zakłóceń z jednym kluczowym zdarzeniem w metabolizmie hormonów tarczycy i integrować z dodatkowymi liniami dowodowymi (np. innymi testami MoA tarczycy oraz pomiarami ortogonalnymi tam, gdzie jest to potrzebne). Co istotne, test DIO1–SK był oceniany w wielu badaniach zorientowanych na walidację (optymalizacja/standaryzacja, ocena predykcyjności oraz analiza odporności/dokładności)6,7,15, a wraz z postępem metody w kierunku wdrożenia OECD, niniejszy artykuł dostarcza poziom szczegółów proceduralnych, krok po kroku, mających na celu ułatwienie transferu i spójnego wdrażania w kolejnych laboratoriach.

Zaburzenia hormonalne (ED) to substancje chemiczne zakłócające regulację hormonalną i w konsekwencji powodujące niepożądane skutki u ludzi 1,2. Dejodynazy (DIO) to enzymy związane z błoną, z selenocysteiną jako kluczową resztą w ich aktywnych miejscach. Ta rodzina enzymów obejmuje trzy odrębne izoformy (DIO1, DIO2 i DIO3), które łącznie modulują stężenia krążącego hormonu tarczycy (TH) i regulują ich dostępność tkankowo w komórkach3. Tyroksyna (T4), która pełni rolę prohormonu, oraz trijodotyronina (T3), forma aktywna, odgrywają kluczową rolę w regulacji wydatku energii, wzrostu, procesów rozwojowych i termoregulacji organizmu4. Izoformy DIO różnią się cechami specyficzności miejsc dejodawacji, właściwościami kinetycznymi oraz preferencjami podłoża3. DIO1 jest główną izoformą dejodynazy w dorosłej wątrobie i wykazuje silne powinowactwo substratowe do odwróconej trijodotyroniny (rT3) oraz siarczanowych jodotyronin, podczas gdy DIO2 preferencyjnie wykorzystuje T4 i rT3, a DIO3 działa głównie na T4 i T3. Wykorzystanie ludzkich mikrosomów wątroby i rT3 jako podłoża pozwala na selektywne wykrywanie aktywności DIO1, minimalizując interferencje ze strony innych izoform. Chociaż dokładne konsekwencje hamowania DIO1 wywołanego przez substancje nie zostały w pełni wyjaśnione, dowody z mutacji genów u ludzi wpływających na DIO1 wyraźnie pokazują, że DIO1 może zakłócać układ hormonów tarczycy5. W związku z tym istnieje krytyczna potrzeba solidnych i powtarzalnych metod badania hamowania DIO1.
Celem przedstawionej metody jest ilościowe określenie aktywności DIO1 in vitro za pomocą nieradioaktywnego, kolorymetrycznego podejścia opartego na reakcji Sandella-Kolthoffa (SK). DIO1 katalizuje przekształcenie odwróconego rT3 w T2, proces prowadzący do uwalniania jonów jodkowych. Reakcja SK umożliwia czułe wykrywanie uwolnionego jodku, umożliwiając określenie aktywności uwalniającej jodek (IRA) jako bezpośredniego pomiaru aktywności DIO1. Test ten umożliwia wykrywanie hamujących efektów substancji testowych na DIO1, wspierając toksykologię mechanistyczną, badania przesiewowe lub podejmowanie decyzji regulacyjnych. Jest szczególnie istotny do badania hamowania DIO1 jako molekularnego zdarzenia inicjującego niepożądane szlaki prowadzące do zaburzenia tarczycy, zgodnie z międzynarodowymi badaniami walidacyjnymi, takimi jak te koordynowane przez EURL ECVAM 6,7. Metoda została pierwotnie opracowana w 2012 roku 8,9 i dodatkowo zoptymalizowanaw 6,7 w odpowiedzi na rosnące zapotrzebowanie na solidne, powtarzalne i skalowalne testy in vitro, które można integrować z bateriami testowymi do badań przesiewowych endokrynnych, zwłaszcza w kontekście metabolizmu hormonów tarczycy. Niedawno opublikowano zastosowanie analogowych konfiguracji SK dla średnio-10 do przesiewania wysokoprzepustowego11, co pokazuje szeroką przydatność podejścia opartego na SK.
Chociaż test DIO1-SK pośrednio mierzy aktywność DIO1 poprzez ilościowe określenie produktów IRA zamiast TH, oferuje kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. W przeciwieństwie do metod opartych na radioznakowanych substratach12 lub ilościowości wyczerpanych lub uformowanych hormonów tarczycy13 opartej na spektrometrii masowej, reakcja SK zapewnia prosty, skalowalny i opłacalny odczyt poprzez pomiar uwalniania jojku na 415 nm14. Chociaż metody LC-MS/MS z ekstrakcją fazową (SPE-LC-MS/MS) oferują wysoką specyficzność i czułość do ilościowego określania rT3 i T2, wymagają one kosztownego sprzętu i są mniej odpowiednie do przesiewania o wyższej przepustowości. Dla porównania, test DIO1-SK może być stosowany w standardowych warunkach laboratoryjnych i został wstępnie zatwierdzony do stosowania z ludzkimi mikrosomami wątroby, wykazując wysoką powtarzalność i predykcyjność 6,7. W badaniu porównawczym wyniki reakcji SK, a konkretnie uwalniania jodku, zostały bezpośrednio porównane z ilościową ilościową ilością metabolitów hormonów tarczycy (rT3 i T2) za pomocą SPE-LC-MS/MS 15. Wyniki wykazały silną zgodność między tymi dwoma podejściami w zakresie różnych substancji testowych i mocy hamowania. Dla wszystkich badanych substancji zmiany aktywności uwalniania jojku (IRA) mierzone reakcją SK były ściśle odzwierciedlane ze zmianami poziomów rT3 i T2 określanymi spektrometrią mas. To dodatkowo potwierdzało ważność odczytu SK jako zastępstwa dla aktywności DIO1. Te analizy porównawcze potwierdzają, że test SK stanowi solidną i wiarygodną alternatywę dla bardziej złożonych technik analitycznych, a uwalnianie jodeku można z pewnością mierzyć w celu oceny inhibicji DIO1 in vitro.
Jednak metoda SK ma pewne ograniczenia, które należy rozważyć: jest podatna na interferencje substancji zawierających wolny jodek jako zanieczyszczenie, uwalniające jodek nieenzymatycznie lub reagujące z komponentami testowymi, takimi jak ditiotreitol (DTT). DTT jest uwzględniane jako kofaktor redukujący, aby utrzymać katalityczną kompetencję dejodynazy poprzez wspieranie regeneracji selenocysteiny w miejscu aktywnym w stanie zredukowanym podczas wymiany. Ponieważ DTT jest silnym reduktorem, niektóre substancje testowe (lub zanieczyszczenia) mogą ulegać reakcjom redoks, które wpływają na odczyt kolorymetryczny i w niektórych przypadkach prowadzą do artefaktów testowych zależnych od DTT niezwiązanych z enzymatycznym uwalnianiem jodku. Takie interferencje mogą prowadzić do fałszywie ujemnych wyników dla hamowania DIO1, ponieważ zmierzony jodek może nie pochodzić z enzymatycznej konwersji rT3. Tak więc, choć test SK nadaje się do rutynowych badań przesiewowych i większości substancji testowych, LC-MS/MS może być używany do potwierdzenia w razie podejrzenia interferencji testu lub do substancji o złożonych właściwościach chemicznych.
Test DIO1-SK jest obecnie przygotowywany do włączenia jako wytyczne testowe OECD w międzynarodowym projekcie PEPPER (Public-private platform for the validation of endocrine disruptors characterization methods), który podkreśla jego rosnące znaczenie dla zastosowań regulacyjnych oraz międzynarodowej harmonizacji strategii testowania disruptorów endokrynnych. Test może być zintegrowany z kompleksowymi bateriami testowymi in vitro, wspierając zarówno ocenę bezpieczeństwa chemicznego, jak i badania mechanistyczne dotyczące zakłóceń hormonalnych16. W połączeniu z testami dotyczącymi dodatkowych kluczowych zdarzeń na szlaku niepożądanych skutków tarczycy, przyczynia się do pełniejszego zrozumienia mechanizmów zaburzeń hormonów tarczycy.
Ponadto skalowalność protokołu i wysoka powtarzalność sprawiają, że jest on dobrze przystosowany do przesiewania średniego i wysokoprzepustowego. Jest to niezbędne do oceny dużej liczby substancji podczas opracowywania leków oraz w środowisku akademickim, co niedawno wykazało11. Badacze zainteresowani inhibicją DIO1, czy to w badaniach przesiewowych, toksykologii mechanistycznej, czy podejmowaniu decyzji regulacyjnych, skorzystają na solidnym, dostępnym i wszechstronnym badaniu. Walidacja tej metody uczyni ją standardowym narzędziem badań nad zaburzeniami układu hormonalnego tarczycy oraz oceny bezpieczeństwa chemicznego.

<table><tbody><tr><td>1-Tio-&beta;-D-glukoza sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6375-1G</td><td>CAS 10593-29-0</td></tr><tr><td>3,3',5'-trijodotyronina (rT3) &nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-209692</td><td>CAS 5817-39-0</td></tr><tr><td>6-propyl-2-tiouracyl (6PTU)</td><td>Supelco</td><td>P3755-10G</td><td>CAS 51-52-5</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>9526-33</td><td>CAS 64-19-7</td></tr><tr><td>Bilans analityczny</td><td>NA</td><td>NA</td><td>zdolny do dokładnej wagi do 30 g przy czytelności 0,1 mg</td></tr><tr><td>Tlenek sodu arsenu (NaAsO2)</td><td>Thermo Fisher</td><td>041533.AP</td><td>CAS 7784-46-5</td></tr><tr><td>Płytki do testowania (format 96 dołków)</td><td>Merck</td><td>Z707902-108EA</td><td>np. płytki do hodowli tkankowych, płytki 96-dołkowe, płaskie dno, polistyren, 0,34 cm2, sterylne, 108/cs, TPP</td></tr><tr><td>Aurotioglukoza (ATG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0606-5MG</td><td>CAS 12192-57-3</td></tr><tr><td>Rurki wirówkowe 15 i 50&nbsp; mL</td><td>Merck</td><td>Z707724-800EA, Z707716-320EA</td><td>np. rurki wirówek TPP, objętość 15 i 50 mL, polipropylen i nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka z wirnikem wychylanym na płytki mikromiareczkowe</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Powinna być wystarczająco wysoko, by zmieścić płytę o głębokości 96 studni i 96-dołkową płytkę filtra na górze (co najmniej około 6 cm wysokości)</td></tr><tr><td>Siarczan amonu cerium (IV) (Ce(NH4)4(SO4)4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22269-100G-F</td><td>CAS 10378-47-9</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>zdolny do utrzymania temperatury 37 stopni i g; C, 5% CO2 i &ge; 90% wilgotności</td></tr><tr><td>Płytki głębokich odwiertów (format 96 otworów)</td><td>Supelco</td><td>575653-U</td><td>np. płytka zbiorcza studni SPE 96 – głęboka kwadratowa studnia, objętość studni 2 mL, polipropylen</td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>AppliChem</td><td>A3672,0250</td><td>CAS 67-68-5</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779-1G</td><td>CAS 3483-12-3</td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) i nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>APO456787707-500G</td><td>CAS 6381-92-6</td></tr><tr><td>Płytki filtracyjne (format 96-dołkowy)</td><td>Merck</td><td>WHA77002810</td><td>np. mikropłytki, 96-dołki, przezroczysty polistyren, 800 & mikro; L, Wiązanie DNA, Whatman</td></tr><tr><td>Uszczelniacze płytowe szczelne</td><td>Thermo Fisher</td><td>232698</td><td>np. taśma uszczelniająca, poliester, sterylna, taśma uszczelniająca, poliester, sterylna, Nunc</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Pan Biotech</td><td>P05-01100</td><td>CAS 7365-45-9</td></tr><tr><td>Ludzkie mikrosomy wątroby</td><td>Biovit</td><td>X008070</td><td>np. INVITROCYP 150-dawcy zebrane ludzkie mikrosomy wątroby</td></tr><tr><td>Jodek (standard układów scalonych)</td><td>Supelco</td><td>41271-100ML</td><td>np. standard jodku dla IC, 1000 mg/L w wodzie, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Żywica jonowa podobna do Dowex 50WX2</td><td>Roth</td><td>334.4</td><td>CAS 12612-37-2; Siatka 100-200</td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe 1,5&nbsp; mL</td><td>Merck</td><td>EP0030120086-1PAK</td><td>np. Eppendorf&reg; Safe-Lock mikrowirówki, objętość 1,5 mL, naturalne</td></tr><tr><td>Dozownik wielokanałowy zdolny do dostarczania od 50 do 300 nbsp; &mikro; L na krok</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa zdolna dostarczyć od 10 do 100 nbsp; &mikro; L na krok</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>pH z elektrodami i buforami kalibracyjnymi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>zdolny do odczytu +/- 0,1 jednostek pH</td></tr><tr><td>Fotometr do pomiaru absorpcji</td><td>Tecan Trading AG</td><td>NA</td><td>np. Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3</td></tr><tr><td>Pipety zdolne do dostarczania od 1 do 10 nbsp; &mikro; L</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipety zdolne do dostarczania od 10 do 100 nbsp; &mikro; L</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipety zdolne do dostarczania od 100 do 1000 nbsp; &mikro; L&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipety dla większych objętości</td><td>NA</td><td>NA</td><td>pipety serologiczne, np. 10, 25, 50 mL</td></tr><tr><td>Potrząsacz płyt</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>np. mikropłytka mikromiareczkowa Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER, sterowana bezpośrednio</td></tr><tr><td>Pipeta powtarzająca</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td>CAS: 7647-14-5, np. chlorek sodu, odczynnik ACS itd; 99.0 %</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Zdolny do wykonywania analizy regresji odzwierciedlającej charakterystyki testu oraz obliczania stężeń hamujących, np. GraphPad Prims 8, GraphPad</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)&nbsp;</td><td>Supelco</td><td>1007311000</td><td>CAS 7664-93-9</td></tr><tr><td>Kolba objętościowa</td><td>NA</td><td>NA</td><td>certyfikowane z określoną objętością</td></tr></tbody></table>

kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji sandella-kolthoffa

Colorimetric Assessment of Deiodinase 1 Activity in Human Liver Microsomes Using the Sandell-Kolthoff Reaction

Metoda ta umożliwia identyfikację substancji testowych hamujących aktywność DIO1 i tym samym mogą zakłócać homeostazę hormonów tarczycy. Przedstawiony protokół opisuje nieradioaktywną, kolorymetryczną metodę oceny wpływu substancji testowych na aktywność enzymatyczną dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby. Test opiera się na reakcji Sandella-Kolthoffa (SK), która ilościowo określa jodek uwalniany podczas dejodynacji odwróconej trijodotyroniny (rT3) do dijodotyroniny (T2). Żółty cer (IV) redukuje się do bezbarwnego ceru (III) w obecności jodku, co pozwala na wykrywanie fotometryczne na 415 nm. W tym standaryzowanym układzie stężenie cerium (IV) jest ustawione na 40 mM, aby poprawić stabilność sygnału i odporność w opisanych warunkach. Aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność testu, uwzględniono kompleksowy zestaw kontrolny: 6-propyl-2-tiouracyl (pozycja referencyjna), aurotioglukozę (kontrola dodatnia), sól sodową 1-tio-β-D-glukozy (kontrola ujemna) oraz 1% dimetylosulfoxid (kontrola rozpuszczalnika). Protokół obejmuje badanie pomiaru zakresu w celu określenia odpowiednich stężeń testowych, standaryzację aktywności uwalniania jodku specyficzną dla mikrosomów oraz strukturalne testy interferencyjne chemiczne w przypadku braku mikrosomów, z opcjonalną oceną kontrolną bez ditiotreitolu (DTT) w celu identyfikacji artefaktów zależnych od DTT. Test DIO1-SK nadaje się do badań przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości oraz toksykologii mechanistycznej. Jego odporność, skalowalność i zastosowanie w ludzkich mikrosomach czynią go cennym narzędziem do badania zaburzeń w funkcjonowaniu hormonalnym. Protokół ten wspiera działania regulacyjne w zakresie walidacji.

Protokół ten opisuje metodę kolorymetryczną umożliwiającą wiarygodną ocenę wpływu chemikaliów na aktywność dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandell-Kolthoffa. Zawiera ona z góry określone kryteria akceptacji oraz statystyczne wskaźniki wydajności oraz wspiera dalsze działania na rzecz włączenia wytycznych testowych OECD.

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

This method enables the identification of test substances that inhibit DIO1 activity and may thus interfere with thyroid hormone homeostasis. The protocol ...

Test ten ilościowo określa hamowanie DIO1 przy użyciu ludzkich mikrosomów wątroby. Został zweryfikowany i zoptymalizowany pod kątem solidnego i ustandaryzowanego prowadzenia. Protokół ten jest stosowany w toksykologii mechanistycznej i badaniach przesiewowych do identyfikacji substancji chemicznych hamujących DIO1 i zakłócających homeostazę hormonów tarczycy.Protokół ten mierzy uwalnianie jojdu z RT3 poprzez dejodynację w reakcji Sandell-Kolthoff, praktycznym odczytem zastępczym dla aktywności DIO1. Na początek zdobądź odpowiedni prostokątny, przezroczysty pojemnik. Dodaj około 250 gramów żywicy jonowymienieniowej do pojemnika.Przemyj żywicę 10% kwasem octowym i pozwól zawiesinie odpoczynku przez 10 minut. Następnie lekko przechyl zbiornik, aby zasysać supernatant. Powtarzaj mycie co najmniej pięć razy lub aż do momentu, gdy do rozpuszczalnika nie przedostanie się już żaden kolor.Po ostatnim praniu dodaj 10% kwasu octowego, aby stanowił około 50% całkowitej objętości. Przechyl pojemnik tak, aby żywica przesunął się na bok. Ustabilizuj pojemnik w pozycji pochylonej i odczekaj około 10 minut, aż fazy się rozdzielą.Umieść płytę filtra z 96 dołkami na płytę o głębokości 96 studni. Dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego 10% do każdej studni na 96-dołkowej płytce filtracyjnej. Końcówki używane do odlewania żywicy wytnij na wysokości około jednego centymetra, aby poszerzyć otwór na końcu.Użyj końcówki do wycięcia do dyspozycji 300 mikrolitrów żywicy jonowymienieniowej do każdej jamki na 96-dołkowej płytce filtracyjnej. Wiruj zespół płyty z wirnikem wychylanym do mikropłytki miareczkowych o temperaturze od 100 do 200G przez minutę, aby wydzielić kwas octowy do płytki o głębokości 96 odwiertów. Sprawdź, czy żywica jest równomiernie rozłożona na płytce.Uszczelnij płytę nieprzepuszczalną folią. Przechowuj talerz w temperaturze czterech stopni Celsjusza maksymalnie przez sześć miesięcy. Przygotuj rozcieńczenia jodku ze źródła jodku w wodzie dejonizowanej.Dodaj 50 mikrolitrów czystej wody zdejonizowanej jako kontrolę do płyty o pojemności 96 dołków w potrójnym egzemplarzu. Dodaj 50 mikrolitrów przygotowanych rozcieńczeń jodku do tej samej płytki w potrójnym egzemplarzu. Do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów roztworu cerium o stężeniu 40 milimolowych.Rozpocznij reakcję, dodając 50 mikrolitrów roztworu arsenitu 25 milimolarnych. Bezpośrednio po dodaniu arsenitu zmierz absorpcję czytnikiem płytek na 415 nanometrach. Następnie mierz absorpcję co minutę przez 21 minut.Przygotuj element referencyjny, pozytywną kontrolę, kontrolę ujemną oraz serię rozcieńczania testów przy wskazanym stężeniu. Przygotuj mieszankę podłoża i mikrosomową zawiesinę. Umieść rurki na lodzie.Dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczeń przedmiotów referencyjnych, kontrolujących i testowych do otworów zgodnie z układem płyty. Do każdego odwiertu dodaj 40 mikrolitrów zawiesiny mikrosomów, a następnie 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki podłoża. Uszczelnij płytę nieprzepuszczalną folią.Umieść go na shakerze w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 850 obrotach na minutę przez dwie godziny. Następnie połóż płytkę na lodzie, aby zatrzymać reakcję i zostawić ją tam aż do pomiaru. Umieść płytę filtra wypełnioną żywicą jonową wypełnioną 96 dołkami na płytę o głębokości 96 studni.Dodaj 150 mikrolitrów kwasu octowego 10% do każdej jamki płyty filtracyjnej, aby zwilżyć żywicę. Wiruj zespół płyty w wirówce z wirującym rotorem do mikropłyt miareczkowych w czasie 100 do 200G przez minutę, aby wydzielić kwas octowy do płytki o głębokości 96 odwiertów. Wymień używaną płytę z 96 głębokimi studniami na świeżą.Pobierz inkubowaną płytę o 96 dołkach z lodu. Do każdego dołku dodaj 133 mikrolitry kwasu octowego 10%. Krótko potrząśnij talerzem, żeby wymieszać próbki.Przenieś 175 mikrolitrów każdej próbki na płytę filtra wypełnioną żywicą jonową o długości 96 dołków, zachowując oryginalny układ płyty. Wiruj zespół płyty z wirującym rotorem wysuwanym do mikromiarek przy temperaturze 100 do 200G przez minutę, aby próbki przepuścić przez żywicę do płytki o głębokim odwiercie 96 odwiertów. Następnie usuń płytę filtra wypełnioną żywicą jonowymi, wypełnioną 96 dołkami.Przenieś 50 mikrolitrów nierozcieńczonej próbki z płytki 96 głębokich studni do nowej płyty o 96 dołkach. Do wszystkich otworów należy dodać 50 mikrolitrów roztworu cyru 40 milimolarnych i rozpocząć reakcję, dodając 50 mikrolitrów roztworu arsenitu 25 milimolarnych do każdego otworu. Bezpośrednio po dodaniu arsenitu zmierz absorpcję czytnikiem płytek na 415 nanometrach.Następnie mierz absorpcję co minutę przez 21 minut. Tło koregowane sygnałem Sandella-Kolthoffa wzrastało wraz ze wzrostem białka mikrosomalnego. Sygnał zmieniał się w zależności od rozcieńczeń wymiany jonowej.Rozcieńczenie jeden do dwóch dawało najwyższy sygnał, zachowując jednocześnie odpowiedź sigmoidalną. Porównanie krzywych hamujących wykazało pięć mikrogramów białka mikrosomalnego na jedną równię oraz najniższą ilość wywołującą odpowiedź sigmoidalną. Referencyjny inhibitor wykazał zależny od stężenia spadek aktywności uwalniania jodku, z profilem hamowania sigmoidalnego.Kwas taninowy wykazywał podobny profil hamujący z wysokim maksymalnym hamowaniem. Ftalan dibutylu nie wykazał hamowania w całym badanych zakresie stężeń. Wyniki te wykazały, że test wyraźnie rozróżnił profile odpowiedzi na stężenia hamujące od niehamujących w warunkach standaryzowanych.Utrzymanie ścisłego jednolitego obchodzenia się z udziałem to kluczowe wyzwanie. Niewielka zmiana w czasie i obsłudze może znacząco wpłynąć na efektywność protokołu. Przyszłe badania mogą dostosować standaryzowany przepływ do innych źródeł enzymów dejodynujących, umożliwiając badania DIO2, DIO3 lub dehalogenaz.

colorimetric-assessment-deiodinase-1-activity-human-liver-microsomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

W tym filmie opisujemy opartą na kolorymetrii metodę określania zawartości żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy. Sulfonian batofenantroliny jest stosowany jako substrat chromogenny w obecności środka redukującego, który przekształca żelazo żelazowe w chelatowalne żelazo żelaza.

Test kolorymetryczny na bazie sulfonianu batofenantroliny: prosta i szybka metoda oznaczania ilościowego żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Tutaj prezentujemy protokół, który może być użyty do mikroskopowego obrazowania i ilościowego określania aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach oraz jej kinetyki, funkcji i lokalizacji subkomórkowej.

Mapowanie metaboliczne: ilościowa cytochemia enzymatyczna i histochemia w celu określenia aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach

Opisujemy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej dla enzymów, które generują fosforan dinukleotydu nikotynoatmidadeninowego (NAD(P)H) + H+ bezpośrednio w próbkach tkanek.

Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.

Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj niepromieniotwórczą metodę kolorymetryczną do oceny aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe badania toksykologiczne.

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

Przeglądaj więcej filmów