ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (82222038 i 81970259), Wybitne Młode Talenty Biotechnologii Obronności Narodowej (2023-JCJQ-ZQ-001 i 01-SWKJYCJJ06), oraz Fundusz Naukowy Chongqing dla Wybitnych Młodych Uczonych (CSTB2022NSCQ-JQX0017).

Wszystkie procedury eksperymentalne opisane w niniejszym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki i Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego (SCXK(PLA)20120031).
1. Zwierzęta doświadczalne
<ol>
	<li>Należy wykorzystać samce myszy C57BL/6 w wieku 8–10 tygodni o masie ciała 23–28 g (nr licencji na zwierzęta: SCXK (Xiang) 2019-0004). Myszy należy utrzymywać w środowisku wolnym od określonych patogenów (SPF), z wolnym dostępem do pokarmu i wody. Warunki utrzymania powinny być następujące: temperatura pomieszczenia (24 ± 2ºC), wilgotność 50%–55% oraz 12-godzinny cykl światło-ciemność (12 h/12 h).</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii
<ol>
	<li>Należy użyć odpowiedniego szczepu. W tym przypadku zastosowano szczep Klebsiella pneumoniae z American Type Culture Collection (ATCC) nr 43816.</li>
	<li>Należy przygotować odpowiednią pożywkę (bulion Luria-Bertani [LB]).</li>
	<li>Przygotowanie bakterii do instylacji.
	<ol>
		<li>Pojedynczą kolonię należy pobrać i zaszczepić w 5 mL bulionu LB, a następnie inkubować przez noc (12 h) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 220 rpm.</li>
		<li>Nocną kulturę bakterii należy przenieść do świeżego bulionu LB i hodować przez 3–4 h, aż do osiągnięcia fazy wysokiej gęstości wzrostu (gęstość optyczna przy 600 nm [OD600] ≈ 0,8).</li>
		<li>Po rozcieńczeniu zawiesiny bakteryjnej należy pobrać 100 µL i nanieść na dno szalki Petriego zawierającej stałą pożywkę. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 h, zliczyć liczbę kolonii i wyznaczyć stężenie KP wynoszące 2 × 109 CFU/mL, co odpowiada OD600 ≈ 0,8.</li>
		<li>Stężenie bakterii należy dostosować za pomocą 0,9% roztworu NaCl. Do dalszego użytku należy przygotować trzy zawiesiny bakteryjne o stężeniach 1 × 108 CFU/mL, 1 × 106 CFU/mL oraz 1 × 104 CFU/mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Infekcja poprzez instylację donosową (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Zanurz mysz w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 2% pentobarbitalu sodu w dawce 40 mg/kg (Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Gdy mysz wykaże obniżoną świadomość, ale zachowa odruch połykania, pobierz 50 µL zawiesiny bakteryjnej (lub 0,9% roztworu NaCl jako kontroli) za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Delikatnie unieruchom szyję myszy, kładąc kciuk z przodu szyi, a resztą palców delikatnie chwyć ciało myszy. Odchyl głowę myszy do tyłu (Rysunek 1C).</li>
	<li>Powoli wprowadź zawiesinę bakteryjną do nozdrzy myszy za pomocą pipety (około 5–10 µL na kroplę). Podawaj jedną kroplę do jednego nozdrza na raz (Rysunek 1D).</li>
	<li>Po zaobserwowaniu, że mysz wciągnęła zawiesinę, szybko unieś mysz do góry, a następnie powoli ją opuść, aby wspomóc inhalację zawiesiny do oskrzeli (Rysunek 1E,F).</li>
	<li>Przejdź do drugiego nozdrza i powtórz procedurę. Podawaj krople naprzemiennie do obu nozdrzy, po 5-10&#160;µL&#160;za każdym razem, aż do momentu wciągnięcia łącznie 50&#160;µL.</li>
	<li>Jeśli w trakcie zabiegu mysz zakaszle, westchnie lub nie będzie w stanie wciągnąć roztworu bakteryjnego, pozwól jej odpocząć i obserwuj ją. Po ustabilizowaniu się sytuacji kontynuuj proces inhalacji, aby upewnić się, że mysz wciągnęła cały roztwór bakteryjny (lub 0,9% NaCl).</li>
	<li>Unieruchom mysz w pozycji grzbietnej na desce do myszy nachylonej pod kątem 60° do momentu odzyskania przytomności. Zapewnij dodatkowe ciepło, aby ułatwić wybudzanie z narkozy; stale monitoruj zwierzęta, aby zapobiec przegrzaniu. Po wybudzeniu myszy z narkozy, wróć&#160; umieść ją z powrotem w klatce z optymalnymi warunkami temperaturowymi, wystarczającą ilością wody i pożywienia.</li>
</ol>
4. Ewaluacja modelu
UWAGA: Za pomocą wspomnianej metody instylacji donosowej utworzono cztery grupy modeli mysich, mianowicie grupę kontrolną (grupa A, instylacja PBS), grupę o stężeniu KP 1 × 104 (grupa B), grupę o stężeniu KP 1 × 106&#160; (grupa C) oraz grupę o stężeniu KP 1 × 108 (grupa D). Myszy poddano głębokiej narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 2% pentobarbitalu sodu (60 mg/kg). Przed końcową punkcją serca w celu oceny modelu potwierdzono odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu prostowania, brak wycofania łapy po uciśnięciu palca oraz rozluźnienie mięśni. Śmierć potwierdzono poprzez zwichnięcie stawu kręgowego szyjnego bezpośrednio po pobraniu krwi. Model oceniono za pomocą następujących metod:
<ol>
	<li>Ocena wskaźników zapalenia po 12 h.
	<ol>
		<li>W 12 h po instylacji donosowej KP pobrać krew (≥ 300 µL) poprzez punkcję serca (n = 5 na grupę). Oddzielić surowicę poprzez wirowanie (1000 × g, 10 min) i wykorzystać ją do oznaczania cytokiny interleukiny-6 (IL-6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena uszkodzeń narządów po 24 h
	<ol>
		<li>W 24 h po instylacji donosowej KP pobrać krew (≥ 300 µL) poprzez punkcję serca (n = 5 na grupę) i wykorzystać surowicę do oznaczania wskaźników biochemicznych. spośród tych wskaźników wykorzystać aminotransferazę alaninową (ALT) i aminotransferazę asparaginianową (AST) do oceny uszkodzeń wątroby, kinazę kreatynową (CK) do oceny uszkodzeń mięśni oraz azot moczowy (BUN) do oceny uszkodzeń nerek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena objawów
	<ol>
		<li>Codziennie monitorować masę ciała myszy oraz obserwować stan okrywy włosowej, poziom aktywności i inne parametry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie cytokin i komórek odpornościowych w 7. dniu
	<ol>
		<li>W 7. dniu po stworzeniu modelu (n = 10 [A/B], n = 15 [C], n = 40 [D]) pobrać krew poprzez punkcję serca do analizy cytometrycznej w celu oceny odsetka limfocytów, proporcji ekspresji głównego układu zgodności tkankowej klasy II (MHC‑II) w monocytach oraz średniej intensywności fluorescencji (MFI) IL-10 i TGF-β1 w limfocytach T CD4+.</li>
		<li>Obróbka tkanek
		<ol>
			<li>Wymieszać próbki krwi (100 µL) z buforem do lizy czerwonych krwinek (300 µL) w stosunku objętościowym 1:3. Po 15 min lizy erytrocytów w temperaturze pokojowej wirować mieszaninę przy 400 × g przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
			<li>Resuspendować osad w 200 µL buforu do lizy czerwonych krwinek (stosunek objętości = 1:2) i inkubować przez 10 min w celu wtórnej lizy.</li>
			<li>Po kolejnym wirowaniu przy 400 × g przez 5 min usunąć nadsącz i resuspendować osad w 100 µL buforu do barwienia komórek.</li>
			<li>Do próbek dodać 1 µL każdego przeciwciała do cytometrii przepływowej. W skrócie: dodać CD45 do barwienia limfocytów; przeciwciała CD45, CD116, Ly6G, Ly6C i MHC-II do oznaczania MHC‑II; przeciwciała CD45, CD3, CD4, CD8 i CD25 do pomiaru IL‑10 i TGF‑β1. Stopień rozcieńczenia każdego z wymienionych przeciwciał wynosi 1:100.</li>
			<li>Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 4 °C przez 30 min w ciemności. Następnie dodać 1 mL buforu do barwienia komórek, a następnie wirować przy 400 × g przez 5 min; odrzucić nadsącz.</li>
			<li>Do oznaczania limfocytów i MHC-II resuspendować w 400 µL buforu do barwienia komórek przed analizą cytometryczną.</li>
			<li>Następnie przeprowadzić procedury oznaczania IL‑10 i TGF‑β1 zgodnie z krokami 4.4.2.8–4.4.2.12:</li>
			<li>Dodać 1 mL buforu do fiksacji i inkubować próbki w 4 ºC w ciemności przez 60 min.</li>
			<li>Po dodaniu 1 mL buforu do permeabilizacji wirować mieszaninę przy 400 × g przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
			<li>Resuspendować osad komórkowy w 100 µL buforu do permeabilizacji, a następnie dodać po 1 µL przeciwciał przeciwko Foxp3, IL-10 i TGF-β1. Inkubować próbki w 4 °C przez 30 min w ciemności.</li>
			<li>Następnie dodać 1 mL buforu do permeabilizacji i wirować przy 400 × g przez 5 min przed usunięciem nadsączu.</li>
			<li>Na koniec resuspendować komórki w 400 µL buforu do barwienia komórek i oznaczyć za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Strategia bramkowania
		<ol>
			<li>W celu oznaczania limfocytów wykluczyć debris i dublety na wykresie FSC-A/FSC-H. Zidentyfikować całkowitą liczbę leukocytów jako zdarzenia CD45⁺. Wyznaczyć bramkę dla limfocytów na podstawie niskich wartości FSC/SSC w obrębie populacji CD45⁺.</li>
			<li>W celu oznaczania MHC-II najpierw wyznaczyć bramkę leukocytów na FSC-A/SSC-A, aby wykluczyć debris, a następnie wyselekcjonować komórki CD45⁺. Zidentyfikować komórki mieloidalne jako CD11b⁺, wykluczając neutrofile na podstawie braku ekspresji Ly6G. Zdefiniować klasyczne monocyty jako komórki Ly6G⁻ Ly6Chi i ocenić ekspresję MHC-II w tej populacji.</li>
			<li>W celu oznaczania IL-10 i TGF-β1 wykluczyć debris i dublety za pomocą FSC-A/SSC-A i FSC-A/FSC-H. Zidentyfikować całkowitą liczbę limfocytów T jako zdarzenia CD45⁺CD3⁺. W obrębie populacji CD4⁺CD8⁻ zidentyfikować Tregs jako komórki CD25⁺FOXP3⁺. Ilościowo określić komórki TGF-β⁺ w podzbiorze Treg oraz ocenić ekspresję IL-10 we wszystkich limfocytach T CD4⁺. Wszystkie bramki pozytywne ustawić przy użyciu kontroli FMO.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczba bakterii w płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) 24 h po wtórnej infekcji
	<ol>
		<li>W 7. dniu po stworzeniu modelu (n = 5 [A/B], n = 10 [C], n = 40 [D]) przeprowadzić u myszy instylację donosową 50 µL Pseudomonas aeruginosa (PA) (w stężeniu 6,8 × 1010 CFU/mL) przy użyciu wspomnianej metody instylacji donosowej.</li>
		<li>W 24 h po wtórnej infekcji PA pobrać 1,5 mL płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF). Wykonać rozcieńczenia seryjne BALF, wysiać na płynne podłoże LB i inkubować w inkubatorze o stałej temperaturze w 37 °C przez 24 h przed zliczeniem kolonii.</li>
		<li>W celu pobrania BALF postępować zgodnie z poniższymi krokami:
		<ol>
			<li>Eutanazować mysz w sposób humanitarny (150 mg/kg 2% pentobarbitalu sodowego), a następnie ułożyć ją na plecach z rozciągniętą szyją.</li>
			<li>Wykonać nacięcie w linii środkowej szyi, aby odsłonić tchawicę. Wprowadzić tępy cewnik 24-G do tchawicy, nieco poza krainę, i zabezpieczyć go szwem.</li>
			<li>Wprowadzić do płuc przez kaniulę tchawiczą 0,5 mL sterylnego, lodowatego PBS. Delikatnie aspirować 3–5 razy, odzyskać płyn i powtórzyć ten cykl przemywania 3 razy, aby uzyskać całkowitą objętość około 1,5 mL.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza przeżywalności
	<ol>
		<li>Do analizy przeżywalności wykorzystać oddzielną kohortę myszy (n = 10 [A/B/C], n = 40 [D]).</li>
		<li>Rejestrować status przeżywalności myszy w ciągu 7 dni po infekcji.</li>
		<li>Po wtórnej infekcji PA obserwować wskaźnik śmiertelności myszy od 7. do 14. dnia.</li>
		<li>Po obserwacji podać myszom głęboką anestezyję izofluranem (5%); głębokość znieczulenia potwierdzono utratą odruchu prostowania ciała i odruchu na uciśnięcie palca, regularnym oddychaniem i rozluźnieniem mięśni przed eutanazją poprzez dostarczenie przedawki pentobarbitalu sodowego (150 mg/kg) drogą dosytroniczną, a śmierć potwierdzono poprzez zwichnięcie szyi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Przeprowadzić testy normalności i testy jednorodności wariancji dla danych ilościowych.</li>
		<li>Do porównań między grupami zastosować jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), jeśli dane mają rozkład normalny i jednorodną wariancję; w przeciwnym razie zastosować testy nieparametryczne.</li>
		<li>Analizę przeżywalności przeprowadzić metodą Kaplana-Meiera. Wykorzystać modele efektów mieszanych do przetestowania różnic w zmianach masy ciała między grupami w różnych punktach czasowych. Za statystycznie istotne uznać wartość p ≤ 0,05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+%28sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Shankar-Hari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+new+definition+and+assessing+new+clinical+criteria+for+septic+shock%3A+for+the+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+%28sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).</li>
<li>Seymour, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+clinical+criteria+for+sepsis%3A+for+the+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+%28sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Assessment of clinical criteria for sepsis: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 762-774 (2016).</li>
<li>Meyer, N. J., Prescott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> N Engl J Med. 391 (22), 2133-2146 (2024).</li>
<li>Kingsley, S. M., Bhat, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+paradigms+in+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Infect+Dis+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential paradigms in animal models of sepsis.</a> Curr Infect Dis Rep. 18 (9), 26(2016).</li>
<li>Hansen, V., Oren, E., Dennis, L. K., Brown, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+disease+mortality+trends+in+the+United+States%2C+1980-2014%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Infectious disease mortality trends in the United States, 1980-2014.</a> JAMA. 316 (20), 2149-2151 (2016).</li>
<li>Ashurst, J. V., Dawson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshurst%2C+JV+%22Klebsiella+pneumonia%22">Klebsiella pneumonia</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).</li>
<li>Jondle, C. N., Gupta, K., Mishra, B. B., Sharma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klebsiella+pneumoniae+infection+of+murine+neutrophils+impairs+their+efferocytic+clearance+by+modulating+cell+death+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Klebsiella pneumoniae infection of murine neutrophils impairs their efferocytic clearance by modulating cell death machinery.</a> PLoS Pathog. 14 (10), e1007338(2018).</li>
<li>Aghamohammad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+extended-spectrum+betalactamase-producing+Klebsiella+pneumoniae+among+fecal+carriage+in+Iran%3A+high+diversity+of+clonal+relatedness+and+virulence+factor+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">First report of extended-spectrum betalactamase-producing Klebsiella pneumoniae among fecal carriage in Iran: high diversity of clonal relatedness and virulence factor profiles.</a> Microb Drug Resist. 26 (3), 261-269 (2020).</li>
<li>Bengoechea, J. A., Sa Pessoa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klebsiella+pneumoniae+infection+biology%3A+living+to+counteract+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Klebsiella pneumoniae infection biology: living to counteract host defenses.</a> FEMS Microbiol Rev. 43 (2), 123-144 (2019).</li>
<li>Assoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Klebsiella+pneumoniae+mucosal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of Klebsiella pneumoniae mucosal infections.</a> Front Microbiol. 15, 1367422(2024).</li>
<li>Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+immunosuppression%3A+from+cellular+dysfunctions+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 13 (12), 862-874 (2013).</li>
<li>Van Der Poll, T., Van De Veerdonk, F. L., Scicluna, B. P., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunopathology+of+sepsis+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunopathology of sepsis and potential therapeutic targets.</a> Nat Rev Immunol. 17 (7), 407-420 (2017).</li>
<li>Diboue Betote, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-dependent+vulnerability+for+Wistar+rats+model+following+intranasal+instillation+with+Klebsiella+pneumoniae+ATCC+43816+causing+lobar+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pneumonia%22%5BJournal%5D)">Sex-dependent vulnerability for Wistar rats model following intranasal instillation with Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 causing lobar pneumonia.</a> Pneumonia. 16 (1), 5(2024).</li>
<li>Leus, I. V., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+two+are+alike%3A+on+the+role+of+Klebsiella+pneumoniae+permeability+barriers+in+antibiotic+susceptibility+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">No two are alike: on the role of Klebsiella pneumoniae permeability barriers in antibiotic susceptibility and persistence.</a> Antimicrob Agents Chemother. 69 (8), e0008525(2025).</li>
<li>Siempos, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture-induced+sepsis+as+a+model+to+study+autophagy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice.</a> J Vis Exp. (84), e51066(2014).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Prescott, H. C., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+recovery+from+sepsis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Enhancing recovery from sepsis: a review.</a> JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).</li>
<li>Barichello, T., Generoso, J. S., Singer, M., Dal-Pizzol, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+sepsis%3A+more+than+just+fever+and+leukocytosis-a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for sepsis: more than just fever and leukocytosis-a narrative review.</a> Crit Care. 26 (1), 14(2022).</li>
<li>Vulliamy, P. E., Perkins, Z. B., Brohi, K., Manson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+lymphopenia+is+an+independent+predictor+of+mortality+in+critically+ill+emergency+general+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Trauma+Emerg+Surg%22%5BJournal%5D)">Persistent lymphopenia is an independent predictor of mortality in critically ill emergency general surgical patients.</a> Eur J Trauma Emerg Surg. 42 (6), 755-760 (2016).</li>
<li>Pei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+on+the+monitoring+and+treatment+of+sepsis-induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Expert consensus on the monitoring and treatment of sepsis-induced immunosuppression.</a> Mil Med Res. 9 (1), 74(2022).</li>
<li>Lang, J. D., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes%2C+apoptosis+and+sepsis%3A+making+the+jump+from+mice+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes, apoptosis and sepsis: making the jump from mice to humans.</a> Crit Care. 13 (1), 109(2009).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+the+neutrophil-to-lymphocyte+ratio+in+the+prognosis+and+risk+of+death+for+adult+sepsis+patients%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Predictive value of the neutrophil-to-lymphocyte ratio in the prognosis and risk of death for adult sepsis patients: a meta-analysis.</a> Front Immunol. 15, 1336456(2024).</li>
<li>Siegler, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+abdominal+sepsis+induces+selective+and+persistent+changes+in+CTCF+binding+within+the+MHC-II+region+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Postoperative abdominal sepsis induces selective and persistent changes in CTCF binding within the MHC-II region of human monocytes.</a> PLoS One. 16 (5), e0250818(2021).</li>
<li>Pachot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+II+genes+in+whole+blood+from+septic+shock+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA expression of major histocompatibility complex class II genes in whole blood from septic shock patients.</a> Crit Care Med. 33 (1), 31-38 (2005).</li>
<li>Padovani, C. M., Yin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+sepsis%3A+biomarkers+and+specialized+pro-resolving+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in sepsis: biomarkers and specialized pro-resolving mediators.</a> Biomedicines. 12 (1), 175(2024).</li>
<li>Misra, A. K., Levy, M. M., Ward, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of immunosuppression.</a> Crit Care Clin. 36 (1), 167-176 (2020).</li>
<li>Monneret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+response+dominates+after+septic+shock%3A+association+of+low+monocyte+HLA-DR+expression+and+high+interleukin-10+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory response dominates after septic shock: association of low monocyte HLA-DR expression and high interleukin-10 concentration.</a> Immunol Lett. 95 (2), 193-198 (2004).</li>
<li>Bergmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+targets+to+mitigate+trauma-+or+sepsis-induced+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potential targets to mitigate trauma- or sepsis-induced immune suppression.</a> Front Immunol. 12, 622601(2021).</li>
<li>Van Vught, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+risk+factors%2C+and+attributable+mortality+of+secondary+infections+in+the+intensive+care+unit+after+admission+for+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Incidence, risk factors, and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis.</a> JAMA. 315 (14), 1469-1479 (2016).</li>
<li>Jones-Nelson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophilic+response+to+Pseudomonas+damages+the+airway+barrier%2C+promoting+infection+by+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The neutrophilic response to Pseudomonas damages the airway barrier, promoting infection by Klebsiella pneumoniae.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 59 (6), 745-756 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Sepsa jest złożonym zespołem klinicznym, a charakterystyczny stan immunosupresji w jego późnym etapie jest kluczowym czynnikiem prowadzącym do śmierci pacjenta12,13. Dlatego modele przedkliniczne, które dokładnie symulują patofizjologię immunosupresji wywołanej sepsą, są niezbędne do dogłębnego zbadania jej mechanizmów i opracowania nowych terapii. W niniejszym badaniu z powodzeniem opracowałeśmy i zweryfikowaliśmy model sepsy u myszy wywołany intranazalną instul...

Sepsis to krytycznie zagrożona niewydolność narządów wynikająca z niewłaściwej odpowiedzi gospodarza na infekcję1,2,3. Jest to jedna z głównych przyczyn zgonów na oddziałach intensywnej terapii (ICU). Na całym świecie rocznie występuje 48,9 miliona przypadków sepsy, z 11 milionami zgonów związanych z nią4. Pomimo ostatnich postępów w terapii przeciwzakaźnej i technologiach wspomagających pracę narządów, patogeneza sepsy pozostaje niedostatecznie zrozumiana, a opcje leczenia specyficznego są ograniczone. W związku z tym, sepsę stanowi kluczową i wyzwaniem dla klinicznych badań medycznych4.
Modele zwierzęce odgrywają niezastąpioną rolę w podstawowych i translacyjnych badaniach medycznych, służąc jako kluczowe narzędzia do badania patogenezy sepsy i oceny nowych strategii terapeutycznych. Symulując procesy patofizjologiczne ludzkiej sepsy, modele te nie tylko ułatwiają zbadanie kluczowych mechanizmów takich jak zaburzenia odpornościowe i dysfunkcja narządów, ale również zapewniają platformę eksperymentalną do przesiewowego badania leków i opracowywania strategii interwencyjnych. Wśród różnych modeli zwierzęcych, myszy są najczęściej stosowane w badaniach nad sepsą ze względu na ich dobrze zdefiniowany podkład genetyczny, rozległe badania nad ich układem odpornościowym oraz łatwość manipulacji.
Obecnie dostępne są różne modele zwierzęce sepsy oparte na różnych paradygmatach, w tym modele endotoksynowe, modele infuzji bakterii, modele związania i nakłucia okrężnicy (CLP) oraz modele zapalenia otrzewnej po stencie w jelicie grubego (CASP)5. Jednakże, modele te nie posiadają naturalnych dróg infekcji, co sprawia, że trudno jest naprawdę odzwierciedlić kliniczny proces infekcji. Badania wykazały, że zapalenie płuc jest główną przyczyną sepsy w Stanach Zjednoczonych6. Dlatego też, utworzenie modelu sepsy u myszy, który naśladuje naturalne drogi infekcji, wykazuje cechy immunosupresji i jest łatwy do obsługi z wysoką reprodukcyjnością, ma ogromne znaczenie dla pogłębionych badań nad mechanizmami odpornościowymi sepsy i dla oceny potencjalnych strategii interwencyjnych.
Klebsiella pneumoniae (KP) stanowi 3% do 8% wszystkich zakażeń bakteriami nabywanymi w szpitalu7,8,9. Bakteria ta może dostać się do organizmu przez różne drogi, w tym przez układ oddechowy, przewód pokarmowy i drogi moczowe, a także przez skórę, a zakażenia wywołane przez KP mają niekorzystny rokowanie, szczególnie u pacjentów z osłabioną odpornością7,10. Biorąc pod uwagę, że zapalenie płuc jest główną przyczyną sepsy, a KP jest częstym patogenem dróg oddechowych związanym z niekorzystnymi wynikami, KP jest idealnym kandydatem do stworzenia klinicznie istotnego modelu sepsy.
Chociaż wcześniej utworzono różne modele zakażenia KP u zwierząt, w tym metodę donośną, tylko nieliczne badania skupili się na optymalizacji modelu w celu wywołania immunosupresji związanej z sepsą lub określeniu optymalnego stężenia KP dla utworzenia modelu. Ta luka ogranicza przydatność istniejących modeli KP do badania immunosupresji wywołanej sepsą.
Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, stworzyliśmy model immunosupresji wywołanej sepsą u myszy poprzez donoszenie KP do nosa. W porównaniu z istniejącymi modelami, ten model symuluje naturalne drogi infekcji układu oddechowego. Model został dalszy zweryfikowany, aby zapewnić metodę dla dalszych badań.

<table><tbody><tr><td>Biochemical incubator</td><td>YSEI</td><td>SHH-150L</td><td>Inkubacja bakteryjna</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Vital River Laboratories</td><td>8-10 tygodni, samce</td><td></td></tr><tr><td>CD116b</td><td>BioLegend</td><td>101257</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>CD25</td><td>BD bioscience</td><td>740447</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100203</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BioLegend</td><td>100544</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BioLegend</td><td>100752</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>Cell stain buffer&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Stałotemperaturowy shaker</td><td>Honour</td><td>HNY-100B</td><td>Hodowla bakteryjna</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Wysokoprężna wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>AIIEGRA</td><td></td></tr><tr><td>IDEXX catalyst one</td><td>IDEXX</td><td>Catalyst One</td><td>Analiza biochemiczna</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>BioLegend</td><td>505026</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>Strzykawka do insuliny&nbsp;</td><td>WEGO</td><td>1mL</td><td>Pobieranie krwi</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae ATCC 43816</td><td>biobw.org</td><td>bio-81659</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (proszek)</td><td>Solarbio</td><td>L1010</td><td>LB płynne środowisko hodowlane</td></tr><tr><td>LB Broth (proszek)</td><td>Solarbio</td><td>L1015</td><td>LB agar plate</td></tr><tr><td>LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128010</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127606</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>MHC-II</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td>P100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Solarbio</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf6131</td><td>Pomiar gęstości optycznej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>GraphPad Software</td><td>Graphpad Prism10.0</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne i wolne od enzymów końcówki pipet</td><td>Biosharp</td><td>200&mu;L</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TF diluent</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008101</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TF fix/perm</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TF perm/wash</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008102</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta;1</td><td>BioLegend</td><td>141406</td><td>Przeciwciała flow cytometry (Anti-Mouse)</td></tr><tr><td>Varioskan LUX multimodemicroplate reader</td><td>Thermo Scientific</td><td>Varioskan LUX&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Establishment of A Mouse Sepsis-Induced Immunosuppression Model By Intranasal Instillation of Bacteria

Sepsa jest zagrażającym życiu niewydolnością narządów spowodowana niewłaściwą reakcją organizmu na infekcję. Zapalenie płuc jest główną przyczyną sepsy. Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do badania patogenezy sepsy i ewaluacji nowych strategii leczenia. Poprzednie modele zwierzęce sepsy nie miały naturalnych ścieżek infekcji, co utrudniało dokładne odzwierciedlenie klinicznego procesu infekcji.
To badanie wprowadziło model immunosupresji sepsy u myszy, ustanowiony poprzez wprowadzenie do nosa Klebsiella pneumoniae (KP), aby symulować naturalną ścieżkę infekcji dróg oddechowych. Po modelowaniu z różnymi stężeniami KP, stan zapalny modelu został oceniony po 12 h na poziomy cytokiny interleukiny-6 (IL-6), a uszkodzenie narządów zostało ocenione po 24 h na poziomy alaninaminotransferazy (ALT), asparaginanotransferazy (AST), kreatynofosfokinazy (CK) i azotu mocznikowego we krwi (BUN). Współczynnik przeżywalności modelu został przeanalizowany po 7 dniach. Odsetek limfocytów i białych krwinek, proporcja ekspresji kompleksu głównej zgodności tkankowej klasy II (MHC-II) w monocytach oraz średnia intensywność fluorescencji (MFI) dla IL-10 i TGF-β1 w komórkach CD4+ T były obserwowane, aby ocenić immunosupresję u myszy. Po 7 dniach modelowania, wtórną infekcję wykonano poprzez wprowadzenie do nosa Pseudomonas aeruginosa (PA). Obciążenie bakteriami w płynie płucno-oskrzelowym (BALF) 24 h po wtórnej infekcji oraz wskaźnik śmiertelności w ciągu 14 dni zostały ocenione, aby dalsze ocenić immunosupresję modelu.
Wprowadzanie do nosa wysokiego stężenia Klebsiella pneumoniae może skutecznie wywołać immunosupresję. Jego celem jest symulacja sepsy wywołanej naturalną ścieżką infekcji dróg oddechowych i zapewnienie standardowego modelu badań nad sepsy u zwierząt.

W 12 h po podaniu donosowym poziom IL-6 w surowicy w grupie 1 × 108 KP był znacznie podwyższony (p &#60; 0,01, n = 5) (Rycina 2A). W 24 h po podaniu donosowym poziomy w surowicy ALT (p &#60; 0,01, n = 5) (Rycina 2B), AST (p &#60; 0,01, n = 5) (Rycina 2C), CK (p &#60; 0,01, n = 5) (Rycina 2D) oraz BUN (p &#60; 0,01, n = 5) (Rycina 2E) w grupie 1 × 108KP...

Tu przedstawiamy protokół do ustanowienia modelu immunosupresji z powodu wstrzyknięcia Klebsiella pneumoniae do nosa u myszy i zweryfikowaliśmy model za pomocą różnych wskaźników.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Sepsis is a life-threatening organ failure caused by the host&#39;s inappropriate response to infection. Pneumonia is the primary cause of sepsis. Animal ...

establishment-mouse-sepsis-induced-immunosuppression-model-intranasal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Korzystając z zoptymalizowanych testów ex vivo ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), wykazaliśmy, że preparat palnego wyrobu tytoniowego wyraźnie hamuje wewnątrzkomórkowo wydzielane cytokiny za pośrednictwem receptorów i cytolityczną zdolność efektorowych PBMC. Te szybkie testy mogą być przydatne w ocenie produktu i zrozumieniu potencjalnych długoterminowych skutków narażenia na palenie tytoniu.

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Ten artykuł przedstawia dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii beztlenowych, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji bakterii beztlenowych oddziałujących z komórkami gospodarza. Badanie to można zastosować do każdego uprawianego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

Opisano tutaj metodę określania międzykrólestwowych asocjacji i konkurencji (bakteryjnej i grzybiczej) o przyleganie do monowarstw komórek HeLa zakażonych wirusem. Protokół ten można rozszerzyć na wiele kombinacji prokariontów, eukariontów i wirusów.

Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

Inkraplanie przezcewkowe jest trudną procedurą i nie zostało dobrze opisane w literaturze. Celem pracy jest opisanie techniki przezcewkowego wprowadzania cewnika do dopęcherzowego podawania płynów z substancjami czynnymi do pęcherza moczowego i/lub prostaty u dorosłych samców myszy.

Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy

Army Medical University.  Here, we present a protocol for establishing a mouse sepsis immunosuppression model via intranasal instillation of Klebsiella pneumoniae and validated the model through various indicators.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Przeglądaj więcej filmów