ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez: Projekt InnovAntiBiofilm (ref. 101157363) finansowany przez Komisję Europejską (Horizon-Widera 2023 - Acess-02/Horizon-CSA); Projekty MultAntiBiofilm (odniesienie COMPETE2030-FEDER00852000; nr 17121) oraz HCAI_Disinfect (ref. COMPETE2030-FEDER-00752300; nr 16360) finansowany z Programu Operacyjnego Czynniki Konkurencyjności COMPETE oraz z funduszy krajowych Fundacji Nauki i Technologii (FCT); LEPABE, UID/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025) oraz UID/PRR/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025) oraz ALiCE, LA/P/0045/2020 (https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020), finansowane z funduszy krajowych poprzez FCT/MCTES (PIDDAC; Lizbona, Portugalia). Stypendium doktoranckie Mariany Sousy (2023.00337.BD; https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD) jest zapewniane przez FCT.

UWAGA: Proponowana metodologia została zaadaptowana z europejskiej normy EN 127653.
1. Przygotowanie kultury
<ol>
	<li>Kriokonserwować testowane szczepy bakteryjne, Escherichia coli CECT 434 i Staphylococcus aureus CECT 976, poprzez przechowywanie ich w kriovialach z glicerolem 30% (v/v) w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dla odzysku bakterii hodować bakterie na płytkach agaru z liczeniem płytek (PCA) i pozwalać im rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 25 °C, inkubując płytki.</li>
	<li>Przygotuj nocne hodowle szczepów badanych poprzez zaszczepienie jednej kolonii bakterii z rozpraszanej płytki w tryptycznym bulionie sojowym (TSB), aby osiągnąć fazę wykładniczego wzrostu (zgodnie z krzywą kalibracyjną uzyskaną w kolejnych krokach), i inkubację na inkubatorze wstrząsającym przy 100 obr./min i 25 °C.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru uzyskamy krzywą kalibracyjną jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL w funkcji gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) dla każdego odkształcenia bakteryjnego w wcześniej wymienionych warunkach hodowlania.<ol>
		<li>Uprawiaj nocną kulturę bakteryjną w TSB w temperaturze 25 °C z mieszaniem (100 obr./min).</li>
		<li>Przygotuj 10-krotne seryjne rozcieńczenia hodowli w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,85% w NaCl).</li>
		<li>Zmierz OD600 każdego rozcieńczenia za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Rozcieńczenia odpowiednie na płytce na PCA. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Wybierz płytki prezentujące od 10 do 100 kolonii i określ odpowiadające wartości CFU/mL.</li>
		<li>Obliczaj wartości CFU/mL względem odpowiadających odczytów OD600 w zakresie liniowym (0,04–0,8).</li>
		<li>Wykonaj co najmniej dwa niezależne testy z co najmniej dwoma powtórzeniami. Wykonaj analizę regresji liniowej, aby uzyskać równanie kalibracyjne.</li>
		<li>Wykorzystaj uzyskane równanie do oszacowania stężeń bakterii w kolejnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiruj inokulę w dawce 3772 x g przez 10 minut i raz przepłukaj solą buforową fosforanową (PBS) (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 oraz 0,24 g/L KH2PO4).</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru dostosuj OD600 inokuli w PBS do 1 x 10 8 jednostek kolonii (CFU)/mL.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i kontrola roztworów cząsteczek
<ol>
	<li>Rozważ selekcję, badanie i przygotowanie testowanych cząsteczek w następujący sposób: użyj dwóch biocydów – BAC i PAA (15% (w/v) – oraz dwóch fitochemikaliów – SAL i EUG 99%. UWAGA: BAC został wybrany w tym badaniu, ponieważ jest szeroko stosowanym QAC, skutecznym przeciwko bakteriom poprzez zakłócenia błony54,55. Kwas nadoctowy to szerokospektralny utleniający środek dezynfekujący, coraz częściej stosowany do sterylizacji instrumentów medycznych56,57. Kwas salicylowy jest związkiem fenolowym, który budzi zainteresowanie, ponieważ wykazuje działanie antybakteryjne i antybiofilmowe oraz wpływa na mechanizmy zjadliwości bakterii i oporności na antybiotyki, co sugeruje potencjalną rolę w dezynfekcji i kontroli mikroorganizmów58,59. Eugenol to naturalny związek aromatyczny terpenoidowy/fenolowy o uznanych właściwościach antybakteryjnych, który może działać jako bezpieczniejsza, ekologiczna alternatywa dla syntetycznych środków dezynfekujących60,61.</li>
	<li>Przygotuj BAC i PAA świeżo w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Rozpuszczone EUG i SAL zostały rozpuszczone w dimetylosulfoksyde (DMSO), co zapewnia, że komórki nigdy nie były narażone na stężenie DMSO powyżej 5%.</li>
	<li>Przygotuj testowane stężenia BAC, PAA, EUG i SAL, zgodnie z Tabelą 1.</li>
	<li>Przygotuj testowane stężenia w probówkach wirówek o pojemności 15 mL, regulując objętość roztworu zapasowego i zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie cząsteczek i gęstość komórek.</li>
	<li>We wszystkich kolejnych testach uwzględnij dwie negatywne kontrole: (i) bakterie bez leczenia oraz (ii) działanie bakterii na 5% DMSO (ponieważ jest to maksymalne stężenie DMSO, na które są narażone komórki podczas testów).</li>
</ol>
3. Narażenie bakterii na biocydy lub fitochemikalia 
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 1 ml ultraczystej wody i odczekaj 2 minuty.</li>
	<li>Następnie dodaj 8 ml roztworu biocydowego lub fitochemicznego (w wodzie ultraczystej lub 5% DMSO) i inkubuj w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 100 obr./min i 25 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Mieszaj związki z komórkami przez wirowanie.</li>
</ol>
4. Neutralizacja, rozcieńczanie seryjne i powłoka 
<ol>
	<li>Przeprowadz neutralizację każdego biocydu lub fitochemikalia przy każdym testowanym stężeniu za pomocą metody rozcieńczenia-neutralizacji oraz uniwersalnego neutralizatora: 30 g/L polisorbatu 80, 30 g/L saponiny, 1 g/L L-histydyny, 3 g/L lecytyny oraz 5 g/L tiosiarczanu sodu w buforze fosforanowym 0,0025 M.</li>
	<li>Dodaj 1 mL próbki do neutralizacji do 8 ml uniwersalnego neutralizatora i 1 mL ultraczystej wody53.</li>
	<li>Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie szeregowe, dodając 100 μL konkretnego rozcieńczenia do 900 μL bezpłodnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać kolejne rozcieńczenie (powtórz to od rozcieńczenia 10-1 do rozcieńczenia 10-7), a następnie określić pozostałe komórki na zneutralizowanych próbkach, nakładając 10 μL każdej rozcieńczeniny na PCA, zgodnie z metodą drop plate62.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C bez poruszenia przez 24 godziny w celu liczenia komórek.</li>
	<li>CFU były wizualnie liczone dla płyt zawierających więcej niż 10 i mniej niż 100 kolonii, a stężenie, przy którym następuje całkowite zmniejszenie hodowlości, jest rejestrowane jako MBC. Zgodnie z równaniem (1) oblicz CFU/mL, gdzie n to liczba zliczonych CFU, SV to objętość próbki pokrycia (0,01 mL), a Dil to rozcieńczenie, w którym policzono CFU. 
	CFU/mL = n/(SV Dil) (1)</li>
	<li>Oceń redukcję logarytmiczną, redukcję logarytmiczną, zgodnie z równaniem (2), gdzie X0 i X to CFU/mL dla nieleczonej bakterii (kontrolnej) i obtraktowanej bakterii, odpowiednio. 
	redukcja logaritmu = log (X0) - log (X) = log (X0/X) (2)</li>
</ol>
5. Ocena kombinacji podwójnych i potrójnych
<ol>
	<li>Zastosuj opisaną powyżej metodologię do oceny aktywności wszystkich możliwych kombinacji dualnych i potrójnych jednego biocydu i jednego fitochemikalia (dla kombinacji dualnych) lub dwóch fitochemikaliów (dla kombinacji potrójnych) w celu poszukiwania możliwych efektów potencjowania/synergii.</li>
	<li>Rozważmy następujący wybór stężeń: dla kombinacji podwójnych testowane stężenia BAC wynosiły 0,1, 0,5 i 0,75 mg/L; dla PAA to 0,1, 0,3 i 0,5 mg/L; dla SAL to 50, 100 i 250 mg/L; a dla EUG to 100, 250 i 750 mg/L (Tabela 1). Jeśli chodzi o kombinację potrójną, testowane stężenie BAC wyniosło 0,75 mg/L; dla PAA wynosiło 0,5 mg/L; dla SAL to 100 i 250 mg/L; a dla EUG to 250 i 750 mg/L (Tabela 1).</li>
	<li>Wybierz stężenia, wybierając te oceniane w teście dawka-odpowiedź dla poszczególnych cząsteczek, które skutkowały efektem niebakteriobójczym.</li>
</ol>
6. Ocena odbudowy bakterii
<ol>
	<li>Aby ocenić zdolność odrastania bakterii, pozwól komórkom mikroorganizmów rosnąć w płynnym medium przez ponad 24 godziny, w temperaturze 25 °C i 100 obr./min, po leczeniu i neutralizacji.</li>
	<li>Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie szeregowe, powłokowanie, inkubację płytek PCA oraz ilościowe określenie CFU/mL przy użyciu tych samych technik i warunków.</li>
</ol>
7. Interpretacja wyników kombinatorycznych – Frakcjonalny Indeks Stężenia Bakteriobójczego (FBCI) 
<ol>
	<li>Interpretuj wyniki analizy kombinatorycznej w następujący sposób:<ol>
		<li>Dla kombinacji dualnych FBCI = FBC(A) + FBC(B), gdzie ułamkowe stężenie bakteriobójcze A, FBC(A), to stosunek między MBC A w kombinacji dualnej a samym MBC A (tylko kombinacja MBC A/MBCA), a FBC(B) to stosunek między MBC B w kombinacji dualnej a MBC samego B (tylko MBC B/MBCB) (Równanie 3).</li>
		<li>Dla kombinacji potrójnych FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), gdzie FBC(A) to stosunek między MBC A w kombinacji potrójnej a samym MBC A (tylko MBC A/MBCA), FBC(B) to stosunek między MBC B w kombinacji potrójnej a samym MBC B (tylko MBC B/MBCB), a FBC(C) to stosunek MBC C w kombinacji potrójnej oraz MBC do samego C (tylko kombinacja MBCC/MBCC) (Równanie 4).</li>
		<li>Stosując klasyfikację zaproponowaną przez Fernandesa i in.50, FBCI ≤ 0,5 odpowiada synergizmowi, 0,5 < FBCI ≤ 1 wskazuje na addytywność, 1 < FBCI ≤ 4 jako obojętność, a FBCI > 4,00 to antagonizm. 
		FBC(A) + FBC(B) = (MBC dual combination/MBCA sam) + (MBC B dual combination/MBCB sam) (3) 
		FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBC A potrójna kombinacja/MBCA samym) + (MBC B potrójna kombinacja/MBCB sam) + (MBC C potrójna kombinacja/MBCC sam) (4)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Procedura testu reakcji czasowej
<ol>
	<li>Przygotuj nocne hodowle E. coli CECT 434 i S. aureus CECT 976 zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami wzrostu (sekcja 1).</li>
	<li>Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 1 ml ultraczystej wody i odczekaj 2 minuty. W tym momencie należy dodać 8 ml roztworu biobójczego/fitochemicznego (w ultraczystej wodzie lub 5% DMSO), aby osiągnąć pożądane stężenia dla każdej cząsteczki: 1/4 x MBC i MBC, a do zawiesiny bakteryjnej (poprzez korektę OD) przy 100 obr./min i 25 °C. Zmieszaj cząsteczki z komórkami poprzez wirowanie.</li>
	<li>Oceń następujące czasy ekspozycji: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 i 90 minut.</li>
	<li>Jak opisano w sekcji 4, należy oceń aktywność przeciwdrobnoustrojową, obliczając redukcję log (CFU/mL) jako log (X/X0).</li>
	<li>Wykonaj neutralizację biocydową lub fitochemiczną dla każdej pary stężenia/czasu testowanego przy użyciu metody rozcieńczania-neutralizacji oraz uniwersalnego neutralizatora, czyli rozcieńczenia seryjnego i płytowania, jak opisano wcześniej w sekcji 4.</li>
</ol>
9. Analiza danych kombinatorycznych za pomocą oprogramowania Combenefit
<ol>
	<li>Otwórz dostarczony plik 'REPLICATE_TEMPLATE.xls', o https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/, aby zapewnić odpowiednią strukturę i formatowanie.</li>
	<li>Zorganizuj swoje dane w macierz, zgodnie z Tabelą Uzupełniającą 1, gdzie:<ol>
		<li>Zwiększ stężenia produktu A od góry do dołu (z najniższych do najwyższych wierszy numerowanych). Uwzględnij co najmniej trzy różne stężenia dla produktu A.</li>
		<li>Zwiększ stężenia produktu B od lewej do prawej (od najniższych do najwyższych numerowanych kolumn): Dodaj co najmniej trzy różne stężenia dla produktu B.</li>
		<li>Reprezentuj górny wiersz (0 mg/L produkt A) jednoskładnikowy produkt B.</li>
		<li>Reprezentuj pierwszą kolumnę (0 mg/L produkt B) produkt jednoskładnikowy A.</li>
		<li>Reprezentuj komórkę (0,0) jako nieleczoną kontrolę.</li>
		<li>Normalizuj dla każdego przypadku użyte wartości, używając równania (5), gdzie treat_0h to log (CFU/mL) dla konkretnego zabiegu, bezpośrednio po ekspozycji (0h); treat_24h to dziennik (CFU/mL) dla konkretnego zabiegu, 24 godziny po ekspozycji (odrost); control_0h to dziennik (CFU/mL) dla odpowiadającej grupy kontrolnej (tylko komórki lub komórki narażone na 5% DMSO), bezpośrednio po ekspozycji (0 h); a control_24h to dziennik (CFU/mL) dla odpowiadającej grupy kontrolnej (tylko komórki lub komórki narażone na 5% DMSO), 24 godziny po ekspozycji (odrastanie).</li>
		<li>We wszystkich przypadkach przeprowadzić enumerację CFU po 24-godzinnej inkubacji próbek pokrytych na PCA. 
		(treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5) UWAGA: Uwzględnić kontrolne/nieleczone schorzenia określające 100% żywotność oraz pozytywną kontrolę definiującą maksymalne hamowanie (opcjonalnie); Używaj wyłącznie wartości liczbowych, bez wzorów; Używaj tej samej liczby wierszy i kolumn w różnych replikacjach; Użyj '.' jako liczby dziesiętne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz plik jako .xls lub .xlsx.</li>
	<li>Utwórz plik Excel dla każdej replikacji, jak opisano wcześniej i jak w Tabeli Uzupełniającej 1, i dodaj wszystkie pliki do tego samego folderu.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, wersja 2.021, dostępna w https://sourceforge.net/projects/combenefit/).</li>
	<li>Prześlij ten folder do Combenefit.<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Combenefit</li>
		<li>Naciśnij Wybierz folder projektu i wybierz właściwy folder.</li>
		<li>Wybór modelu referencyjnego: addytywność Loewe'a, która zakłada dokładny mechanizm dla obu produktów; Bliss independence zakładająca niezależne działanie, czyli HAS, który jest modelem konserwatywnym (porównuje kombinację z najlepszym pojedynczym agentem). Najlepszą praktyką jest uruchomienie co najmniej dwóch modeli i wybór najlepszego.</li>
		<li>W tym przypadku wybrano model Blissa, biorąc pod uwagę sposób działania testowanych cząsteczek.</li>
		<li>Wybierz pożądane wyjścia graficzne, wiedząc, że musisz wybrać co najmniej jeszcze jeden dla dystrybucji Synergy.</li>
		<li>Analiza serii prasowych (Rysunek uzupełniający 1). Wskazówka: W oknie Wybierz zapisz podczas analizy wybierz Wszystko, aby zapisać wszystkie powstałe wyniki graficzne w oryginalnym folderze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Zastosowanie modeli Chick-Watsona i Weibulla do danych dotyczących dawki i czasu reakcji
<ol>
	<li>Przygotuj swoje dane, formatując zbiór danych w Excelu lub CSV przed importem: Dla dawka-odpowiedź kolumna A odpowiada dawce (stężenie, mg/L), a kolumna B to log (X/X₀); Dla danych odpowiedzi czasowej kolumna A odpowiada czasowi (minutam), a kolumna B logowi (X/X₀).</li>
	<li>Zapisz plik w '.csv' lub skopiuj i wklej bezpośrednio do Prism.</li>
	<li>Open GraphPad Prism (wersja używana: 9.0 dla Windows 11; La Jolla, Kalifornia, USA).</li>
	<li>W Nowej tabeli i wykresie wybierz XY, a w tabeli danych wybierz Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli (Rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>W opcjach, dla X, wybierz Numer, dla Y wybierz Wprowadź wartości replikujące w podkolumnach obok siebie i naciśnij Create (Dodatkowy Rysunek 2).</li>
	<li>Wprowadź dane dawki/czasu w X i zapisz dane o przeżyciu w Y.</li>
	<li>Przejdź do Analizuj, Regresja Nieliniowa (dopasowanie krzywej), wybierz zestawy danych, które chcesz analizować, i naciśnij OK (Ilustracja Uzupełniająca 2).</li>
	<li>Wybierz Nowe i następnie Stwórz nowe równanie.</li>
	<li>W równaniu, dla typu równania, wybierz równanie jawne: Y = funkcja X i parametrów; dla nazwy napisz Chick-Watson Model/Weibull Model; a w definicji zapisz Y = -a*x^(n)*30 Model Chick-Watsona (Rysunek Uzupełniający 3) oraz Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) dla Modelu Weibulla (Rysunek Uzupełniający 4). UWAGA: Model Chick-Watsona wyraża się za pomocą równania 6, gdzie X0 i X to CFU/mL dla nieleczonych bakterii (kontrola) i bakterii objętych zabiegami, C to stężenie (dawka), kdis to współczynnik szybkości inaktywacji, C to stężenie (dawka), n to wykładnik stężenia, a t to czas ekspozycji (w tym przypadku, 30 min)50. Model Chick-Watson został zastosowany do obserwacji dawka-odpowiedź oraz do scharakteryzowania związku między stężeniem środków dezynfekujących a redukcją mikroorganizmów. 
	log (X/X₀) = -kdis · Cⁿ · t (6) UWAGA: Model Weibulla wyraża się za pomocą równania 7, gdzie X0 i X to CFU/mL dla nieprzetworzonych bakterii (kontrolnych) i poddanych bakteriom, t to czas, α to parametr skali (czas charakterystyczny), a β to parametr kształtu50. Model Weibulla zastosowano do obserwacji reakcji czasowej oraz do charakteryzowania kształtu krzywych przeżycia. Parametr skali reprezentuje charakterystyczny czas inaktywacji, natomiast parametr kształtu opisuje odchylenia od logarytmiczno-liniowego zachowania (β = 1 log-liniowy; β < 1 ogon; β > 1 ramię). 
	log (X/X0) = -1/2.303 (t/α)^β (7)</li>
	<li>W Rolach dla wartości początkowych wybierz 0 jako wartość początkową dla każdego parametru oraz (wartość początkową, aby pasować) jako regułę (Rysunek uzupełniający 5).</li>
	<li>Resztę ustawień zachowaj domyślnie i naciśnij OK.</li>
	<li>Wykonaj dopasowanie i sprawdź szacowane parametry.</li>
</ol>
11. Replikacja biologiczna
<ol>
	<li>Przeprowadź, dla wszystkich testów, co najmniej dwa niezależne eksperymenty z co najmniej dwoma replikacjami.</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących interesów finansowych ani konfliktów interesów w pisaniu tego artykułu i nie mają nic do ujawnienia.

Protokół przedstawiony w tym badaniu zapewnia zintegrowane ramy oceny aktywności bakteriobójczej dwóch powszechnie stosowanych biocydów – BAC i PAA – oraz dwóch obiecujących fitochemikaliów – EUG i SAL – indywidualnie i w kombinacji (kombinacje podwójne i potrójne), przeciwko E. coli i S. aureus. Kilka etapów tego protokołu jest szczególnie istotnych dla zapewnienia powtarzalności i dokładnej interpretacji interakcji antybakteryjnych. Obejmują one standaryzację inokulum bakteryjnego, precyzyjne przygotowanie i obsługę ro...

Zakażenia związane ze zdrowiem (HAI) należą do najpoważniejszych i najbardziej niepokojących wyzwań zdrowia publicznego na świecie1. Co niepokojące, są silnie powiązane z rozprzestrzenianiem się wielolekoopornych mikroorganizmów (MDR) oraz utrzymującym się bakteryjnym bioobciążeniem powierzchni szpitali, często z powodu nieodpowiednich lub nieskutecznych praktyk dezynfekcyjnych 2,3. Co więcej, krzyżowe zanieczyszczenie między pacjentami, personelem medycznym i sprzętem medycznym dodatkowo potęguje ten problem 4,5. W Europie szacuje się, że prawie 80 000 hospitalizowanych pacjentów cierpi na co najmniej jedno HAI każdego dnia, co odpowiada około 16 milionom dodatkowych dni szpitalnych rocznie2. Pandemia COVID-19 dodatkowo skomplikowała ten problem, przyczyniając się do wzrostu liczby zakażeń bakteryjnych MDR z powodu częstego stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych/środków dezynfekujących oraz zwiększonej liczby hospitalizacji 6,7. Wzrost bakterii opornych na antybiotyki, w tym Escherichia coli o rozszerzonym spektrum β-laktamazy (ESBL) oraz Staphylococcus aureus (MRSA), doprowadził do rosnącego obciążenia zdrowotnego i ekonomicznego na całym świecie. W rzeczywistości te szczepy podkreślają pilną potrzebę opracowania innowacyjnych rozwiązań w zakresie zapobiegania i kontroli zakażeń 1,8,9.
Mając to na uwadze, biocydy stały się kluczowymi narzędziami do kontroli rozprzestrzeniania się opornych bakterii i infekcji bakteryjnych, szeroko stosowane do dezynfekcji powierzchni szpitalnych, sterylizacji sprzętu, oczyszczania systemów wodnych oraz zapobiegania zanieczyszczeniu urządzeń medycznych10,11. W przeciwieństwie do antybiotyków, które działają na określone cele mikroorganizmów12, biocydy zakłócają jednocześnie wiele struktur komórkowych, w tym błony, enzymy, RNA rybosomalne oraz szlaki metaboliczne13, 14, 15. Początkowo uważano, że to działanie o szerokim spektrum zmniejsza ryzyko oporu. Jednak dowody wskazują, że mikroorganizmy mogą adaptować się do ekspozycji na biocydy, co prowadzi do tolerancji, trwałości, a nawet oporności krzyżowej na antybiotyki10,16. Na przykład ekspozycja Pseudomonas aeruginosa na chlorek benzalkonu wyselekcjonowana dla wariantów opornych na cyprofloksacynę i nowobiocynę poprzez nadekspresję pomp wypływowych17. Podobnie wykazano, że triclosan aktywuje pompy wypływające w Stenotrophomonas maltophilia, podczas gdy ekspozycja na chlorheksydinę wiąże się ze zwiększoną opornością na antybiotyki u S. aureus18.
Ponadto związki amonu czwartorzędowego (QAC), chlorheksydyna, diamidyny, akrydyny i trykłosan, zostały wskazane jako możliwe przyczyny selekcji i utrzymywania się odporności bakterii na kilka antybiotyków19,20. Geny oporności, takie jak qacA/B i smr, są znane z nadawania tolerancji na QAC, a kliniczne niepowodzenia, takie jak bakteriemia związana z cewnikami przechowywanymi w skażonych roztworach QAC oraz wewnętrzne zanieczyszczenie mikrobiologiczne jodoforami, również zostały zgłoszone 16,17,21. Wyniki te podkreślają pilną potrzebę optymalnego wykorzystania biocydów, wspieranego badaniami mechanistycznymi i racjonalnymi strategiami dezynfekcji.
Biofilmy, będące społecznościami bakteryjnymi o wysokiej gęstości komórkowej i dobrze zorganizowanej strukturze, osadzone w zewnątrzkomórkowej matrycy polisacharydów, białek i kwasów nukleinowych, stanowią dodatkową i istotną przeszkodę w kontroli zakażeń22,23. Wykazują niezwykłą tolerancję na antybiotyki i biocydy, co przyczynia się do utrwalania się infekcji u pacjentów. Ponadto biofilmy często są związane z utrzymującym się zanieczyszczeniem urządzeń medycznych, narzędzi chirurgicznych i powierzchni szpitalnych24. Pomimo ich znaczenia klinicznego, biofilmy zostały uznane za główne przyczyny przewlekłych infekcji i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe dopiero w ostatnich dekadach. Ich odporność jest tak silna, że nawet agresywne środki dezynfekujące często nie potrafią ich wyeliminować, pozostawiając po sobie komórki trwałe zdolne do ponownego zasiewania infekcji 20,25,26. Dlatego znalezienie skutecznych strategii antybiofilmowych jest kluczowe dla kontroli HAI oraz zmniejszenia obciążenia zdrowotnego i ekonomicznego patogenami MDR27,28.
Jako obiecujące rozwiązanie, fitochemikalia, czyli metabolity wtórne produkowane i pozyskiwane z roślin, stanowią w dużej mierze niewykorzystane źródło dla nowych środków antybakteryjnych i antybiofilmowych29. Jednak żaden fitozwiązek nie jest stosowany jako antybiotyk, ze względu na jego umiarkowaną aktywność antybakteryjną w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami. Fitochemikalia są rutynowo klasyfikowane jako środki przeciwdrobnoustrojowe na podstawie testów podatności, które dają minimalne stężenie hamujące (MIC) w zakresie od 100 do 1000 μg/mL, co jest wartością znacznie wyższą niż w przypadku konwencjonalnych antybiotyków30,31. Co ważne, fitochemikalia już wykazały aktywność antybiofilmową, gdy są stosowane samodzielnie lub jako wzmacniacze konwencjonalnych biocydów. Na przykład kwercetyna może hamować produkcję alginanu, prowadząc do zmniejszenia adhezji podczas wywoływania biofilmu 32,33,34. Emodyn hamował rozwój biofilmów przez P. aeruginosa, E. coli i S. aureus poprzez zmniejszenie ekspresji kluczowych genów zaangażowanych w tworzenie biofilmu35. Łączenie fitochemikaliów z konwencjonalnie stosowanymi, lecz coraz mniej skutecznymi biocydami jako środkami modyfikującymi oporność stanowi obiecującą strategię zwiększenia skuteczności antybakteryjnej36. Takie synergiczne interakcje mogą zakłócać mechanizmy odporności mikroorganizmów, obniżając minimalne efektywne stężenia biocydów potrzebne do osiągnięcia satysfakcjonującej dezynfekcji37. Takie podejście optymalizuje działanie biobójców, zmniejsza presję selekcyjną na rozwój oporności oraz zmniejsza ekologiczne i toksykologiczne skutki nadmiernego stosowania biocydów15,20. Fitochemikalia są zróżnicowane strukturalnie 38,39,40, szeroko dostępne 38,39,41, niedrogie 38,39,42 i często mniej toksyczne dla ludzi i środowiska niż syntetyczne biocydy 38,39. Są to produkty naturalne, często pozyskiwane z odnawialnych źródeł roślinnych i w niektórych przypadkach wykazują niższą trwałość środowiskową oraz obniżoną toksyczność w porównaniu z niektórymi syntetycznymi biocydami 43,44,45. Chociaż ich koszty, dostępność i profile toksyczności różnią się w zależności od związku i procesu ekstrakcji, kilka fitochemikaliów wykazało korzystne właściwości bezpieczeństwa i środowiska w porównaniu z niektórymi konwencjonalnymi biocydami46,47.
Protokół ten ma na celu ocenę potencjału fitochemikaliów, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu z konwencjonalnymi biocydami, do dezynfekcji w opiece zdrowotnej. Krótko mówiąc, protokół ocenia interakcje biocyd-fitochemikalia w szerokich zakresach stężeń. Biocydy początkowo testowano w stężeniach 0,1–500 mg/L oraz fitochemikalia w stężeniach 50–10 000 mg/L, aby określić minimalne stężenia bakteriobójcze (MBC) (Tabela 1). Dla podwójnych kombinacji wybrano stężenia subbakteriobójcze w następujący sposób: chlorek benzalkonu (BAC) w stężeniach 0,1, 0,5 i 0,75 mg/L; kwas peroctowy (PAA) w stężeniach 0,1, 0,3 i 0,5 mg/L; kwas salicylowy (SAL) w dawkach 50, 100 i 250 mg/L; oraz eugenol (EUG) w stężeniach 100, 250 i 750 mg/L (Tabela 1). Kombinacje potrójne przeprowadzono przy użyciu BAC (0,75 mg/L) lub PAA (0,5 mg/L) w połączeniu z SAL (100 lub 250 mg/L) i EUG (250 lub 750 mg/L) (Tabela 1). Testy odpowiedzi czasowej przeprowadzono w ciągu 1–90 minut, po czym nastąpiła 24-godzinna ocena odrostu bakterii. Interakcje przeciwdrobnoustrojowe są ilościowo określane za pomocą frakcyjnego indeksu stężenia bakteriobójczego (FBCI) i analizowane za pomocą oprogramowania Combenefit, natomiast kinetyka dezynfekcji modelowana jest za pomocą modeli Chick-Watsona i Weibulla, aby scharakteryzować dynamikę zależności od stężenia i inaktywacji.
Innowacja polega na racjonalnym projektowaniu stabilnych podwójnych i potrójnych interakcji między fitochemikaliami a biocydami, optymalizując aktywność dezynfekcyjną przy jednoczesnym minimalizowaniu toksyczności i wpływu na środowisko wynikającego z mniejszego stosowania konwencjonalnych biocydów. Metody matematyczne, takie jak obliczanie FBCI i ocena synergii, były również stosowane do ilościowego określenia interakcji fitochemiczno-biocydowych w kontroli mikroorganizmów. Podczas gdy FBCI oferuje kategoryczną interpretację interakcji (synergii, antagonizmu lub obojętności) przy określonych kombinacjach koncentracji, Combenefit umożliwia bardziej kompleksową, opartą na powierzchni odpowiedzi ocenę wzorców interakcji w szerszym zakresie koncentracji. Pozwala to na wizualizację i ilościowość efektów interakcji zależnych od stężenia, które nie mogą być uchwycone przez indeksy jednopunktowe48,49. Ponadto kinetyka dezynfekcji jest modelowana za pomocą modeli Chick-Watson (dla dawki-odpowiedzi) oraz Weibulla (dla odpowiedzi czasowej)50. Modele te oferują kinetyczne modelowanie inaktywacji mikroorganizmów, oferując ilościowe parametry opisujące tempo dezynfekcji i zachowanie krzywej przeżycia50. Pomagają one scharakteryzować, czy zabijanie przebiega według logologicznej czy nieliniowej dynamiki oraz umożliwiają bardziej mechanistyczną interpretację efektów leczenia, która wykracza poza opis FBCI51,52.
Protokół ten zapewnia systematyczną identyfikację obiecujących kombinacji fitochemikaliów i biocydów oraz opracowanie efektywnej, zrównoważonej strategii dezynfekcji opieki zdrowotnej. W przeciwieństwie do klasycznych testów MIC lub szachownicowych, które zapewniają statyczne pomiary punktów końcowych, protokół ten integruje dynamiczne modelowanie bakteriobójcze i analizy interakcji, aby uchwycić wartość i kinetykę potencjacji. Chociaż klasyczne testy szachownicowe dostarczają cennych informacji o interakcjach hamujących na podstawie punktów końcowych MIC, ograniczają się one do pomiarów wzrostu i wskaźników pojedynczych interakcji. Opisany tutaj protokół wykracza poza te ramy, ilościowo określając aktywność bakteriobójczą zamiast hamowania wzrostu, oceniając odrastanie po leczeniu w celu oceny długotrwałych efektów antybakteryjnych, oceniając zarówno podwójne, jak i potrójne kombinacje biocyd-fitochemikalia, modelując kinetykę dezynfekcji za pomocą podejść Chick-Watson i Weibull oraz stosując analizę powierzchni koncentracji-odpowiedzi za pomocą Combenefit. Ta wielowymiarowa strategia umożliwia bardziej solidną i predykcyjną ocenę potencjacji biocydów i fitochemikaliów.

<table><tbody><tr><td>Chlorek benzalkonu&nbsp;</td><td>Merck, Hiszpania</td><td>8.14363.0100</td><td>Biocyd</td></tr><tr><td>Wirówkowy Mega Star 600R</td><td>VWR, USA</td><td>VWR Mega Star 600R</td><td>-</td></tr><tr><td>Combenefit - Wersja 2.021</td><td>Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>-</td><td>Oprogramowanie do oceny synergizmu</td></tr><tr><td>Kuwetty</td><td>VWR, Niemcy</td><td>VWRI634-0678</td><td>Cuwette 1,5 mL do regulacji gęstości optycznej</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>-</td><td>-</td><td>Dla przygotowania medialnego</td></tr><tr><td>Dimetylsiarczek (DMSO)</td><td>VWR, Francja</td><td>23500.322</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Pętle jednorazowe szczepienia</td><td>VWR, Włochy</td><td>VWRI612-9357</td><td>10 &mu; Pętle inokulacyjne L</td></tr><tr><td>Lampy Eppendorfa</td><td>VWR, Chiny</td><td>VWRI525-1164</td><td>1,5 mL rurek Eppendorf safe-lock&nbsp;</td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Kolekcja Kultury Typowej Hiszpańskiej (CECT)</td><td>434</td><td>Referencyjne odkształcenie użyte w tym badaniu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR, Francja</td><td>83813.36</td><td>Do osuszania plecy roboczej, materiału i rąk</td></tr><tr><td>Eugenol 99%</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>163333</td><td>Fitochemiczne</td></tr><tr><td>Rurki Falcon</td><td>VWR, USA</td><td>VWRI525-1085</td><td>Lampy falcon o pojemności 15 mL</td></tr><tr><td>Rurki Falcon</td><td>VWR, Belgia</td><td>VWRI525-1109</td><td>Rurki Falcon o pojemności 50 mL</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.0 dla Windows 11</td><td>La Jolla, Kalifornia, USA</td><td>-</td><td>Oprogramowanie do analizy matematycznej i statystycznej</td></tr><tr><td>Lecytyna</td><td>Alfa Aesar, Niemcy</td><td>Q04A010</td><td>-</td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Merck, USA</td><td>1.04351.0025</td><td>-</td></tr><tr><td>Inkubator orbitalny</td><td>VWR, USA</td><td>VWR 5000I Inkubacyjny shaker 230V</td><td>-</td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy 15%</td><td>AppliChem, Niemcy</td><td>143495-1211</td><td>Biocyd</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR, Włochy</td><td>VWRI391-0582</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipette 1 - 10 mL</td><td>VWR, USA</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Pipette 100 - 1000 &mu; L</td><td>VWR, USA</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Końcówki pipety 100 - 1000 &mu; L</td><td>Frilabo, Portugalia</td><td>1-202-50-0</td><td>-</td></tr><tr><td>Pippette 20 - 200 &mu; L</td><td>VWR, USA</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Końcówki do Pippette 1 - 10 mL</td><td>VWR, Belgia</td><td>vwri613-7094</td><td>-</td></tr><tr><td>Końcówki do pippette 2 - 200 &mu; L</td><td>VWR, Meksyk</td><td>vwri613-6418</td><td>-</td></tr><tr><td>Plate Count Agar</td><td>VWR, Belgia</td><td>84608-0500</td><td>Izolacja i hodowla mikroorganizmów</td></tr><tr><td>Polisorbat 80</td><td>VWR, USA</td><td>20E2756726</td><td>-</td></tr><tr><td>Chlorek potasu - KCl&nbsp;</td><td>VWR, Belgia</td><td>11D110008</td><td>-</td></tr><tr><td>Fosforan potasu - KH2PO4</td><td>VWR, Niemcy</td><td>26931.263</td><td>-</td></tr><tr><td>Kwas kruszkowy</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>84210-500G</td><td>Fitochemiczne</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>VWR, Niemcy</td><td>21A124103</td><td>-</td></tr><tr><td>Chlorek sodu - NaCl</td><td>VWR, Belgia</td><td>27788.297</td><td>-</td></tr><tr><td>Fosforan sodu - Na2HPO4</td><td>VWR, Belgia</td><td>28026.26</td><td>-</td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu - Na2S2O3</td><td>VWR, USA</td><td>18D2056589</td><td>-</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>VWR, USA</td><td>Spektrofotometr UV-1600PC</td><td>Regulacja gęstości optycznej</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>Kolekcja Kultury Typowej Hiszpańskiej (CECT)</td><td>976</td><td>Referencyjne odkształcenie użyte w tym badaniu</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy &nbsp;</td><td>Merck, Niemcy</td><td>1.05459.0500</td><td>Izolacja i hodowla mikroorganizmów</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>-</td><td>-</td><td>Do przygotowania próbki</td></tr></tbody></table>

in vitro ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

In Vitro Evaluation of the Potentiating Effects of Plant-Derived Molecules on Conventional Biocides

Opracowanie innowacyjnych i efektywnych metod zwiększania aktywności antybakteryjnej konwencjonalnych biocydów to obiecująca strategia poprawy kontroli mikroorganizmów w celach dezynfekcji medycznych. W tym kontekście opisujemy szczegółowy protokół oceny wzmacniających efektów fitochemikaliów pochodzących z roślin na syntetyczne biocydy. Produkty roślinne są atrakcyjnymi kandydatami jako adiuwanty biocydów ze względu na swoją różnorodność strukturalną, bioaktywność i często niższą toksyczność. Opisany tutaj przepływ pracy pozwala na określenie minimalnych stężeń bakteriobójczych (MBC) oraz systematyczne generowanie zarówno krzywych dawka-odpowiedź, jak i odpowiedź-odpowiedź dla każdego testowanego produktu indywidualnie (biocydy i fitochemikalia) oraz dla ich podwójnych lub potrójnych kombinacji. Uzyskane dane umożliwiają zaawansowane modelowanie matematyczne, w tym określenie frakcyjnego indeksu stężenia bakteriobójczego (FBCI) oraz ocenę interakcji między testowanymi produktami pod kątem efektów synergicznych, addytywnych lub antagonistycznych za pomocą oprogramowania Combenefit. W tym sensie możliwe jest zidentyfikowanie obiecujących naturalnych produktów jako wzmacniaczy biocydów, optymalizacja skuteczności antybakteryjnej oraz zaprojektowanie bardziej zrównoważonych i bezpiecznych strategii dezynfekcji, które mogą zmniejszyć stężenia wymagane dla syntetycznych biocydów. To poprawia kontrolę mikroorganizmów i minimalizuje ryzyko środowiskowe oraz zdrowotne związane z nadmiernym używaniem biocydów.

W niniejszym badaniu oceniono aktywność bakteriobójczą wszystkich czterech testowanych związków — BAC, PAA, SAL i EUG — przeciwko E. coli CECT 434 oraz S. aureus CECT 976. Jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 2, BAC, PAA, SAL i EUG wykazały wyraźny efekt zależny od stężenia w odniesieniu do zdolności do hodowli. Tabela 2 przedstawia wartości MBC dla testowanych cząsteczek bezpośrednio po ekspozycji oraz 24 h po ekspozycji (ocena...

Protokół ten zapewnia systematyczne ramy do oceny, w jaki sposób fitochemikalia mogą wzmacniać bakteriobójcze efekty tradycyjnych biocydów, wykorzystując modelowanie aktywności bakteriobójczej oraz testy interakcji kombinatorycznych, które mają na celu identyfikację synergicznych mieszanin poprawiających kontrolę mikroorganizmów i ograniczających ogólne zużycie biocydów.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Developing innovative and efficient approaches to enhance the antimicrobial activity of conventional biocides is a promising strategy for improving ...

in-vitro-evaluation-potentiating-effects-plant-derived-molecules-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

University of Porto.  This protocol provides a systematic framework to assess how phytochemicals can enhance the bactericidal effects of traditional biocides using bactericidal activity modeling and combinatorial interaction assays , which aim to identify synergistic mixtures that improve microbial control and reduce overall biocide usage.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Przeglądaj więcej filmów