Name: Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T13:08:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj protokół syntezy i oceny peptydów przeciwdrobnoustrojowych Mel4 oraz naśladowcy RK-758. Metoda obejmuje testy aktywności przeciwbakteryjnej i cytotoksyczności na komórkach L-929.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Mark Wainwright Analytical Centre and Recombinant Product Facility (RPF) na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii. W szczególności Obiekt Spektrometrii Bioanalitycznej do analizy HRMS oraz obiekt NMR umożliwiający dostęp do instrumentów NMR.

<ol><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+1990%E2%80%932021%3A+a+systematic+analysis+with+forecasts+to+2050%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of bacterial antimicrobial resistance 1990–2021: a systematic analysis with forecasts to 2050.</a> Lancet. 404 (10459), 1199-1226 (2024).</li>
<li>Antimicrobial resistance. , World Health Organization. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance</a> (2023).</li>
<li>Puri, B., Vaishya, R., Vaish, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance%3A+Current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+J.+Armed+Forces+India%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance: Current challenges and future directions.</a> Med. J. Armed Forces India. 81 (3), 247-258 (2025).</li>
<li>Zhang, T., Jin, Q., Ji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+their+mimetics%3A+promising+candidates+of+next-generation+therapeutic+agents+combating+multidrug-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and their mimetics: promising candidates of next-generation therapeutic agents combating multidrug-resistant bacteria.</a> Adv. Biol. 9 (4), 2400461(2025).</li>
<li>Pasupuleti, M., Schmidtchen, A., Malmsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+key+components+of+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system.</a> Crit. Rev. Biotechnol. 32 (2), 143-171 (2012).</li>
<li>Oliveira Júnior, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+structure%2C+functions+and+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: structure, functions and translational applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. , (2025).</li>
<li>Keshri, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LL-37%2C+the+master+antimicrobial+peptide%2C+its+multifaceted+role+from+combating+infections+to+cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">LL-37, the master antimicrobial peptide, its multifaceted role from combating infections to cancer immunity.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 65 (1), 107398(2025).</li>
<li>Alzain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+mechanisms%2C+applications%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential.</a> Infect. Drug Resist. , 4385-4426 (2025).</li>
<li>Kuppusamy, R., Willcox, M., Black, D. S., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cationic+peptidomimetic+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Short cationic peptidomimetic antimicrobials.</a> Antibiotics. 8 (2), (2019).</li>
<li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+chemistry%2C+manufacturing%2C+and+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Science%3A+Chemical+Ligation%2C+Lead+Generation%2C+and+Therapeutic+Advances%22%5BJournal%5D)">Peptides chemistry, manufacturing, and controls.</a> Peptide Science: Chemical Ligation, Lead Generation, and Therapeutic Advances. , 471-508 (2025).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+antimicrobial+peptide+buforin+IIb+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (11), 2121-2126 (2011).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+synthesis%3A+a+review+of+classical+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Peptide synthesis: a review of classical and emerging methods.</a> Biofabrication. 18 (1), 012001(2026).</li>
<li>Gentilucci, L., De Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability%3A+incorporation+of+non-natural+amino+acids%2C+pseudo-peptide+bonds%2C+and+cyclization.%C2%A0Curr.+Pharm+pseudo-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Des%22%5BJournal%5D)">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide bonds, and cyclization. Curr. Pharm pseudo-peptide.</a> Des. 16 (28), 3185-3203 (2010).</li>
<li>Kuppusamy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+anthranilamide+peptidomimetic+design+to+selectively+target+planktonic+bacteria+and+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Tuning the anthranilamide peptidomimetic design to selectively target planktonic bacteria and biofilm.</a> Antibiotics. 12 (3), 585(2023).</li>
<li>Kuppusamy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+functionalized+anthranilamides+as+effective+antibacterials+with+biofilm+disruption+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Guanidine functionalized anthranilamides as effective antibacterials with biofilm disruption activity.</a> Org. Biomol. Chem. 16 (32), 5871-5888 (2018).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat. Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+morphology+analysis+of+bovine+serum+albumin+on+a+micropillar-enhanced+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Adsorption and morphology analysis of bovine serum albumin on a micropillar-enhanced quartz crystal microbalance.</a> J. Phys. Chem. B. 128 (41), 10247-10257 (2024).</li>
<li>Yasir, M., Dutta, D., Willcox, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+antimicrobial+peptides+and+ciprofloxacin+against+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Activity of antimicrobial peptides and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Molecules. 25 (17), (2020).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+susceptibility+of+bacteria+to+antimicrobial+agents.+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. terminology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 4 (5), 291-296 (1998).</li>
<li>Saetan, T., Sukwattanasinitt, M., Wacharasindhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mild+photocatalytic+synthesis+of+guanidine+from+thiourea+under+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A mild photocatalytic synthesis of guanidine from thiourea under visible light.</a> Org. Lett. 22 (20), 7864-7869 (2020).</li>
<li>Woodring, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+conserved+salt+bridge+in+the+trimerization+of+influenza+A+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Disrupting the conserved salt bridge in the trimerization of influenza A nucleoprotein.</a> J. Med. Chem. 63 (1), 205-215 (2019).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Annu.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnol. Annu. Rev. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Deni, W. H., Gao, T., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+peptides%2Fpeptidomimetics+from+DMSO+to+aqueous+buffers+for+circular+dichroism+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting peptides/peptidomimetics from DMSO to aqueous buffers for circular dichroism analyses.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102850(2024).</li>
<li>Lou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+production+systems+and+optimization+strategies+of+antimicrobial+peptides%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial production systems and optimization strategies of antimicrobial peptides: a review.</a> World J. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 66(2025).</li>
<li>Hancock, R. E., Sahl, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+and+host-defense+peptides+as+new+anti-infective+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies.</a> Nat. Biotechnol. 24 (12), 1551-1557 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Opisany tutaj protokół zapewnia kompleksowe ramy produkcji i funkcjonalnej oceny kationowego AMP Mel4 (który można modyfikować do użycia z innymi AMP) oraz mimiki peptydowej RK758. Ten proces łączy wieloetapową syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinowaną w E. coli z testami antybakteryjnymi i cytotoksyczności. Integracja tych podejść zapewnia wszechstronną platformę do systematycznych badań AMP, umożliwiając bezpośrednie porównania między chemicznie syntetyzowanymi a biologicznie produkowanymi peptydami. Kilka etapów tego protokołu jest szczególnie istotnych dla skutecznej produkcji peptydów i oceny aktywności.
RK758 to syntetyczny mimik peptydu oparty na rusztowaniu anthranilamidowym. Podczas fazy przesiewania związków w celu odkrycia nowych naśladowców AMP trudno jest wykorzystać przesiewanie in silico do planowania biblioteki związków. Dlatego ważne jest, aby opierać te mimiki na rusztowaniu umożliwiającym różnorodność w bibliotece związków. Z tego powodu wybrano rusztowanie anthranilamidowe. Dodatkową zaletą rusztowania na bazie anthranilamidu jest to, że metabolit RK758, kwas 5-bromoanthranilinowy, wykazuje właściwości przeciwdrobnoustrojowe.
Poprzednie prace optymalizujące strukturę i działanie antybakteryjne RK758 oraz analogów wykorzystywały inne metody syntetyczne. Oryginalne badanie optymalizacji struktury badało wpływ różnych grup kationowych i podstawników na anthraniliczną grupę fenylową. W związku z tym synteza rozpoczęła się od otwarcia pierścieni pochodnych bezwodnika izatoicznego z estrem metylowym L-tryptofanu. Produkt można było następnie modyfikować, jak wykazali Kuppusamy i in.15. Badanie uzupełniające dotyczyło struktury i lokalizacji grupy hydrofobowej. Badanie uzupełniające wykazało, że rusztowanie podstawione bromo tolerowało różne grupy hydrofobowe na pozycji naftowej, a pośrednia 4 była podatna na krzyżowe sprzężenie Suzukiego na pozycji bromo, jak pokazano na Rysunku 8.
Obecne prace rozwiązują niektóre problemy poprzednich podejść. W podejściu przedstawionym na Rysunku 4, pomimo syntezy pośredniej 11 raportującej oczyszczenie przez triturację eterem dietylowym, próby powtórzenia tego wyniku dały od tego czasu klejki, nieczyste mieszaniny wymagające oczyszczenia chromatograficznego. Dodatkowo, pośredni 6 również wymagał oczyszczenia chromatograficznego przy użyciu tego podejścia. Ogólnie rzecz biorąc, oryginalne badania uzyskały pośrednią wydajność 7 na 21% w sześciu krokach z chlorku chlorku metyloesteru L-tryptofanu. Drugie podejście15, choć o niższej wydajności (14% z Cbz-L-tryptofanu), dało pośrednie substancje łatwiejsze do obróbki w mniejszej liczbie kroków.
Badanie wykazało, że sprzężenie Cbz-L-Trp z N-Boc-etylendiaminą wymaga optymalizacji, aby nie pozostał resztkowy DMF w produkcie, co zaobserwowano podczas wstępnych badań mających na celu zwiększenie tej reakcji. Zastosowanie mieszanego systemu rozpuszczalnika o stosunku 3:8 (v/v) DMF do DCM zmniejszyło ilość DMF, ułatwiając usuwanie podczas obróbki; Jednak zastąpienie chlorowanych rozpuszczalników może budzić obawy dotyczące wpływu na środowisko. Ta modyfikacja zwiększyła również wydajność do 87%, co prawdopodobnie przypisuje się wytrąceniu produktu mocznika z EDC w mieszaninach DCM, działającego jako siła napędowa reakcji. Uwodornienie zostało również zidentyfikowane jako wąskie gardło, ponieważ te reakcje zazwyczaj dają >90%. Badanie wykazało, że podstawienie THF metanolu dało ilościową wydajność 3, w porównaniu do 85% w poprzednich badaniach, oraz skróciło czas reakcji do 4 godzin. Można to również przypisać użyciu czystszego materiału wyjściowego, ponieważ pierwotne badanie prawdopodobnie zawierało resztki DMF, które mogły zatruć katalizator palladowy. Ogólnie rzecz biorąc, w porównaniu z wcześniejszymi podejściami, wydajność do pośredniego 7 wzrosła do 48% w 5 krokach z Cbz-L-Tryptofan. W wcześniejszych eksperymentach (omawianych powyżej) całkowita wydajność wynosiła 21%, przy czym 14% dla reakcji następczych, podczas gdy w tym badaniu uzyskano łączną wydajność 48% dla związku 7, co pokazuje różnorodność analogów, które można syntetyzować z odpowiednio podstawionych pochodnych bezwodnika izatoicznego.
Silnie zdeaktywowana amina w anthranilamidzie 4 (patrz rysunek 8) wymaga trzech odpowiedników chlorku kwasu do efektywnej reakcji. Gdy stosuje się tylko ilości stechiometryczne, dochodzi do niepełnej konwersji 4 do 6, co utrudnia oczyszczanie ze względu na podobne cechy chromatograficzne i rozpuszczalne pośredników 4 i 6. Autorzy przyznają, że jest to ograniczenie rusztowania i pracują nad opracowaniem nowej metodologii ograniczającej nadmiar chlorku kwasu wymaganego.
Przedostatnia reakcja na przyłączenie tiourei 8 do aminy 7 wymaga chlorku rtęci (II), która jest wysoce toksyczna i niezwykle szkodliwa dla środowiska, co potencjalnie uniemożliwia tę metodę do syntezy na dużą skalę. To podejście zastosowano w obecnych pracach, ponieważ przyłączenie tiourei pośredniczone rtęcią (II) odbywa się w temperaturze pokojowej. Alternatywna metoda z użyciem tiourei 8 polega na alkilacji atomu siarki, a następnie nukleofilowym podstawieniu substratem aminowym substratem, jak pokazano na Rysunku 9. Tego typu reakcja została odnotowana, jednak w wielu przypadkach wymaga podwyższonych temperatur i warunków zasadowych, które mogą prowadzić do powstawania produktów ubocznych z podłożami20,21. Alternatywnie, przy użyciu podobnego podłoża metylowanego tiourey, Saetan i in.20 odnotowali podejście fotokatalityczne. Informują, że reakcja ta zachodzi w temperaturze otoczenia pod wpływem promieniowania światłem białej diody LED. Zgłoszono, że reakcja ta zachodzi z różnymi aminami pierwotnymi i wtórnymi, dając produkty przekraczające 80%. W reakcji końcowej trituracja z eterem dietylowym, a następnie liofilizacja daje produkt zazwyczaj nie wymagający dalszego oczyszczania (>95% czyste przez 1H NMR w MeOD-d4). Głównym zanieczyszczeniem jest pozostały, wysokotemperaturowy 1,2-etanol o temperaturze wrzenia, który łatwo wyczuwalny jest po charakterystycznym kapustowym zapachu. Rekombinowana ekspresja Mel4 wymaga indukcji przy optymalnej gęstości optycznej (OD600 0,5–0,6) oraz starannego utrzymania temperatury indukcyjnej, aby zmaksymalizować tworzenie ciał inkluzyjnych przy zachowaniu żywotności bakterii22.
Testy antybakteryjne i cytotoksyczności obejmują również kroki niezbędne do uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników. Wymagane są precyzyjne przygotowanie inokulum i seryjne rozcieńczanie peptydów, ponieważ niewielkie różnice gęstości bakteryjnej lub rozpuszczalności peptydów mogą znacząco zmieniać zmierzone wartości MIC i MBC16. W testach cytotoksyczności MTT kluczowe są dokładne liczenie komórek, jednolite zasiewanie oraz całkowite rozpuszczenie formazanu kluczowe dla uzyskania wiarygodnych odczytów metabolicznych23.
Kilka modyfikacji protokołu może rozwiązać typowe wyzwania. Peptydy o ograniczonej rozpuszczalności wodnej można rozpuścić w kwasie octowym16 o stężeniu 0,01%, natomiast peptydy lub mimiki mogą być również rozpuszczane w DMSO24 lub uzupełniane o 0,1–0,2% BSA17 , aby zapobiec adsorpcji na powierzchniach plastikowych podczas wyznaczania MIC. Ciała inkluzyjne rekombinowane mogą być rozpuszczane i ponownie składane poprzez regulację stężenia chlorku guanidinu lub mocznika, a następnie dializę stopniową. W testach MTT delikatne potrząsanie i całkowite rozpuszczenie DMSO mogą zmniejszyć zmienność odczytów absorpcji.
Znaczenie tego protokołu polega na integracji komplementarnych strategii produkcji i ewaluacji, oferujących przewagę nad standardowymi podejściami jednometodowymi. Wiele badań koncentruje się na jednej metodzie produkcji peptydów lub mimików, ale żadne podejście nie jest idealne dla wszystkich związków; wybór odpowiedniej metody na podstawie właściwości peptydów zapewnia optymalną wydajność i funkcjonalność. Na przykład synteza chemiczna pozwala na precyzyjne włączenie nienaturalnych aminokwasów i peptydowych imitacji4, co może być wyzwaniem w układach rekombinowanych. Natomiast ekspresja rekombinowana oferuje opłacalną produkcję wysoce kationowych peptydów25 , które mogą agregować się podczas syntezy chemicznej. Łącząc obie metody ze standaryzowanymi testami funkcjonalnymi, protokół umożliwia rygorystyczną charakterystykę aktywności i cytotoksyczności AMP, przekraczając zakres standardowych testów MIC26.
W porównaniu z tradycyjnymi, samodzielnymi podejściami, protokół ten jest szeroko stosowany w badaniach nad antybakteryjnymi peptydami oraz w rozwoju terapii. Może być adaptowany do badania zależności struktura-aktywność, optymalizacji mocy peptydów oraz oceny toksyczności. Ponadto metody te mogą wspierać wysokoprzepustowe badania przesiewowe bibliotek peptydów, badanie mechanizmów oporności bakteryjnej oraz ocenę terapii skojarzonych z konwencjonalnymi antybiotykami. Poza zastosowaniami antybakteryjnymi, ten workflow może być również stosowany w testach peptydów przeciwwirusowych lub przeciwgrzybiczych, powłokach powierzchniowych do kontroli infekcji oraz zastosowaniach biomedycznych, takich jak zakłócanie biofilmu czy immunomodulacja.
Podsumowując, protokół ten zapewnia wszechstronny i powtarzalny sposób pracy do produkcji, oczyszczania i funkcjonalnej oceny AMP oraz mimików peptydów. Poprzez uwzględnienie kluczowych kwestii metodologicznych, oferowanie strategii rozwiązywania problemów oraz umożliwianie różnorodnych zastosowań, tworzy solidne podstawy badań antybakteryjnych i biomedycznych.

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stała się poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia1. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), AMR był bezpośrednio odpowiedzialny za około 1,27 miliona zgonów w 2019 roku i przyczynił się do szacunkowych 4,95 miliona zgonów na całym świecie2. Nadużywanie i niewłaściwe stosowanie istniejących antybiotyków uwypukliło pojawienie się patogenów opornych na wiele leków, pozostawiając ograniczone opcje leczenia takich jak bakterie, grzyby, wirusy i pierwotniaki 2,3. Ten kryzys AMR zapoczątkował poszukiwania alternatywnych strategii antybakteryjnych, które są skuteczne, stabilne i mniej podatne na rozwój oporności. Do najbardziej obiecujących kandydatów należą AMP i ich syntetyczne mimiki4.
AMP to naturalnie występujące cząsteczki, które odgrywają kluczową rolę w wrodzonym układzie odpornościowym ludzi, zwierząt i roślin5. Zazwyczaj wykazują szerokospektralną aktywność przeciwdrobnoustrojową poprzez mechanizmy takie jak zakłócenia błon, zakłócenia metabolizmu mikroorganizmów oraz modulację odpowiedzi immunologicznych6. Na przykład ludzki peptyd katelicidyny LL-37 wykazał silną aktywność przeciwko bakteriom, grzybom i wirusom7. Jednak pomimo obiecującego potencjału4, masowe terapeutyczne zastosowanie naturalnych AMP często jest ograniczone przez ich niską naturalną ilość. Dodatkowo, uzyskanie aktywnych form z naturalnych źródeł może być wyzwaniem, ponieważ wiele peptydów wymaga specyficznych modyfikacji potranslacyjnych, aby stały się aktywnefunkcjonalnie 8.
Aby sprostać ograniczeniom związanym z naturalnymi AMP, naukowcy opracowali syntetyczne analogi i naśladowce peptydów. Mimiki mogą być małymi, racjonalnie zaprojektowanymi cząsteczkami, które zachowują przeciwdrobnoustrojową skuteczność naturalnych AMP, jednocześnie oferując lepszą stabilność, selektywność i właściwości farmakokinetyczne9.
Najnowsze osiągnięcia w chemii peptydów i biologii molekularnej umożliwiły efektywną produkcję AMP dzięki metodom takim jak synteza peptydów w fazie stałej (SPPS), synteza peptydów w fazie ciekłej (LPPS) oraz systemy ekspresji rekombinantnej, zapewniając precyzyjną kontrolę kluczowych parametrów strukturalnych, takich jak skład sekwencji, rozkład ładunku i amfipaticzność10. Systemy ekspresji rekombinowanej nadają się do produkcji na dużą skalę oraz do dłuższych lub bardziej złożonych polipeptydów. Po optymalizacji metody rekombinacyjne – zazwyczaj wykorzystujące fermentację lub systemy bioreaktorowe – oferują opłacalne i skalowalne podejście do produkcji peptydów terapeutycznych11.
Niniejszy artykuł prezentuje uzupełniające się podejścia do produkcji i oceny AMP oraz ich naśladowców. Chociaż synteza chemiczna w fazie stałej jest szeroko stosowana do generowania peptydów, może stać się nieefektywna i kosztowna dla dłuższych sekwencji lub wysoce kationowych peptydów ze względu na agregację, niskie wydajności i wyzwania związane z oczyszczaniem12. Natomiast synteza chemiczna pozostaje bardzo korzystna dla generowania krótkich naśladowców peptydów z precyzyjnymi modyfikacjami strukturalnymi oraz nienaturalnych reszt13. Systemy ekspresji rekombinowanej natomiast umożliwiają opłacalną i skalowalną produkcję biosyntetyczną dłuższych lub strukturalnie złożonych peptydów w mikroorganizmach, pokonując ograniczenia długości i wydajności związane z czysto syntetycznymi podejściami12. Integrując strategie produkcji chemicznej i biologicznej, ten połączony system oferuje większą elastyczność, skalowalność i potencjał translacyjny niż każda z tych metod, co czyni je szczególnie odpowiednimi do badań mechanistycznych i rozwoju terapeutycznego.
Po produkcji przeprowadza się biologiczną ocenę tych związków za pomocą dwóch kluczowych testów. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej mierzy potencjał hamujący każdego peptydu lub mimiki wobec reprezentatywnych mikroorganizmów, dostarczając informacji o ich spektrum i silności. Test toksyczności ocenia cytokompatybilność z wykorzystaniem linii komórkowych ssaków, aby zapewnić bezpieczeństwo i selektywność. Integrując te eksperymentalne projektowanie kroków, syntezę i testy funkcjonalne, protokół ten zapewnia kompleksowe ramy do charakteryzacji skuteczności i bezpieczeństwa AMP oraz ich syntetycznych analogów. Razem te metody ustanawiają systematyczne podejście do opracowywania i walidacji nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, aby sprostać rosnącemu globalnemu wyzwaniu AMR.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanol</td><td>Oakwood&nbsp;</td><td>M03555</td><td></td></tr><tr><td>100X antybiotyków</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-20ML</td><td></td></tr><tr><td>1-Etylo-3-(3-dimetyloaminopropylowy) karbodiimid Chlorowodorek</td><td>Bloki Combi</td><td>SS-7536</td><td>Dalej określane jako EDC</td></tr><tr><td>2-chlorek naftoilu</td><td>Bloki Combi</td><td>OR-0173</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Ajax Finechem</td><td>R18401O</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20060.35</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1933</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Mueller-Hinton skorygowany z kationami (CAMHB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>CBZ-L-Trp</td><td>Bloki Combi</td><td>QB-6691</td><td></td></tr><tr><td>Colistin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4461</td><td></td></tr><tr><td>Dey-Engley (D/E) neutralizujący bulion</td><td>Oksoid</td><td>R453042</td><td></td></tr><tr><td>Ziemia okrzemkowa (Celite 545)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102693</td><td>Rozmiar cząstek 0,02-0,1 mm</td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>23366.327</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Chem-Supply</td><td>EA036</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Chem-Supply Pty Ltd&nbsp;</td><td>LCS-CHEM-0098</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol(DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J15397.03</td><td></td></tr><tr><td>Medium kultury DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>UCS-BIO-0058</td><td></td></tr><tr><td>Gospodarz E. coli BL21(DE3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70235-M</td><td></td></tr><tr><td>Elektroportator</td><td>Thermo Scientific</td><td>NEON1SK</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Chem-Supply</td><td>EA011-2.5L-P</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>118432500</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Otagowany TEV Protease&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxybenzotriazole Hydrate</td><td>Chem-Implex</td><td>24755</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Thermo Scientific</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria-Bertani (LB) i</td><td>Thermo Scientific</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizyzy&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89822</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek rtęci (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215465</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (HPLC Grage)</td><td>VWR</td><td>A452-4K</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2128-100MG</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diizopropyletyloamina (DIPEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3440</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetylformamid (DMF)</td><td>Chem-Supply</td><td>RP1051</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-etylendiamina</td><td>Bloki kombi</td><td>AM-1613</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna żywicy NTA Affinity</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70666</td><td></td></tr><tr><td>Pallad na węglu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>205699</td><td>10% w/w PD</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidów</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Mikromiareczki polipropylenowe&nbsp;</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>72.690.008</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej błyskowej</td><td>Krzem</td><td>R12030B</td><td>Żel krzemionkowy 60, siatka 230-400 i piż;</td></tr><tr><td>Płyta chromatografii cienkowarstwowej</td><td>Merk</td><td>1055540001</td><td>Warstwa o grubości 0,2 mm na aluminiowym podkładzie z fluorescencyjnym wskaźnikiem 254 nm</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, 0,2M buforowy solowany</td><td>Thermo Scientific</td><td>J63816. AP</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna, płaska płytka mikromiareczkowa z polipropylenem o pojemności 96 dołków i pokrywką</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina (Et3N)</td><td>Chem-Supply</td><td>TR02151000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62848. AK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>MP BIOMEDICALS AUSTRALIA PTY LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypticaza sojowa agar &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211043</td><td></td></tr><tr><td>Urea&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Wektor (promotor T7)</td><td>-</td><td></td><td>Plazmid o wysokiej liczbie kopii wyboru</td></tr></tbody></table>

produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Production and Testing of Antimicrobial Peptides and Their Mimics

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) i ich syntetyczne naśladowce stają się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnych antybiotyków, szczególnie w odpowiedzi na rosnące zagrożenie opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Naturalnie występujące AMP są niezbędnymi składnikami wrodzonego układu odpornościowego i wykazują szerokospektralną aktywność wobec różnych patogenów drobnoustrojów, podczas gdy ich syntetyczne naśladowce, w tym peptydometyki i analogi polimerowe, zostały zaprojektowane tak, aby zwiększyć stabilność, zmniejszyć toksyczność i poprawić farmakokinetykę. Celem tego badania jest wykazanie produkcji, charakteryzacji i biologicznej oceny AMP oraz naśladowców peptydów w małych cząsteczkach. AMP są generowane za pomocą systemów ekspresji rekombinowanych lub syntezy peptydów w fazie stałej, co umożliwia precyzyjną kontrolę sekwencji aminokwasów i właściwości strukturalnych. Małocząsteczkowe naśladowce peptydów są syntetyczne przy użyciu strategii chemicznych, w tym rusztowania kwasu anthranilowego (2-aminobenzoedozowego), aby zwiększyć stabilność strukturalną i właściwości farmakologiczne. Po syntezie związki są oczyszczane i chemicznie charakteryzowane przed badaniami biologicznymi. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa ocenia się za pomocą testów in vitro o minimalnym stężeniu hamującym (MIC), a cytotoksyczność wobec linii komórkowych ssaków w celu określenia selektywności. Reprezentatywne wyniki pokazują, że zarówno AMP, jak i ich mimiki wykazują silną aktywność przeciwko Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli, podkreślając ich szerokospektralny potencjał antybakteryjny. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia kompleksowe i powtarzalne ramy do rozwoju i systematycznej oceny peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców jako środków przeciwinfekcyjnych nowej generacji.

Synteza RK758 Dane analityczne do średniego 7 zostały opublikowane wcześniej14. Dane analityczne dla RK758 i pośrednich 8–9 są następujące:
Tert-butyl (2-(3-fenylotioureido)etyl)karbamatan (8): Produkt 8 uzyskano jako kremowy materiał stały (1,89 g, 87%); m.p. 167,4–168,3 °C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9,58 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,44–7,29 (m, 4H), 7,11 (t, J = 12,0 Hz, 1H), 6,88 (br s, 1H), 3,55-3,53 (m, 2H), 3,13 (q, J = 4,0 Hz, 2H), 1,59 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 180,9, 156,3, 139,5, 129,1, 124,7, 123,7, 78,2, 44,3, 28,7; HRMS (ESI+): m/z obliczone dla C14H21N3O2SNa+ [M + Na]+: 318.1247, znalezione: 318.1252.
tert-butyl (S,Z)-(3-((1H-indol-3-yl)metylo)-1-(2-(2-naftamid)-5-bromofenyl)-1,4-diokso-9-(fenylimino)-2,5,8,10-tetraazadodekan-12-yl)karbamat (9): Produkt 9 uzyskano jako biały stały materiał (0,253 g, 62%); m.p. 173,4–174,9 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12,23 (s, 1H), 10,86 (s, 1H), 9,61 (s, 1H), 9,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,57-8,54 (m, 2H), 8,44 (s, 1H), 8,11 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 8,06-8,03 (m, 3H), 7,84 (dd, J = 4,0, 12,0 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 12,0 Hz, 2H), 7,69–7,60 (m, 2H), 7,36 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 7,27-7,23 (m, 5H), 7,01-6,97 (m, 3H), 4,82-4,78 (m, 1H), 3,14-3,13 (m, 10H), 1,32 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 172.3, 167.8, 165.1, 156.3, 154.4, 138.9, 136.5, 135.4, 134.9, 132.6, 131.7, 129.9, 129.1, 128.7, 128.4, 128.2, 127.6, 127.6, 126.4, 124.8, 124.1, 123.6, 122.8, 121.4, 118.9, 118.7, 115.1, 111.8, 110.9, 78.4, 55.2, 42.3, 41.9, 39.4, 38.3, 29.5, 28.6, 27.9; HRMS (ESI+): m/z obliczone dla C45H47BrN8O5 [M + H]+: 859.2926, znalezione: 859.2925.
(S,E)-N-(2-((1-((2-((3-(2-aminoetylo)-2-fenylguanidino)etyloamino)amino)3-(1H-indol-3-yl)-1-oksopropan-2-yl)karbamoyl)-4-bromofenyl)-2-naftamid (RK758) (10): 
RK758 uzyskano jako kremowy stały (0,039 g, 75%); m.p. 240,0–240,9 °C; 1 H NMR (400 MHz, MeOD-d 4): δ 8,39 (s, 1H), 8,27 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 7,98–7,95 (m, 3H), 7,88 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,71-7,60 (m, 4H), 7,40 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,30-7,20 (m, 4H), 7,16 (s, 1H), 7,05-6,97 (m, 2H), 4,88-4,86 (m, 1H), 3,33-3,32 (m, 3H), 3,27-3,24 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, MeOD-d 4): δ 174,3, 168,5, 166,4, 154,6, 137,1, 136,7, 135,1, 134,7, 131,4, 132,6, 131,3, 130,8, 129,8, 128,9, 127,97, 127,8, 127,9, 127,6, 127,5, 127,2, 126,8, 125,6, 123,5, 123,24, 123,2, 118,6, 117,8, 116,1, 111,1, 109,6; HRMS (ESI+): m/z obliczone dla C40H39BrN8O3 [M + H]+: 759.2401, znalezione: 759.2407.
Synteza RK758 została przeprowadzona z całkowitą wydajnością 17% z Cbz-L-Tryptofanu w 7 etapach (Rysunek 4). Całkowita wydajność tego procesu wyniosła 44% do kluczowego poziomu pośredniego 7 oraz 19% do RK758. Dane NMR 1H wskazują na wysoką czystość końcowego związku bez istotnych wykrywalnych zanieczyszczeń.
Badanie PCR w kolonii potwierdziło pomyślne wprowadzenie kaset Mel4 i His-KSI-Mel4 do wybranych transformantów (rysunek 5A). Analiza PCR plazmidów izolowanych miniprepem dodatkowo potwierdziła oczekiwany rozmiar amplikonu, wspierając prawidłowe składanie konstrukcji przed transformacją w BL21(DE3) dla ekspresji (Rysunek 5B).
Produkcja rekombinowana i oczyszczanie wysoce kationowego peptydu przeciwdrobnoustrojowego Mel4 Chociaż Mel4 pozyskano komercyjnie od firmy AusPep Peptide Company o minimalnej czystości 90%, był syntetyzowany przez SPPS, a do biologicznej produkcji Mel4 zastosowano również podejście rekombinowane. Na koniec protokołu analiza Western blot białka całkowitego (TCP) z lizowanego osadu komórkowego potwierdziła ekspresję rekombinowanego białka fuzyjnego HIS-KSI-Mel4. Próbki białek zostały rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i zwizualizowane za pomocą drabiny białek jako odniesienia masy cząsteczkowej. Zaobserwowano wyraźny pas odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej białka fuzyjnego HIS-KSI-Mel4, potwierdzający skuteczną ekspresję docelowego białka w komórkach gospodarza (rysunek 5B).
Na podstawie sekwencji białkowej wybranego motywu obliczono teoretyczny skład aminokwasów i porównano je z wynikami eksperymentalnej analizy aminokwasów uzyskanymi z oczyszczonego peptydu HIS-KSI-TEV-Mel4 IB. Porównanie wykazało dobrą korelację między przewidywanymi a eksperymentalnie określonymi stosunkami aminokwasów, potwierdzając dokładność ekspresowanej sekwencji peptydowej oraz jej skuteczną izolację w frakcji ciała inkluzyjnego (Tabela 2).
Asparagina przekształca się w kwas asparaginowy, a glutamina w kwas glutaminowy. Metoda analizy aminokwasów jest niewrażliwa na cysteinę i tryptofan, a te metody nie są analizowane tą metodą. Należy to uwzględnić przy analizie wyników.
Działanie przeciwbakteryjne Mel4 i RK758 Minimalne stężenia hamujące (MIC) RK758, Mel4 i kolistyny oceniono w odniesieniu do dwóch szczepów bakterii Gram-ujemnych, K. pneumoniae JIE 2709 oraz E. coli NCTC 13846 (Tabela 3). RK758 wykazywał MIC 16 μg/mL (21 μM) zarówno przeciwko K. pneumoniae , jak i E. coli. Dla porównania, Mel4 wykazał MIC 62,5 μg/mL (26,6 μM) dla K. pneumoniae oraz 125 μg/mL (53,2 μM) dla E. coli, co wskazuje na niższą moc niż RK758. Kolistyna była stosowana jako antybiotyk porównawczy, wykazując najniższy MIC wynoszący 1 μg/mL (0,87 μM) dla K. pneumoniae, podczas gdy referencyjny szczep oporny na kolistinę E. coli wykazywał MIC 8 μg/mL (6,9 μM).
Efekt cytotoksyczności Mel4 i RK758 Potencjał cytotoksyczny Mel4 i RK758 oceniono w komórkach fibroblastów myszy L929 (ATCC CCL-1) za pomocą testu MTT po 24-godzinnej ekspozycji na stężenia seryjne. Oba związki wykazywały typowe sigmoidalne krzywe dawka-odpowiedź analizowane przez regresję nieliniową w modelu "inhibitor vs. normalizowana odpowiedź - zmienny nachylenie" w GraphPad Prism (wersja 9.5.1), potwierdzając zależną od stężenia hamowanie żywotności komórek. RK758 wykazał wartość CC50 wynoszącą 172,6 μM, podczas gdy Mel4 wykazał nieco wyższą moc cytotoksyczną z CC50 wynoszącą 147,5 μM, co reprezentuje około 1,17 razy większą cytotoksyczność niż RK758 (Rysunek 6 i Rysunek 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie kasety ekspresyjnej p15TV-L-His-KSI-Mel4. Schematyczna mapa konstruktu ekspresji p15TV-L przedstawiająca promotor T7, miejsce wiązania rybosomów (RBS), 6×Jego tag oczyszczający, partnera fuzyjnego izomerazy ketosteroidowej (KSI), miejsce rozszczepienia proteazy TEV oraz sekwencję peptydu Mel4, a następnie terminator transkrypcji T7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: SDS-PAGE i analiza ekspresji białek rekombinowanych metodą western blot. (A) SDS-PAGE ciał inkluzyjnych i białek całkowitych komórek po filtracji i przepływie surowego lizatu komórkowego. (B) Western blot białka całkowitej komórki. Zielona strzałka wskazuje pozycję interesującego białka przy oczekiwanej masie cząsteczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Ilościowa identyfikacja rekombinowanego białka przed i po rozszczepieniu TEV. Wykres słupkowy pokazujący stężenia białek określone za pomocą testu BCA dla frakcji izolowanego ciała inkluzyjnego oraz rozszczepionego rekombinantu Mel4 uzyskanego po leczeniu proteazą TEV. Kreski błędu reprezentują eksperymentalne różnice między pomiarami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Ogólne podejście syntetyczne do uzyskania RK758. Schemat reakcji opisujący siedmiostopniową syntezę chemiczną RK758 zaczynając od Cbz-L-tryptofanu, obejmującą powstawanie pośrednich, transformacje grup funkcjonalnych oraz ostateczną deprotekcję w celu uzyskania mimika peptydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Elektroforeza żelowa agarozy plazmidów rekombinowanych. (a) PCR kolonii transformantów dla His-Mel4 i His-KSI-Mel4. (B) Potwierdzenie plazmidów PCR po miniprep. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig6.jpg" /> 
Rysunek 6. Cytotoksyczność RK758 wobec komórek fibroblastu L929. Krzywa dawka-odpowiedź pokazująca wpływ RK758 na żywotność komórek przy rosnących stężeniach. Wartości CC50 zostały obliczone przez regresję nieliniową przy użyciu modelu "inhibitor vs. normalizowana odpowiedź - zmienny nachylenie" w GraphPad Prism, potwierdzając zależną od stężenia hamowanie żywotności komórek. Dane reprezentują średnią ± SD trzech niezależnych biologicznych replikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig7.jpg" /> 
Rysunek 7: Cytotoksyczność Mel4 wobec komórek L929. Krzywa dawka-odpowiedź pokazująca zależny od stężenia wpływ Mel4 na żywotność komórek. Wartości CC50 zostały obliczone przez regresję nieliniową przy użyciu modelu "inhibitor vs. normalizowana odpowiedź - zmienny nachylenie" w GraphPad Prism, potwierdzając zależną od stężenia hamowanie żywotności komórek. Dane reprezentują średnią ± SD trzech niezależnych biologicznych replikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig7large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig8.jpg" /> 
Rysunek 8: Zmodyfikowana strategia syntetyczna zaczynająca od Cbz-L-tryptofanu. Alternatywna ścieżka syntetyczna ilustrująca przygotowanie anthranilamidowych pośredników z użyciem Cbz-L-tryptofanu oraz kolejne kroki funkcjonalizacji umożliwiające dywersyfikację strukturalną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig9.jpg" /> 
Rysunek 9: Alkilacja tiourei, a następnie podstawienie nukleofilowe substratem aminowym. Proponowana ścieżka reakcji polegająca na alkilacji siarki tiourei, a następnie nukleofilowej podstawieniu substratem aminowym w celu powstania produktów zawierających guanidynę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig9large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sekcja</td>
			<td>Nazwa/Cecha</td>
			<td colspan="4">Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spłony</td>
			<td>XbaI_KNRPR_Start</td>
			<td colspan="4">5'-TAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>T7_TERM_REV</td>
			<td colspan="4">5'-CCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaseta Gene</td>
			<td>Sekwencja aminokwasów His-KSI-Mel4</td>
			<td colspan="4">MDHHHHHMIDETQRKATVLEYFERVNAKDLDGVVKLF ATDAVVADPVGAPPVAGEEALRAYFQRVLHEFDTHDVPGV PSGAQDGQSVALPLKATINNPQDPTGGVRLDVNLVVSVFTIG EDGLISEMRAYWGLTDIAPAGASSGRENLYFQGKNKRKRRR RRRGGRRRR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sekwencja DNA</td>
			<td colspan="4">5'-TAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTTGTTTTAACTTTAAGAAGGA GATATACCATGGATCACCACCACCACCATCATGATGGAGAGAGAC GCAACGTAAAGCGACGGTCTTAGAGTATTTTTGAACGCGTGAATGCAA AAGACTTGGATGGCGTGGTTAAACTCTTTGGGACGGACCCGTGTGT AGCCGACCCTGTTGGCACCACCAGTGGGGGTGGTGAGGCACTC CGTGCCTACTTCCAGCGCGTCTTGCATGAATTTGACACCCATGATCC CGGGCGTTCCATGGTGGTGCTCAGGATGGCCAATCAGTCCCCCAC TTAAAGCAACCATCAACAATCCTCAAGATCCAACAGGGGGGTCCGCC TTGATGTGAACTTAGTGAGCGTATTCACGATTGGCGAAGACGGTAAT CTCCGAGATGCGTGCGTACTGGGGGTGACTGATATGCTCCCCCAGGGTT GCAAGCAGTGGTCGCGAAACTTGTACTTCCAAGGTAAAGAACAAGCGTA AGAGACGCCGGCCCGCCCCGGGGAGGACGGAGAGGCTCCCGAAC TCGAGATCCGGCT-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje primerowe używane do weryfikacji PCR oraz pełna sekwencja kasety genowej ostatecznej konstrukcji plazmidu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminokwasy</td>
			<td>Obliczane</td>
			<td>Testowane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histydyna</td>
			<td>4.70%</td>
			<td>4.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>3.40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginina</td>
			<td>10.70%</td>
			<td>9.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>9.50%</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas asparaginowy</td>
			<td>11.30%</td>
			<td>11.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas glutaminowy</td>
			<td>8.90%</td>
			<td>8.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>4.70%</td>
			<td>4.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanine</td>
			<td>9.50%</td>
			<td>9.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolina</td>
			<td>5.30%</td>
			<td>5.30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lizyna</td>
			<td>4.10%</td>
			<td>4.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrozyna</td>
			<td>2.40%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metionina</td>
			<td>1.80%</td>
			<td>1.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izoleucyna</td>
			<td>3.00%</td>
			<td>3.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucyna</td>
			<td>7.10%</td>
			<td>7.40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenialanina</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>3.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>9.50%</td>
			<td>8.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptofan</td>
			<td>0.60%</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Analiza składu aminokwasów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Szczepy bakteryjne</td>
			<td colspan="3">MIC μg/mL (μM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK758</td>
			<td>Mel4</td>
			<td>Colistin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. pneumoniae JIE 2709</td>
			<td>16 (21)</td>
			<td>62.5 (26.6)</td>
			<td>1 (0.87)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli NCTC 13846</td>
			<td>16 (21)</td>
			<td>125 (53.2)</td>
			<td>8 (6.9)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: MIC RK758, Mel4 oraz kolistyny przeciwko bakteriom Gram-ujemnym.

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Antimicrobial peptides (AMPs) and their synthetic mimics are emerging as promising alternatives to conventional antibiotics, particularly in response to ...

Protokół ten opisuje metodę syntezy i testowania aktywności antybakteryjnej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz peptydowego mimika RK-758. Wcześniej opublikowane prace były fragmentaryczne i niestandaryzowane, co ograniczało powtarzalność i tłumaczenie. Badanie to integruje syntezę, testy biologiczne i badania mechanistyczne w jednolity przepływ pracy.Na początek należy uzyskać peptydowy imitator anthranilamidu RK-758 oraz wysoce kationowy peptyd antybakteryjny Mel4. Rozpuszczaj peptydy w wodzie sterylnej o wysokim stężeniu 20 milimolarnych i sterylizuj zapasy peptydów za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra. Rozpraszając izolat bakteryjny do testu na trypticazowym agarze sojowym, aby uzyskać czyste i dobrze izolowane kolonie.Inkubuj płytę aerobalnie w temperaturze około 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Następnego dnia wybierz od trzech do pięciu morfologicznie podobnych i dobrze izolowanych kolonii, używając sterylnej pętli inokulacyjnej. Przenieś kolonie do sterylnej rurki zawierającej od pięciu do 10 mililitrów bulionu Muellera Hintona dostosowanego kationem. Delikatnie pocieraj pętlę o wewnętrzną ścianę pochylonej rurki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.Inkubuj bulion w temperaturze około 36 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 180 obrotów na minutę przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji wiruj nocną hodowlę w 3000 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Usuń supernatant i przemyj granulat bakteryjny trzy razy sterylnym PBS.Podaj dwa mililitry PBS do sterylnego pojemnika. Dodaj od 50 do 100 mikrolitrów wymytej zawiesina bakteryjnej i wir na pięć do dziesięciu sekund. Dodaj 200 mikrolitrów tej zawiesiny bakteryjnej do płytki o 96 dołkach i dodaj równą objętość PBS jako kontrolę pustą.Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrów. Pożądana wartość absorpcji wynosi 0,1, co odpowiada około jednej do dwóch razy 10 do potęgi ośmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr. Rozcieńcz skorygowaną zawiesinę bakteryjną o jeden do 100 w bulionie Muellera Hintona dostosowanym do kotów, aby uzyskać ostateczne inokulum około 10 do mocy sześciu jednostek tworzących kolonie na mililitr.Oznacz sterylną, płaską płytkę 96-dołkową z nazwą szczepu bakterii antybakteryjnego, datą i inicjałami naukowca. Zaznacz miejsca do testowania, blanku i dołków kontrolnych na pokrywie talerza. Do pierwszej kolumny płytki należy podać 200 mikrolitrów roztworu peptydu antybakteryjnego o najwyższym stężeniu, a następnie dodać 100 mikrolitrów bulionu Mueller Hinton dostosowanego do kationu do pozostałych dołków od kolumny drugiej do kolumny 12.Za pomocą pipety wielokanałowej wykonaj podwójne rozcieńczenia seryjne peptydu antybakteryjnego od kolumny pierwszej do kolumny 10. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego inokulum bakteryjnego w wysokości 10 do potęgi sześciu jednostek tworzących kolonie na mililitr do każdego dołka, z wyjątkiem pustych dołków. Należy podać 100 mikrolitrów kationowego nieskorygowanego bulionu Muellera Hintona do pustych dołków, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów.Przykryj płytkę pokrywką i zabezpiecz parafilmem, aby zapobiec parowaniu. Inkubuj płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrów każdej studni za pomocą czytnika mikropłyt.Oblicz procentowe zmniejszenie wzrostu względem nieleczonej kontroli wzrostu i określ minimalne stężenie hamujące. Następnie określić minimalne stężenie bakteriobójcze. Nasiać komórki fibroblastu myszy L-929 w kolbie o pojemności 75 centymetrów kwadratowych zawierającej DMEM wzbogacone o 10% FBS i 1% antybiotyków, w tym siarczan streptomycyny i penicylinę G. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy stężeniu 5% dwutlenku węgla aż do osiągnięcia konfluencji 75–80%.Gdy się zjednoczy, umyj komórki PBS. Następnie dodaj 0,25% trypsyny EDTA, aby odłączyć komórki. Wymieszaj 50 mikrolitrów zawiesiny ogniwowej z 50 mikrolitrami 0,4% trypanowego niebieskiego i załaduj 10 mikrolitrów tej mieszanki do hemocytometru.Policz żywotne, niezabarwione i martwe niebieskie komórki w czterech narożnych kwadratach hemocytometru i oblicz żywotność komórek według wzoru. Następnie dostosuj końcowe stężenie komórek do pięciu razy 10 do mocy czterech komórek na mililitr za pomocą DMEM. Zasiewaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołku sterylnej płyty o pojemności 96 dołków i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie komórek.Następnie przygotować robocze roztwory Mel4 i RK-758 w DMEM bez FBS i antybiotyków, używając wcześniej przygotowanego roztworu zapasowego. Następnie usuń podłoże hodowlane z każdego dołku i dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego roztworu roboczego do każdego dołku. Następnie dodaj 100 mikrolitrów DMEM jako kontrolę ujemną, DMSO jako dodatnią kontrolę i PBS jako kontrolę pustą do odpowiadających odwiertów.Po 24 godzinach ekspozycji na Mel4 lub RK-758 należy ostrożnie aspirować podłoże testowe, nie naruszając komórek fibroblastu myszy L-929. Przygotuj roztwór roboczy 0,5 miligrama na mililitr MTT, rozcieńczając roztwór pięciomiligramowy na mililitr dziewięć razy czystym DMEM. Dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu roboczego MTT do każdego dołku.Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż utworzą się fioletowe kryształy formazu. Po inkubacji zbadaj komórki pod kątem wytrącenia fioletów pod mikroskopem. Ostrożnie usuń roztwór MTT z każdego dołka i dodaj 100 mikrolitrów DMSO do każdego otworu, aby rozpuścić kryształy formazonu.Umieść płytkę na shakerze na pięć minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie i zmierz absorpcję na 570 nanometrów za pomocą czytnika mikropłyt. Po odejmowaniu pustych wartości absorbancji oblicz żywotność komórek za pomocą równania, a następnie obliczaj wartości IC50 lub CC50. RK-758 wykazywał minimalne stężenie hamujące 16 mikrogramów na mililitr przeciwko obu Klebsiellam.pneumoniae JIE 2709 oraz Escherichia. coli NCTC 13846 szczepy bakteryjne. Mel4 wykazał minimalne stężenia hamujące 62,5 mikrograma na mililitr dla K. pneumoniae i 125 mikrogramów na mililitr dla E. coli.Kolistyna, stosowana jako antybiotyk porównawczy, wykazała najniższe minimalne stężenie hamujące wynoszące jeden mikrogram na mililitr dla K. pneumoniae oraz osiem mikrogramów na mililitr dla referencyjnego szczepu E.coli opornego na kolistynę. RK-758 wykazał zależne od stężenia hamowanie żywotności komórek w komórkach fibroblastu L-929 o wartości CC50 172,6 mikromolaru, Mel4 wykazał nieco wyższą cytotoksyczność niż RK-758 w komórkach L-929 z wartością CC50 na poziomie 147,5 mikromolowym. Protokół ten demonstruje skalowalną produkcję mimiki peptydowej RK-758 oraz ocenę peptydów i ich mimików w celu dalszego odkrywania leków.Analiza uzupełniająca może obejmować badania mechanistyczne, testy stabilności, optymalizację formuł, rozwój oporu oraz zaawansowane badania skuteczności w odpowiednich modelach. Dalsze badania mogłyby dążyć do bardziej ekologicznej produkcji naśladowców peptydów, poprawić efektywność kosztową oraz ocenić skuteczność, bezpieczeństwo i translację kliniczną in vivo.

production-and-testing-of-antimicrobial-peptides-and-their-mimics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Przedstawiamy procedury wykazujące za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że ligandy wiążą się z błoną powierzchniową pierwotniaków trawiących celulozę w jelitach tajwańskich termitów podziemnych oraz że ligandy sprzężone z peptydami litycznymi zabijają te pierwotniaki in vitro (beztlenowa hodowla pierwotniaków) i in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita).

Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Poznaj protokół syntezy i oceny peptydów przeciwdrobnoustrojowych Mel4 oraz naśladowcy RK-758. Metoda obejmuje testy aktywności przeciwbakteryjnej i cytotoksyczności na komórkach L-929.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Przeglądaj więcej filmów