ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują twórcom i opiekunom pakietów Seurat, Giotto oraz SPOTlight za wsparcie i dokumentację. Wyrażamy również wdzięczność za wkład publicznych repozytoriów danych oraz badaczy, którzy bezinteresownie udostępnili swoje zbiory danych.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
	<li>Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.</li>
	<li>Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.</li>
	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
	<li>Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.</li>
	<li>Chen JG, Ch&#225;vez-Fuentes JC, O&#8217;Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w</li>
	<li>Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.</li>
	<li>Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.</li>
	<li>McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.</li>
	<li>Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2</li>
	<li>Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.</li>
	<li>Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.</li>
	<li>Luecken MD, B&#252;ttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.</li>
	<li>Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.</li>
	<li>Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.</li>
	<li>Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.</li>
	<li>Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell&#8211;cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.</li>
	<li>Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell&#8211;cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.</li>
	<li>Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.</li>
	<li>Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.</li>
	<li>Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.</li>
	<li>Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461. </li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy protokół przedstawia kompleksowy przepływ pracy obliczeniowej dla analizy danych z transkryptomiki przestrzennej, który równoważy głębię analityczną z praktyczną dostępnością. Podejście krok po kroku prowadzi badaczy przez cały proces analityczny, od początkowego pozyskania danych po zaawansowane analizy przestrzenne, kładąc nacisk na kluczowe punkty decyzyjne oraz potencjalne pułapki.
Kilka etapów protokołu wymaga szczególnej uwagi ze względu na ich wpływ na dalsze wyniki. Progi kontroli jakości i filtrowania powinny być starannie dostosowane do konkretnych typów tkanek i platform technologicznych, ponieważ zbyt rygorystyczne filtrowanie może usunąć biologicznie istotne plamki, natomiast zbyt łagodne progi mogą wprowadzić szum techniczny. Wybór metody normalizacji znacząco wpływa na późniejszą klasteryzację i wyniki analizy ekspresji różnicowej. Na przykład w potoku przetwarzania wykorzystano SCTransform zamiast standardowej normalizacji logarytmicznej, ponieważ wykazano, że SCTransform modeluje i redukuje zmienność techniczną związaną z głębokością sekwencjonowania oraz inne efekty techniczne w analizach pojedynczych komórek i analizach przestrzennych14,15. Podczas integracji wybór cech integracyjnych oraz parametrów rozdzielczości wymaga uważnego rozważenia, aby zrównoważyć siłę integracji z zachowaniem sygnału biologicznego. Do identyfikacji genów zmiennych przestrzennie wybrano wskaźnik Moran's I ze względu na skalowalność obliczeniową i przydatność do analizy autokorelacji przestrzennej w danych opartych na macierzach, choć w zależności od wielkości zbioru danych i celów badania można rozważyć alternatywne narzędzia, takie jak SPARK16.
Komponent rozwiązywania problemów w ramach tego przepływu pracy koncentruje się na powszechnych problemach z interoperacyjnością, które pojawiają się podczas przekazywania wyników z jednego pakietu do kolejnego. Zamiast polegać na pojedynczym, generycznym kroku konwersji, przepływ pracy wykorzystuje dostosowane konwersje formatów na każdym interfejsie oprogramowania: przestrzenne dane zliczeń są kopiowane do standardowego slotu badania RNA przed integracją w Seurat; obiekty Seurat oraz obiekty referencyjne pojedynczych komórek są konwertowane na obiekty SingleCellExperiment dla SPOTlight; macierze zliczeń przestrzennych są reformatowane dla STdeconvolve; zliczenia, współrzędne i metadane typów komórek pochodzące z Seurat są konwertowane na obiekt Giotto w celu analizy komunikacji międzykomórkowej; a adnotacje ROI z Select Spatial Spots są eksportowane jako pliki CSV z CELL_ID, współrzędnymi X/Y i etykietami grup, aby można było je ponownie przypisać do obiektu Seurat. Kroki te pomagają użytkownikom zidentyfikować i skorygować typowe problemy, takie jak niekompatybilne sloty badań, niedopasowane identyfikatory spotów, brakujące kolumny metadanych, błędne formatowanie współrzędnych oraz niezgodności symboli genów liganda i receptora.
Dodatkową cechą tego przepływu pracy jest zastosowanie dwóch komplementarnych strategii dekonwolucji zamiast polegania na pojedynczym algorytmie. SPOTlight wykorzystuje wcześniejsze referencje scRNA-seq do referencyjnego szacowania proporcji typów komórek, podczas gdy STdeconvolve umożliwia bezreferencyjne wykrywanie ukrytych tematów transkrypcyjnych. W zbiorze danych demonstracyjnych tematy STdeconvolve były zgodne z regionami zdefiniowanymi histologicznie (Rycina 5B), co wspiera interpretowalność biologiczną. W niniejszym protokole nie przeprowadzono bezpośredniego porównania ilościowego obu metod; użytkownicy chcący przeprowadzić ich walidację na własnych danych mogą postępować zgodnie z ramami przedstawionymi w kroku 7.3.2 protokołu. Ponadto protokół wspiera użyteczność i identyfikowalność poprzez zastosowanie skryptów do funkcji podstawowych, oferując jednocześnie interfejs graficzny (Select Spatial Spots) do intuicyjnej izolacji ROI.
Powiązanie programów Seurat i Giotto pozwala na stworzenie przepływu pracy łączącego preprocessing oraz integrację opartą na Seurat z analizą sieci i statystyką przestrzenną w Giotto. Seurat zapewnia sprawdzone środowisko dla badaczy z doświadczeniem w scRNA-seq i wspiera integrację wielu próbek, natomiast przeniesienie zharmonizowanych danych do Giotto umożliwia konstrukcję sieci przestrzennych oraz analizę ligand-receptor. Taka konstrukcja pozwala użytkownikom wykorzystać udokumentowane zalety obu platform, bez sugerowania, że zostały one tutaj zestawione w ramach benchmarku z Squidpy lub innymi ramami analitycznymi. W przypadku komunikacji międzykomórkowej zastosowano analizę ligand-receptor w Giotto opartą na sieci Delaunaya, ponieważ uwzględnia ona sąsiedztwo przestrzenne w tym samym środowisku analitycznym; inne narzędzia, takie jak CellChat, oferują obszerne bazy danych o sygnalizacji, ale nie zostały one ocenione w ramach niniejszego protokołu17.
Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Podejście do dekonwolucji oparte na referencji zależy krytycznie od dostępności wysokiej jakości, dopasowanych referencji jednokomórkowych. Ponadto podstawowe założenia analizy komunikacji międzykomórkowej opierają się na współekspresji transkrypcyjnej jako przybliżeniu fizycznej interakcji białek, co wymaga późniejszej walidacji eksperymentalnej. Wreszcie, niniejszy schemat analizy został opracowany przede wszystkim dla standardowych zbiorów danych Visium. Wraz z rozwojem dziedziny w kierunku technologii o rozdzielczości zbliżonej do pojedynczej komórki, takich jak Visium HD, kwestie analityczne ulegną zmianie; dane o wyższej rozdzielczości mogą wymagać innych parametrów wstępnego przetwarzania i zmniejszyć bezwzględną konieczność dekonwolucji spotów. Aby dostosować ten schemat do zbiorów danych Visium HD, binowe dane o wysokiej rozdzielczości można obliczeniowo zagregować w większe bin przestrzenne lub pominąć moduły dekonwolucji spotów na rzecz segmentacji komórek w oparciu o obraz18.
Cechy te sugerują potencjalną możliwość zastosowania w różnych dziedzinach biologii, w tym w biologii rozwoju, neuronauce, badaniach nad rakiem oraz immunologii19,20,21,22. Modułowa konstrukcja pozwala badaczom na dostosowanie poszczególnych komponentów do ich potrzeb, niezależnie od tego, czy skupiają się oni na identyfikacji domen przestrzennych, komunikacji międzykomórkowej czy specjalizacji regionalnej. W miarę rozwoju technologii przestrzennych i rozszerzania się zbiorów danych, niniejszy protokół stanowi fundament, który może zostać rozbudowany o nowe metody analityczne w celu odpowiedzi na pojawiające się pytania biologiczne.

Transkryptomika przestrzenna (ST) to przełomowa rodzina technologii umożliwiająca pomiar ekspresji genów w całym genomie przy jednoczesnym zachowaniu współrzędnych przestrzennych cząsteczek mRNA (messenger RNA) w przekrojach tkanek. Metody ST obejmują podejścia oparte na sekwencjonowaniu, które wykorzystują macierze z kodami kreskowymi określającymi pozycję, oraz podejścia obrazowe in situ, które mapują sygnały transkrypcyjne w nienaruszonych mikrośrodowiskach tkankowych1,2. Dzięki zachowaniu kontekstu przestrzennego ST umożliwia analizę architektury tkanek, organizacji sąsiedztwa komórkowego, komunikacji międzykomórkowej oraz procesów biologicznych związanych z mikrośrodowiskiem, których nie można w pełni rozstrzygnąć po dysocjacji tkanek3.
Szybki wzrost publicznych repozytoriów danych ST stworzył bezprecedensowe możliwości dla wtórnych analiz i rozwoju nowych metod3. Zasoby takie jak baza danych CROST katalogują setki zestawów danych transkryptomicznych o rozdzielczości przestrzennej u wielu gatunków i na różnych platformach technologicznych, podczas gdy specjalistyczne kolekcje, takie jak STOmicsDB, koncentrują się na konkretnych metodologiach, takich jak Stereo-seq4,5. Pomimo tej obfitości danych, analiza obliczeniowa pozostaje wyzwaniem ze względu na złożoność struktur danych przestrzennych, różnorodność narzędzi analitycznych oraz techniczne przeszkody w implementacji powtarzalnych przepływów pracy6,7,8,9,10,11.
Aby rozwiązać ograniczenia wynikające z polegania na jednym środowisku programistycznym, w niniejszym opracowaniu przedstawiono zintegrowany przepływ obliczeniowy wykorzystujący komplementarne narzędzia analityczne. Istniejące kompleksowe ekosystemy analizy ST obejmują przede wszystkim Seurat, Giotto oraz frameworki oparte na języku Python, takie jak Squidpy6,7,12. Chociaż narzędzia oparte na Pythonie, takie jak Squidpy, oferują szerokie funkcjonalności w zakresie analizy grafów przestrzennych, skonsolidowanie głównej ścieżki obliczeniowej w obrębie jednego języka programowania minimalizuje techniczne trudności związane z wymianą danych między językami. W związku z tym główny proces został zaimplementowany głównie w języku R. W ramach tego przepływu pracy opartego na R, Seurat jest wykorzystywany do ładowania danych, kontroli jakości, normalizacji, redukcji wymiarowości, wizualizacji oraz integracji wielu próbek, co odzwierciedla jego powszechne zastosowanie w analizach transkryptomiki jednokomórkowej i przestrzennej. Następnie Giotto jest wykorzystywane do konstrukcji sieci przestrzennych oraz analizy komunikacji międzykomórkowej w oparciu o interakcje ligand-receptor. Tym samym potok ten łączy wstępne przetwarzanie i integrację w Seurat z analizą przestrzenną w Giotto, zapewniając przy tym jawny i powtarzalny transfer danych między oboma zestawami narzędzi.
W ramach tego podejścia zaimplementowano dwie komplementarne strategie dekonwolucji: SPOTlight, metodę z wykorzystaniem referencji, która używa danych scRNA-seq do szacowania proporcji typów komórek, oraz STdeconvolve, nienadzorowaną metodę modelowania tematów, która identyfikuje utajone wzorce transkrypcyjne8,11. Wyniki dostarczają komplementarnych spojrzeń na przestrzenną heterogeniczność komórkową, jednak nie są traktowane jako ilościowa walidacja krzyżowa, chyba że użytkownicy przeprowadzą opcjonalną analizę zgodności opisaną w protokole. Zintegrowano dedykowaną aplikację Python Dash, Select Spatial Spots, służącą do interaktywnej adnotacji obszarów zainteresowania (ROI), która eksportuje standardowe pliki adnotacji oparte na współrzędnych, mogące być wykorzystane w późniejszych analizach downstream.
W odniesieniu do praktycznego zastosowania, niniejszy schemat postępowania jest przeznaczony przede wszystkim dla standardowych danych ST opartych na matrycach (np. Visium o rozdzielczości 55 µm) i może być dostosowany do innych typów tkanek po ewaluacji parametrów. Przed przystąpieniem do analizy należy rozważyć kluczowe ograniczenia. Po pierwsze, moduł dekonwolucji kierowanej referencyjnie zależy od wysokiej jakości referencji scRNA-seq, dopasowanej do danej tkanki. Po drugie, platformy o rozdzielczości subkomórkowej lub zbliżonej do pojedynczej komórki mogą wymagać zmodyfikowanego wstępnego przetwarzania, agregacji binów przestrzennych lub segmentacji komórek na podstawie obrazów przed integracją2. Reprezentatywny zbiór danych z jelita grubego myszy służy jako przykład demonstracyjny, aby pokazać, w jaki sposób schemat postępowania może oceniać domeny przestrzenne i organizację tkanki zdefiniowaną przez markery, a nie jako dowód na uniwersalną kompatybilność platformy.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>Zaawansowana wizualizacja danych</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>Analiza sieci przestrzennych i komunikacji międzykomórkowej</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>Kompozycja i układ wykresów</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>Podstawowe środowisko wykonawcze (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>Kontrola jakości i wizualizacja danych jednokomórkowych</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>Modelowanie wariancji i detekcja markerów w danych jednokomórkowych</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (Własne narzędzie Python)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>Interaktywny wybór przestrzennych obszarów zainteresowania (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>Preprocessing, integracja i klasteryzacja danych przestrzennych</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>Struktury danych dla danych jednokomórkowych i przestrzennych</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor Core Team</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>Standaryzowany kontener danych dla scRNA-seq</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>Dekonwolucja przestrzenna z wykorzystaniem referencji</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>Nienadzorowane modelowanie tematów latentnych</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>Podstawowy pakiet narzędzi do manipulacji i formatowania danych</td></tr></tbody></table>

praktyczny schemat analizy danych z transkryptomiki przestrzennej: od pozyskiwania danych po analizy zaawansowane

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

Transkryptomika przestrzenna (ST) profiluje ekspresję genów w całym genomie, zachowując dwuwymiarowy kontekst przestrzenny cząsteczek mRNA w przekrojach tkanek, co umożliwia badania architektury tkanek oraz biologii związanej z mikrośrodowiskiem. Analiza ST pozostaje jednak wyzwaniem, ponieważ import danych, kontrola jakości, integracja, dekonwolucja, statystyka przestrzenna i wizualizacja często wymagają wielu środowisk programistycznych i powtarzalnego doboru parametrów. Niniejszy protokół przedstawia praktyczny przepływ pracy obliczeniowej dla publicznych zbiorów danych ST w języku R, rozpoczynający się od pozyskania danych i konfiguracji oprogramowania, a następnie obejmujący ładowanie danych w pakiecie Seurat, kontrolę jakości, normalizację, integrację wielu próbek, klastrowanie oraz analizę genów zmiennych przestrzennie. Następnie przepływ pracy stosuje uzupełniające strategie dekonwolucji, w tym analizę SPOTlight z prowadzeniem referencyjnym oraz nienadzorowane modelowanie tematów STdeconvolve, a po nich analizę przestrzennej komunikacji międzykomórkowej w pakiecie Giotto oraz interaktywny wybór regionów zainteresowania (ROI) przy użyciu niestandardowej aplikacji Python Dash. Kładąc nacisk na wykonywanie za pomocą skryptów, jawne uzasadnienia parametrów, oczekiwane wyniki i punkty kontrolne rozwiązywania problemów, protokół zapewnia adaptacyjną strukturę dla standardowych zbiorów danych ST opartych na macierzach oraz powiązanych platform po ocenie parametrów specyficznych dla zbioru danych i platformy.

Implementacja przepływu pracy i integracja danych ilustrują główne cechy tkanki
Przepływ obliczeniowy zastosowano do danych z transkryptomiki przestrzennej okrężnicy myszy, aby zilustrować oczekiwane wyniki w poszczególnych etapach analitycznych. Jak przedstawiono na schemacie przepływu (Rysunek 1), potok rozpoczął się od pozyskania danych i kontroli jakości, gdzie wykresy cech przestrzennych wyznaczyły granice tkanki (Rysunek 2A,B). Następnie wykorzystano workflow integracji oparty na kotwicach w programie Seurat, aby zredukować techniczne efekty serii przy jednoczesnym zachowaniu interpretowalnej zmienności biologicznej. Wizualizacje UMAP wykazały dopasowanie próbek i wzorce grupowania przestrzennego po integracji (Rysunek 2C,D). W celu ukierunkowania redukcji wymiarowości i późniejszego grupowania wdrożono ilościowy, dynamiczny dobór głównych składowych (PCs) w oparciu o wariancję skumulowaną (patrz Rysunek uzupełniający 1). Analiza mapy ciepła genów markerowych wykazała odmienne profile transkrypcyjne leżące u podstaw klastrów przestrzennych (Rysunek 2E).
Aby ocenić, czy klastry obliczeniowe były zgodne ze znaną architekturą anatomiczną histologii jelita grubego, przeanalizowano profile ekspresji kanonicznych genów markerowych specyficznych dla poszczególnych warstw. Warstwa nabłonka śluzówki wykazała ekspresję markerów komórek nabłonkowych, w tym Epcam i Krt8, wraz z markerem komórek kubkowych Muc2. Markery mezenchymalne i stromalne, takie jak Col1a1 i Vim, oznakowały obszary błony właściwej oraz podśluzowej, natomiast zewnętrzną warstwę błony mięśniowej właściwej wskazywały geny strukturalne mięśni gładkich, takie jak Acta2 i Tagln. Przestrzenne ograniczenie tych markerów związanych z liniami komórkowymi potwierdza interpretację, że proces integracji i klastrowania zachował główne laminacje histologiczne tkanki jelita grubego wzdłuż osi od śluzówki do błony mięśniowej (patrz Rycina uzupełniająca 2).
Po walidacji klastrów przeprowadzono analizę ekspresji różnicowej w celu zidentyfikowania genów różnicowo eksponowanych (DEGs) pomiędzy warunkami eksperymentalnymi (Ryc. 2F,G). Ponadto, wykorzystując statystykę I Morana, zidentyfikowano geny zmienne przestrzennie, wskazując geny o znaczącym nierandomowym rozkładzie przestrzennym w tkance (Ryc. 2H).
Dekonwolucja komórkowa i przestrzenne sieci interakcji ujawniają mikroorganizację tkanki
Przetwarzanie referencyjnych danych scRNA-seq pozwoliło uzyskać adnotacje potwierdzone filtrowaniem QC (Rysunek 3A), klastrowaniem nienadzorowanym (Rysunek 3B), walidacją genów markerowych (Rysunek 3C) oraz zgodnością z niezależnymi adnotacjami (Rysunek 3D). Skład komórkowy (Rysunek 3E) posłużył do opracowania strategii downsamplingu dla dekonwolucji. Narzędzie SPOTlight oszacowało proporcje typów komórek sterowane referencjami w poszczególnych punktach przestrzennych (Rysunek 4A,B), natomiast STdeconvolve zapewniło nienadzorowany wgląd w przestrzenne wzorce komórkowe za pomocą modelowania tematów (Rysunek 5B). Niestandardowe narzędzie Select Spatial Spots dostarczyło kontekstu histologicznego dla tych wzorców (Rysunek 5A). Na koniec, z wykorzystaniem przypisanych typów komórek po dekonwolucji, analiza komunikacji przestrzennej zidentyfikowała oddziaływania ligand-receptor pomiędzy grupami typów komórek znajdującymi się blisko siebie w przestrzeni (Rysunek 6A,B).
Uwagi dotyczące rozwiązywania problemów wynikające z optymalizacji protokołu
Podczas optymalizacji protokołu zidentyfikowano kilka problemów, które posłużyły do ustanowienia praktycznych punktów kontrolnych. Suboptymalne wyniki dekonwolucji występowały, gdy referencje pojedynczych komórek były słabo dopasowane do kontekstu tkankowego, co wskazuje na konieczność stosowania danych scRNA-seq dopasowanych pod kątem tkanki i gatunku, jeśli są one dostępne. Początkowe próby klastrowania z domyślnymi parametrami nie zawsze pozwalały na wyodrębnienie oczekiwanych struktur biologicznych; analiza wyboru PC, rozdzielczości klastrowania oraz spójności genów markerowych pomogła zidentyfikować interpretowalne przestrzennie domeny zgodne z anatomią tkanki. Obserwacje te stanowią praktyczne przykłady tego, jak użytkownicy mogą diagnozować typowe problemy analityczne podczas realizacji przepływu pracy.
<img alt="Schemat przepływu analizy danych scRNA-seq. Procesy: normalizacja, integracja, klastrowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat zintegrowanej analizy transkryptomiki przestrzennej. Schematyczne przedstawienie potoku analitycznego, od pozyskiwania i wstępnego przetwarzania danych po zaawansowane analizy przestrzenne. Kluczowe etapy obejmują: (1) ładowanie danych, kontrolę jakości i integrację wielu próbek przy użyciu Seurat; (2) klastrowanie przestrzenne i wykrywanie genów zmiennych przestrzennie; (3) dekonwolucję typów komórek via metody oparte na referencjach (SPOTlight) oraz metody nienadzorowane (STdeconvolve); (4) analizę przestrzennej komunikacji międzykomórkowej z pomocą Giotto oraz interaktywny wybór obszarów zainteresowania za pomocą niestandardowego narzędzia Select Spatial Spots. Wyniki ze wszystkich modułów są syntetyzowane w celu uzyskania biologicznych wniosków dotyczących architektury tkanki i mikrośrodowiska komórkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza transkryptomiki przestrzennej z wykorzystaniem wykresów skrzypcowych, klastrowania t-SNE, wykresu wulkanicznego oraz mapy ciepła danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Integracja danych, klasteryzacja i analiza ekspresji różnicowej. (A,B) Metryki kontroli jakości dla próbek przestrzennych A1 i B1, przedstawiające rozkłady liczby genów, liczby UMI oraz odsetka genów mitochondrialnych. (C) Wizualizacja UMAP zintegrowanych danych transkryptomiki przestrzennej, z kolorowaniem według pochodzenia próbek (lewa) oraz tożsamości klastrów (prawa). (D) Projekcja przestrzenna tożsamości klastrów na przekroje tkankowe. (E) Mapa ciepła najważniejszych genów markerowych dla każdego klastra przestrzennego. (F) Wykres wulkaniczny przedstawiający geny różnicowo wyrażone pomiędzy warunkami A1_colon_d0 a B1_colon_d14. (G) Wzorce ekspresji przestrzennej reprezentatywnych genów różnicowo wyrażonych w przekrojach tkanek. (H) Mapy ekspresji przestrzennej zidentyfikowanych genów o największej zmienności przestrzennej poprzez Statystyka I Morana, gdzie dwa lewe panele przedstawiają geny z próbki A1_colon_d0, a dwa prawe panele przedstawiają geny z próbki B1_colon_d14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza scRNA-seq: wykresy skrzypcowe, klastry UMAP, wyniki typów komórek i rozkład na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przetwarzanie i adnotacja referencyjnych danych jednokomórkowych. (A) Metryki kontroli jakości dla referencyjnych danych scRNA-seq przed i po filtrowaniu. (B) Wizualizacja UMAP danych scRNA-seq z kolorowaniem według klastrów nienadzorowanych. (C) Wykres kropkowy (dot plot) przedstawiający wyniki ekspresji kanonicznych genów markerowych dla typów komórek w poszczególnych klastrach. (D) Adnotowana wizualizacja UMAP danych scRNA-seq z oznakowanymi głównymi typami komórek. (E) Skład komórkowy referencyjnego zbioru danych scRNA-seq. Czerwona przerywana linia wskazuje próg downsamplingu (n = 50 komórek na typ) zastosowany podczas dekonwolucji SPOTlight w celu zrównoważenia wydajności obliczeniowej i reprezentacji typów komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład typów komórek, obrazy mikroskopowe; analiza limfocytów B, komórek śródbłonka i fibroblastów w tkankach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przestrzenna dekonwolucja heterogeniczności komórkowej. (A,B) Przestrzenne wykresy typu scatterpie z dekonwolucji SPOTlight, przedstawiające proporcjonalny skład głównych typów komórek w każdym punkcie dla próbek A1 (A) i B1 (B). (C) Reprezentatywny rozkład przestrzenny limfocytów B w próbkach A1 (lewo) i B1 (prawo), demonstrujący wzorce lokalizacji z rozdzielczością przestrzenną dla konkretnej populacji komórek odpornościowych zidentyfikowanej za pomocą dekonwolucji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza przestrzennej ekspresji genów, schemat przedstawiający typy komórek i grupy pikseli w przekroju tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Interaktywna analiza obszarów zainteresowania i porównanie dekonwolucji nienadzorowanej. (A) Interfejs autorskiego narzędzia „Select Spatial Spots”, pokazujący interaktywny wybór obszarów odpowiadających bliższej części okrężnicy, dalszej części okrężnicy oraz innym domenom tkankowym. (B) Wizualizacja w formie wykresu scatterpie wyników dekonwolucji nienadzorowanej (STdeconvolve) dla próbki A1, w której punkty są pokolorowane zgodnie z ręcznie adnotowanymi obszarami z (A), co ilustruje zgodność między adnotacją opartą na histologii a obliczeniowo wyprowadzonymi rozkładami tematów komórkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat komunikacji międzykomórkowej z oddziaływaniami ligand-receptor i wartościami log2fc; diagram pęcherzykowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przestrzenne sieci komunikacji międzykomórkowej. (A,B) Sieci oddziaływań ligand-receptor wywnioskowane przez Giotto dla próbek A1 (A) i B1 (B). Węzły reprezentują typy komórek, krawędzie reprezentują istotne pary ligand-receptor (FDR &lt; 0.05), a grubość krawędzi odpowiada sile oddziaływania. Aby zapewnić porównywalność i przejrzystość wizualizacji, we wszystkich próbkach zastosowano jednolity próg istotności (FDR &lt; 0.05) i wyświetlono 20 najważniejszych oddziaływań uszeregowanych według log2FC dla każdego stanu. Sieci podkreślają specyficzne dla typu komórek wzorce komunikacji w kontekście przestrzennym tkanki jelita grubego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Ilościowa ocena optymalizacji parametrów dla redukcji wymiarowości.Wykres łokciowy przedstawia programowe podejście przepływu pracy do dynamicznego wyboru optymalnej liczby głównych składowych (PCs). Wybór jest obliczany na podstawie skumulowanego odchylenia standardowego i progów wariancji marginalnej, reprezentowanych przez czerwoną linię pionową, aby uchwycić wariancję biologiczną przy jednoczesnym ograniczeniu szumu technicznego przed późniejszą klasteryzacją.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Walidacja klastrowania przestrzennego z wykorzystaniem kanonicznych markerów specyficznych dla warstw jelita grubego. (A) Wykres punktowy (dot plot) przedstawiający wzbogaconą ekspresję markerów nabłonkowych, zrębowych i mięśni gładkich w klastrach obliczeniowych. (B) Przestrzenne wykresy cech mapujące reprezentatywne markery (Epcam, Col1a1, Acta2) z powrotem na współrzędne tkanki.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Niniejszy protokół przedstawia powtarzalny schemat analizy danych transkryptomiki przestrzennej, prowadząc użytkownika od pozyskania danych publicznych i kontroli jakości w oparciu o pakiet Seurat, poprzez integrację, detekcję cech przestrzennych, dekonwolucję typów komórek, adnotację obszarów zainteresowania, aż po analizę komunikacji międzykomórkowej, z uwzględnieniem praktycznych punktów kontrolnych wspierających przejrzystość wykonania.

Praktyczny schemat analizy danych z transkryptomiki przestrzennej: od pozyskiwania danych po analizy zaawansowane

Transkryptomika przestrzenna (ST) profiluje ekspresję genów w całym genomie, zachowując dwuwymiarowy kontekst przestrzenny cząsteczek mRNA w obrębie tkanki ...

Witajcie wszyscy. W tym filmie przeanalizujemy praktyczny potok analizy danych z transkryptomiki przestrzennej, od pozyskiwania i ładowania danych, przez podstawową eksplorację, aż po analizy zaawansowane. Cały proces składa się z trzech głównych etapów.W pierwszej kolejności należy pobrać dane, następnie uzyskać kod analityczny, a na koniec uruchomić potok przetwarzania w celu wygenerowania wyników. Krok pierwszy: pozyskanie danych i przygotowanie struktury katalogów. Najpierw należy pozyskać publiczne zestawy danych z transkryptomiki przestrzennej.Pobierz archiwum z surowymi danymi. Następnie rozpakuj archiwum. Zorganizuj pliki w ustandaryzowanej strukturze katalogów.Najpierw należy utworzyć główny katalog danych, a następnie dedykowany podkatalog dla każdej próbki. Przenieś następujące niezbędne pliki dla każdej próbki do odpowiedniego podkatalogu. Następnie utwórz podfolder przestrzenny wewnątrz katalogu każdej próbki.Umieść następujące pliki w podfolderze spatial. Umieść plik S1 z metrykami PC przefiltrowanych cech w głównym podkatalogu próbki. Rozpakuj pliki gzip w folderze spatial.Upewnij się, że oryginalne nazwy plików pozostają dokładnie takie, jak wymagają tego funkcje ładowania danych spatial 10X. Krok drugi: konfiguracja środowiska programistycznego. W tym miejscu pomijamy instalację języka R, a proces rozpoczyna się od pobrania skryptu analitycznego z repozytorium GitHub.Zainstaluj wymagane pakiety R z Graham w programie File Conductor, uruchamiając skrypt setup R. Zainstaluj AutoSuit, wykonując polecenia instalacyjne podane w oficjalnym arkuszu dokumentacji. Przejdź do oficjalnego adresu URL instalacji, aby pobrać skrypty konfiguracyjne. Zainicjuj wymagane środowisko Python oraz zależności systemowe zgodnie z instrukcjami na stronie konfiguracji.Uzyskaj niestandardowe narzędzie, przechodząc do repozytorium GitHub, i pobierz kod źródłowy. Przejdź do katalogu TOS i zainstaluj zależności języka Python. Krok trzeci: ładowanie danych przestrzennych i kontrola jakości.Wczytaj dane przestrzenne do obiektu Seurat. Użyj funkcji read 10X image, aby ręcznie załadować wysokorozdzielczy obraz tkanki, określając ścieżkę do obrazu oraz jego nazwę.Użyj funkcji load 10X spatial z parametrem image ustawionym na obiekt obrazu utworzony w poprzednim kroku i utwórz obiekt Seurat. Oblicz wskaźniki kontroli jakości. Oblicz procent odczytów mitochondrialnych, używając funkcji PercentageFeatureSet z wzorcem mt.Wizualizuj i interpretuj dane na podstawie wskaźników kontroli jakości (QC). Wygeneruj wykresy skrzypcowe dla nCount_Spatial, nFeature_Spatial oraz percent.mt, korzystając z funkcji wykresu skrzypcowego.Utwórz wykresy cech przestrzennych dla tych metryk, korzystając z wykresów cech przestrzennych. Następnie zidentyfikuj plamy znajdujące się poza obszarem tkanki. Opcjonalnie zastosuj filtry w celu usunięcia plam o niskiej jakości.Po uruchomieniu skryptu można uzyskać następujące wyniki, w tym wskaźniki kontroli jakości (QC) oraz wykres przestrzenny cech. Krok czwarty: wstępne przetwarzanie danych, integracja i klasteryzacja. Przeprowadź normalizację podczas wstępnego przetwarzania poszczególnych próbek.Zastosuj normalizację SCTransform dla każdej próbki oddzielnie z użyciem parametrów assay Spatial. Zintegruj wiele próbek. Przygotuj listę obiektów znormalizowanych za pomocą SCTransform do integracji.Upewnij się, że każdy obiekt posiada analizę RNA poprzez skopiowanie analizy przestrzennej. Użyj funkcji select integration w integracji PREP SCT, aby zidentyfikować wspólne cechy zmienne. Znajdź kotwice integracji za pomocą funkcji find integration anchors, stosując metodę normalizacji SCT.Zintegruj dane za pomocą funkcji IntegrateData. Przeprowadź redukcję wymiarowości w klastrowaniu na zintegrowanym badaniu. Uruchom analizę PCA na zintegrowanych danych, korzystając z funkcji runPCA.Wyznacz optymalną liczbę głównych komponentów do dalszej analizy poprzez obliczenie skumulowanej wariancji wyjaśnionej. Programowo zidentyfikuj punkt przegięcia (tzw. elbow point). Uruchom algorytm UMap, korzystając z wyznaczonej liczby PC.Pogrupuj komórki, korzystając z funkcji FindNeighbors i FindClusters. Określ wyznaczone PC przy ustawieniu resolution na 0.5. Przeprowadź analizę ekspresji różnicowej między grupami docelowymi za pomocą funkcji FindWorkers.Zidentyfikuj geny o zmienności przestrzennej. Dla każdej oryginalnej próbki uruchom funkcję find spatially variable features, stosując metodę Moran's I w ramach analizy SCT, aby obliczyć przestrzenną autokorelację. Po uruchomieniu tego skryptu można uzyskać wykres łokciowy (elbow plot), wykres UMap, wykres klastrów, mapę ciepła markerów klastrów, wykres wulkaniczny (volcano plot), geny o różnej ekspresji cech przestrzennych, geny wiarygodne przestrzennie oraz markery warstw jelita grubego.Oraz wykres punktowy markerów warstwy okrężnicy, wraz z markerami na wykresie cech przestrzennych. Krok piąty, wstępne przetwarzanie referencyjnych danych jednokomórkowych. Odczytaj macierz zliczeń RNA-seq z pojedynczych komórek za pomocą funkcji read 10X i utwórz obiekt Seurat.Przeprowadź standardową normalizację QC oraz usuwanie klastrów (declustering). Oblicz procent odczytów mitochondrialnych w filtrowanych komórkach. Znormalizuj dane przy użyciu transformacji SC.Ustaw zmienną do regresji percent.mt. Wykonaj analizę PCA, UMap i zgrupuj komórki, korzystając z metody dynamicznego wyboru PC opisanej w poprzednich krokach, a następnie przypisz typy komórek.Oblicz wyniki modułów dla kanonicznych genów markerowych typów komórek przy użyciu funkcji AddModuleScore. Przypisz adnotacje do klastrów na podstawie wyników modułów oraz znanej biologii. Alternatywnie zaimportuj wcześniej obliczone adnotacje z metadanych.Po uruchomieniu tego skryptu można uzyskać metryki kontroli jakości (QC). Przesłano wykresy UMap z podziałem na klastry, UMap z podziałem na próbki oraz wyniki dla typów komórek. Krok szósty to dekonwolucja prowadzona przez referencję przy użyciu SPOTlight.W pierwszej kolejności należy przygotować dane do analizy w programie SPOTlight. Obiekt Seurat z adnotacjami dla pojedynczych komórek oraz przestrzenny obiekt Seurat należy przekonwertować na obiekt SingleCellExperiment. Następnie należy przeprowadzić logarytmiczną normalizację danych z pojedynczych komórek przy użyciu funkcji LogMoreCounts.Następnie przeprowadź dekonwolucję SPOTlight. Najpierw zidentyfikuj geny o wysokiej zmienności w danych jednokomórkowych, korzystając z ModelGeneVar. Oblicz markery typów komórkowych za pomocą score markers i odfiltruj markery o wysokiej jakości.Zredukuj próbkę referencyjną dla pojedynczych komórek dla każdego typu komórek do zarządzalnej liczby, aby skrócić czas obliczeń. Przeprowadź dekonwolucję za pomocą funkcji SPOTlight, podając referencję dla pojedynczych komórek, dane przestrzenne, listę markerów oraz HVG, a następnie zwizualizuj i wyeksportuj wyniki. Wynik dekonwolucji można uzyskać w następujący sposób, przedstawiając go jako ścieżkę rur przewodzących (scatter pipe route).Krok siódmy: nienadzorowana dekonwolucja z użyciem Stdeconvolve. Najpierw należy przygotować dane przestrzenne. Wyekstrahuj metryki liczby odczytów w wierszach z przestrzennego obiektu Seurat, korzystając z funkcji GetAssayData z gniazdem counts.Usuń plamki i geny o niskiej jakości, wykorzystując oczyszczone dane liczbowe z narzędzia STdeconvolve. Zidentyfikuj utajone typy komórek dla filtrów, w których korpus czterech genów wykazuje ekspresję w minimalnym ułamku plamków, stosując restrykcyjną analizę LDA poprzez zastosowanie modelu alokacji w zakresie potencjalnych liczb tematów za pomocą funkcji fitLDA. Wybierz optymalny model na podstawie minimalnej złożoności, korzystając z funkcji optimal model z parametrem opt min.Przeanalizuj i zwizualizuj wyniki. Wyodrębnij proporcje serotypów Theta oraz profile genów Beta dla optymalnego modelu za pomocą funkcji getBetaTheta. Aby dodać biologiczną interpretację zagadnień związanych z korozją, zaimportuj adnotacje obszarów zainteresowania wygenerowane przez narzędzie do wyboru plamek przestrzennych.Użyj tych adnotacji jako parametru grupy w funkcji z wszystkimi tematami. Nałóż na swój projekt odsplotowane proporcje typów komórek z powrotem na współrzędne przestrzenne i zakoduj kolorami plamki według ich ROI. Po uruchomieniu skryptu otrzymasz wynik taki jak ten, obciążenie rurociągu skali, podobny do tych generowanych przez SPOTlight.Krok ósmy, analiza przestrzennej komunikacji międzykomórkowej przy użyciu programu Giotto. Najpierw przekształć obiekt Seurat w obiekt Giotto. Użyj funkcji createGiottoObject, podając metryki o niskiej liczbie zliczeń oraz współrzędne przestrzenne.Przeprowadź wstępne przetwarzanie obiektu Giotto i dodaj wynik dekonwolucji. Znormalizuj dane za pomocą funkcji normalized Giotto, a następnie dodaj adnotacje serotypów. Wybierz metadane komórek przy użyciu funkcji addCellmetadata.Utwórz sieć przestrzenną za pomocą funkcji createSpatialNetwork. Wczytaj bazę danych ligandów i receptorów do środowiska. Uruchom funkcję exploreCellCellcom, aby zidentyfikować istotne interakcje ligand-receptor pomiędzy typami komórek znajdującymi się w bliskim sąsiedztwie przestrzennym.Wykres kropkowy komunikacji międzykomórkowej można uzyskać w następujący sposób. Krok dziewiąty jest opcjonalny. Interaktywny wybór punktów za pomocą SelectSpatialSpot.Przygotuj dane do interaktywnego narzędzia, korzystając ze skryptu six. Wyodrębnij współrzędne przestrzenne z obiektu Seurat za pomocą funkcji GetTissueCoordinates. Sformatuj i wyeksportuj dane.Wyeksportuj ramkę danych formacyjnych do pliku CSV. Następnie przeprowadź analizę obszaru zainteresowania (ROI). Uruchom niestandardowy program.Wybierz aplikację „spatial spots dash” i wczytaj plik CSV. Interaktywnie zaznacz punkty na podstawie ich lokalizacji przestrzennej. Następnie wyeksportuj listę wybranych punktów wraz z przypisanymi do nich grupami, zapisując je w nowym pliku CSV.Weryfikujemy teraz wyniki uzyskane po kolejnym uruchomieniu skryptów. Wszystkie dane zostały zapisane w folderze results five-fold. Jak widać, otrzymaliśmy metryki kontroli jakości (QC) oraz wartości dzielenia.Wykres cech przestrzennych można sprawdzić tutaj. Ponadto proces dekonwolucji został przeprowadzony zarówno w sposób nadzorowany, jak i nienadzorowany. Wyniki analizy SPOTlight znajdują się tutaj.Jak widać, wszystkie plamki zawierają informacje o proporcjach. Wygenerowano tutaj również wyniki dekonwolucji nienadzorowanej za pomocą STdeconvolve. a to są wyniki klastrowania Seurat dla plamek w danych przestrzennych.Można je również zwizualizować na wykresie zespołów przestrzennych, w ten sposób. Co więcej, za pomocą Giotto można uzyskać wyniki komunikacji między punktami. Cały ten proces jest w 100% open source.Analiza punktowa – od wskaźników ekspresji po zaawansowane modelowanie przestrzenne. Wszystkie kroki są wykonywane na maszynie z 16GB RAM. Baza kodu jest modułowa, z jednym skryptem dla każdego zadania.Należy zauważyć, że ten rurociąg nie obejmuje przetwarzania wstępnego z plików FASTQ. Koncentracja skupia się na dwuwymiarowych danych przestrzennych i obecnie obejmuje wyłącznie moduły pobierania danych Visium. To wszystko, dziękujemy za oglądanie.

a-practical-workflow-for-spatial-transcriptomics-data-analysis-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

W tym artykule przedstawiono protokół korzystania z DeepSpaceDB, dynamicznej, interaktywnej bazy danych do transkryptomiki przestrzennej, oferującej przepływy pracy analizy i przykłady do badania organizacji tkanek i ekspresji genów związanych z chorobą.

Eksploracja zbiorów danych transkryptomiki przestrzennej przy użyciu bazy danych DeepSpaceDB

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University.  This protocol presents a reproducible workflow for analyzing spatial transcriptomics data, guiding users from public data acquisition and Seurat-based quality control through integration, spatial feature detection, cell-type deconvolution, region-of-interest annotation, and cell–cell communication analysis, with practical checkpoints that support transparent execution.

Praktyczny schemat analizy danych z transkryptomiki przestrzennej: od pozyskiwania danych po analizy zaawansowane

Przeglądaj więcej filmów