Name: Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół izolacji komórek satelitarnych z mięśni szkieletowych myszy. Metoda łączy trawienie enzymatyczne, sortowanie magnetyczne MACS i selektywną hodowlę, zapewniając ponad 97% czystość myoblastów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrazowanie konfokalne wykonano w Laboratorium Struktury i Funkcji Tkanek Obrazowych, które pełni funkcję centralnego ośrodka obrazowania w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. Nenckiego i jest częścią infrastruktury polskiego węzła Euro-BioImaginging. Prace te były wspierane przez Narodowe Centrum Nauki w Polsce (grant Sonata 2022/47/D/NZ3/02737 dla Lilyi Lehki oraz grant Sonata bis 2020/38/E/NZ4/00314 dla Grzegorza Sumary) oraz fundusze ustawowe Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego dla Instytutu Nenckiego. Prace te były wspierane przez projekt finansowany przez Ministra Edukacji i Nauki na podstawie umowy nr 2022/WK/05 (polski węzeł Euro-BioImaging "Zaawansowany węzeł mikroskopii świetlnej Polska").

<ol><li>Yeh, C. -J., Sattler, K. M., Lepper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+satellite+cells+via+intercellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of satellite cells via intercellular signaling.</a> Gene. 858, 147172(2023).</li>
<li>Gonzalez, M. L., Busse, N. I., Waits, C. M., Johnson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+their+regulation+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and their regulation in livestock.</a> J Anim Sci. 98 (5), skaa081(2020).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and the muscle stem cell niche.</a> Physiol Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Kahn, R. E., Dayanidhi, S., Lacham-Kaplan, O., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+clocks%2C+satellite+cells%2C+and+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular clocks, satellite cells, and skeletal muscle regeneration.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 324 (1), C1332-C1340 (2023).</li>
<li>Abreu, P., Mendes, S. V. D., Ceccatto, V. M., Hirabara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+activation+induced+by+aerobic+muscle+adaptation+in+response+to+endurance+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Satellite cell activation induced by aerobic muscle adaptation in response to endurance exercise.</a> Life Sci. 170, 33-40 (2017).</li>
<li>Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+skeletal+muscle+after+eccentric+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sport+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Regeneration of skeletal muscle after eccentric injury.</a> J Sport Rehabil. 26 (2), 171-179 (2017).</li>
<li>Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+skeletal+muscle+repair+and+regeneration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of skeletal muscle repair and regeneration in health and disease.</a> FEBS J. 289 (21), 6460-6462 (2022).</li>
<li>Domingues-Faria, C., Vasson, M. -P., Goncalves-Mendes, N., Boirie, Y., Walrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+regeneration+and+impact+of+aging+and+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle regeneration and impact of aging and nutrition.</a> Ageing Res Rev. 26, 22-36 (2016).</li>
<li>Tierney, M. T., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+heterogeneity+in+skeletal+muscle+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell heterogeneity in skeletal muscle homeostasis.</a> Trends Cell Biol. 26 (6), 434-444 (2016).</li>
<li>Troy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+satellite+cell+activation+and+self-renewal+by+Par-complex-dependent+asymmetric+activation+of+p38%CE%B1%2F%CE%B2+MAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38α/β MAPK.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).</li>
<li>Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+mechanisms+regulating+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function.</a> Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).</li>
<li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+ME+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. 21-52 (2012).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li>
<li>Benedetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+the+isolation+and+long-term+expansion+of+pure+satellite+cells+based+on+ice-cold+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel approach for the isolation and long-term expansion of pure satellite cells based on ice-cold treatment.</a> Skelet Muscle. 11 (1), 7(2021).</li>
<li>Yoshioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+preplating+method+for+high-yield+and+high-purity+muscle+stem+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A modified preplating method for high-yield and high-purity muscle stem cell isolation.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 793(2020).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat formation.</a> Nat Cell Biol. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells%3A+close+neighbors+and+privileged+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Mol Biol Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li>
<li>Elizalde, G., Munoz, A. Z., Almada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+isolation+of+mouse+muscle+stem+cells+using+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the isolation of mouse muscle stem cells using fluorescence-activated cell sorting.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102656(2023).</li>
<li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPasut%2C+A+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, X. 798, Humana Press. 53-64 (2012).</li>
<li>Lee, J. D., Sinha, B. C., Larkin, L. M., Vandenburgh, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> J Regen Med. 3 (2), (2015).</li>
<li>Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+cells+alters+their+redox+state+and+cellular+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome.</a> Redox Biol. 16, 381-387 (2018).</li>
<li>Cusmano, A. A., et al. Efficient isolation and ex vivo differentiation of murine satellite cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCusmano%2C+AA+%22Stem+Cell%22">Stem Cell</a>. Turksen, K. 2939, Springer. 37-54 (2025).</li>
<li>Park, Y. G., Moon, J. H., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+magnetic-activated+cell+sorting+and+preplating+for+myoblast+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Comparative study of magnetic-activated cell sorting and preplating for myoblast purification.</a> Yonsei Med J. 47 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Park, Y. G., Baek, A., Kim, S. Myoblast purifying by magnetic-activated cell sorting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+YG+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 112, Elsevier. 439-447 (2012).</li>
<li>Lee, H., Han, N. R., Kim, S. J., Yun, J. I., Lee, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-yield+isolation+protocol+for+active+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Development of a high-yield isolation protocol for active muscle satellite cells.</a> Int J Stem Cells. 15 (3), 283-290 (2022).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+practical+method+for+isolation%2C+culture+and+identification+of+mouse+skeletal+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An easy and practical method for isolation, culture and identification of mouse skeletal muscle satellite cells.</a> Int J Clin Exp Med. 9, 19424-19431 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+isolation+of+highly+purified+porcine+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Characterization and isolation of highly purified porcine satellite cells.</a> Cell Death Discov. 3, 17003(2017).</li>
<li>Pawlikowski, B., Vogler, T. O., Gadek, K., Olwin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fibroblast+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of skeletal muscle stem cells by fibroblast growth factors.</a> Dev Dyn. 246 (5), 359-367 (2017).</li>
<li>Shahini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+high-yield+isolation+of+myoblasts+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient and high-yield isolation of myoblasts from skeletal muscle.</a> Stem Cell Res. 30, 122-129 (2018).</li>
<li>Lee, D. H., Kwak, K. B., Park, Y. C., Chung, C. H., Ha, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+myoblast+fusion+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of myoblast fusion inhibitor.</a> Mol Cells. 1, 177-182 (1991).</li>
<li>Moulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+and+adult+human+skin+fibroblasts+display+intrinsic+differences+in+contractile+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fetal and adult human skin fibroblasts display intrinsic differences in contractile capacity.</a> J Cell Physiol. 188 (2), 211-222 (2001).</li>
<li>Wilson, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+expression+of+collagen+receptors+in+rat+cardiac+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Age-dependent expression of collagen receptors in rat cardiac fibroblasts.</a> Microsc Microanal. 17 (4), 555-562 (2011).</li>
<li>Kohen, N. T., Little, L. E., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Matrigel+interfaces+during+defined+hESC+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Characterization of Matrigel interfaces during defined hESC culture.</a> Biointerphases. 4 (4), 69-79 (2009).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+system+supporting+robust+expansion+of+myogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22BioRes+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In vitro culture system supporting robust expansion of myogenic progenitors.</a> BioRes Open Access. 3 (3), 79-87 (2014).</li>
<li>Péault, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+in+skeletal+muscle+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells in skeletal muscle development and therapy.</a> Mol Ther. 15 (5), 867-877 (2007).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification and transplantation.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Hindi, L., McMillan, J., Afroze, D., Hindi, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culturing%2C+and+differentiation+of+primary+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culturing, and differentiation of primary myoblasts.</a> Bio Protoc. 7 (9), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Komórki satelitarne (SC) stanowią główną miogenną populację macierzystą i progenitorową odpowiedzialną za wzrost, naprawę i regenerację mięśni szkieletowych36,37. Ich zdolność do ponownego wejścia do cyklu komórkowego i różnicowania się w dojrzałe miofibry czyni je niezbędnymi do badania biologii mięśni szkieletowych. Po izolowaniu i hodowli w określonych warunkach in vitro, SC rozmnażają się jako mioblasty, które można indukować do różnicowania i łączenia się w wielojądrowe myorurki, co odtwarza kluczowe aspekty miogenezy obserwowane in vivo.
Nasza metoda umożliwia odzyskiwanie wysoko żywotnych, jednorodnych populacji komórek poprzez staranną korektę kluczowych parametrów, w tym stężenia enzymów, czasu trawienia oraz warunków hodowli, szczególnie dostosowanych do tkanek noworodkowych. Połączenie dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej, następnie filtracji wieloetapowej oraz opcjonalnego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) wraz z wstępnym nakładaniem gwarantuje wysoką wydajność i czystość komórek. Co ważne, protokół ten umożliwia generowanie hodowli zwykle obejmujących 97% miogenicznych progenitorów Pax7+ , co czyni je odpowiednimi do dalszych badań różnicowania i badań molekularnych.
Technika preplatingu opiera się na różnych właściwościach adhezji fibroblastów i SC 16,38,39. Ten etap jest szczególnie istotny przy określaniu czystości hodowli, a drobne odchylenia w czasie lub płukaniu mogą prowadzić do skażenia fibroblastów lub zmniejszenia regeneracji mioblastów. Szczególnie zaletą jest precyzyjnie zaplanowany etap wstępnego nakrycia, ponieważ efektywnie oddziela komórki miogenne od fibroblastów i innych populacji niemiogennych. Podejście to może być stosowane w przypadku braku sprzętu do separacji magnetycznej lub jako dodatkowy środek w celu dalszego zwiększenia czystości kultur mioblastów. W naszym protokole zoptymalizowaliśmy ten etap, stosując płytki pokryte kolagenem oraz precyzyjnie wyznaczony okres wstępnego nałożenia, który efektywnie oddziela komórki miogenne od fibroblastów i innych populacji niemiogennych.
Kolejnym metodologicznym postępem obecnego protokołu jest zastosowanie zdefiniowanego medium proliferacyjnego mioblastów (MPM), zoptymalizowanego zarówno pod kątem komórek dorosłych, jak i noworodkowych. Połączenie wysokiego stężenia surowicy ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE) oraz podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) wspiera trwałą proliferację i utrzymanie niezróżnicowanego fenotypu. CEE w szczególności wnosi czynniki wspierające wzrost, które zwiększają żywotność mioblastów i opóźniają spontaniczną fuzję, podczas gdy bFGF utrzymuje tożsamość SC poprzez aktywację kanonicznych szlaków sygnalizacyjnych29,31. Zastosowanie powierzchni pokrytych matrigelem dodatkowo poprawia przyczepność komórek i efektywność proliferacji, przyczyniając się do wysokiej żywotności i jednorodności morfologicznej obserwowanej w ciągu 72 godzin od izolacji.
Po przejściu do ośrodka różnicującego oczyszczone mioblasty łatwo łączą się w wielojądrowe, kurczliwe myorurki ekspresyjne miozynę ciężką (MHC), wykazując zachowany potencjał miogenny i dojrzewanie strukturalne. Powstałe hodowle są wysoce odpowiednie do badań regeneracji mięśni szkieletowych, sygnalizacji komórkowej, regulacji transkrypcji oraz modelowania chorób. Zbieg jest czynnikiem kluczowym, ponieważ posiewy o bardzo niskim zbiegu nie będą postępować, podczas gdy nadmiernie wysokie zbieganie wywoła fuzję i różnicowanie mioblastów. Mioblasty nie powinny być przechowywane w tej samej naczyniu hodowlanym dłużej niż 5 dni, niezależnie od zbiegu się, ponieważ przedłużona inkubacja również może sprzyjać różnicowaniu się.
Pomimo tych zalet, niektóre kroki pozostają wrażliwe na awarie. Trawienie enzymatyczne musi być starannie skalibrowane, aby zrównoważyć dysocjację tkanek z żywotnością komórek. Czas wstępnego nałożenia, gęstość komórek przed różnicowaniem oraz delikatne traktowanie podczas dysocjacji mają silny wpływ na wydajność, czystość i potencjał fuzji. Typowe problemy, takie jak utrzymujące się zanieczyszczenie fibroblastów, niska wydajność, przedwczesne zróżnicowanie, słabe przyczepienie czy słabe tworzenie myorurów, można często rozwiązać poprzez drobne korekty w preplatingu, suplementacji medium lub technice powlekania.
Rozwiązywanie problemów i praktyczne kwestie:
Czystość izolacji i trawienie enzymatyczne wymagają szczególnej uwagi, ponieważ różnice w rodzaju enzymu, stężeniu, czasie inkubacji czy mieleniu tkanek mogą znacząco wpływać zarówno na wydajność komórek, jak i czystość hodowli. Niedoskonałe trawienie może pozostawić tkankę częściowo nienaruszoną, zmniejszając uwalnianie SC i zatykając sitko w kolejnym etapie, podczas gdy nadmierne trawienie może wyglądać wizualnie podobnie do biofilmu i może ograniczyć żywotność komórek. Dlatego dla powtarzalnych wyników jest niezbędna staranna optymalizacja.
Filtracja i stosowanie sitek są również kluczowe, ponieważ niepełna lub nieefektywna filtracja może pozostawić w zawiesinie komórkowej resztki lub agregaty tkankowe, co może zakłócać przyczepność komórek i obniżać czystość hodowli. Stosowanie odpowiednio dopasowanych sit, delikatne przepuszczanie przez nie zawiesiny oraz wstępne zwilżanie filtrów może poprawić usuwanie zanieczyszczeń, minimalizując jednocześnie mechaniczne obciążenia komórek. Jeśli większe fragmenty tkanek zatkają filtr, należy go zastąpić nowym filtrem, zamiast przepychać zawiesinę, ponieważ komórki mogą się zatrzymywać na powierzchni filtra, co prowadzi do zmniejszenia wydajności. Powtarzanie filtracji z nowym filtrem, gdy jest to konieczne, może dodatkowo przyspieszyć regenerację żywotnych mioblastów.
Przedwczesna lub nieudana różnicowanie może wystąpić, gdy hodowle stają się zbyt gęste, co może wywołać spontaniczne różnicowanie lub przedwczesną fuzję, co może obniżyć czas eksperymentów. Dlatego monitorowanie gęstości komórek oraz dostosowywanie gęstości siewów lub średniej objętości przed różnicowaniem jest kluczowe. W przypadku nadmiernego zbiegu par, częściowe rozszczepienie lub delikatne ponowne siewnictwo może pomóc utrzymać proliferację bez niezamierzonego powstawania myotub. Natomiast jeśli pożądana konfluencja nie zostanie osiągnięta przed rozpoczęciem różnicowania, inkubacja powinna być kontynuowana do osiągnięcia optymalnej gęstości, aby zapewnić skuteczną różnicowanie. Utrzymanie mioblastów powyżej zalecanego okresu (>5 dni) zwiększa ryzyko spontanicznej różnicowania i zmniejsza zdolność proliferacji, niezależnie od początkowego zbiórka. Regularna ocena morfologii komórek, przestrzeganie terminów hodowli oraz terminowe zmiany podłoża są niezbędne do zachowania zarówno żywotności, jak i potencjału różnicowania.
Utrzymujące się zanieczyszczenie fibroblastami można zminimalizować poprzez staranne przetwarzanie tkanek, w tym staranne usuwanie tkanki łącznej i tłuszczowej podczas sekcji mięśni. Optymalizacja etapu wstępnego nakładania jest szczególnie ważna, ponieważ szybko przylegające fibroblasty przyczepiają się do powierzchni niepowlekanych, podczas gdy włókna powłokowe pozostają w zawieszeniu. Stosowanie płytek hodowlanych pokrytych kolagenem w połączeniu z określonym, podłożem proliferacyjnym mioblastów, uzupełnionym bFGF, sprzyja selektywnej ekspansji mioblastów, jednocześnie ograniczając wzrost fibroblastów. Dodatkowe oczyszczanie można osiągnąć poprzez negatywne strategie selekcji, takie jak MACS, które zmniejszają populacje fibroblastów. Regularne monitorowanie mikroskopowe jest niezbędne do wykrycia wczesnego przerostu fibroblastów i umożliwienia terminowej interwencji.
Podsumowując, protokół ten zwiększa powtarzalność i efektywność izolacji pierwotnych mioblastów poprzez integrację sekwencyjnego oczyszczania, zoptymalizowanych warunków hodowli oraz elastycznych opcji oczyszczania. Co ważne, niezawodnie daje wysoko wzbogacone komórki Pax7+ , które mogą być dalej wykorzystywane do kontrolowanych badań biologii SC, zaangażowania miogenicznego oraz dynamiki różnicowania.
W przeciwieństwie do protokołów zoptymalizowanych pod kątem długotrwałej rozbudowy szeregowej, które mogą zmieniać zachowanie komórek oraz zmniejszać potencjał miogenny i zdolność fuzji, nasza metoda została celowo zaprojektowana tak, aby zachować komórki o solidnej tożsamości miogenicznej i wysokiej kompetencji fuzyjnej. To skupienie jest korzystne dla zastosowań wymagających istotności fizjologicznej, efektywnej różnicowania miogenicznej oraz zachowania definiujących cech SC, szczególnie w eksperymentach skupionych na badaniu różnicowania i regeneracji miogenicznej.

Zdolność mięśni szkieletowych do regeneracji po każdym naruszeniu ich integralności zależy zasadniczo od wyspecjalizowanej populacji komórek prekursorowych miogennych, zwanych komórkami satelitarnymi (SC), nazwanych od ich pozycji satelitarnej wzdłuż miofibry. Lokalizują się pod błoną włókna mięśniowego, przyczepione do wielojądrowych włókienmięśniowych 1,2,3. SC charakteryzują się ekspresją sparowanego białka pudełkowego Pax7, które jest zachowane u wielu gatunków, w tym człowieka, myszy, małpy i świnie. Pax7, który został zidentyfikowany jako pierwszy wykrywalny marker SC zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji, jest niezbędny dla rozwoju i przeżycia SC4. W normalnych warunkach SC pozostają w stanie spoczynku (faza G0 cyklu komórkowego), charakteryzującym się niską aktywnością metaboliczną i transkrypcyjną nieaktywnością 5,6. Po uszkodzeniu mięśni lub obciążeniu mechanicznym zostają one aktywowane, wznawiają cykl komórkowy, powiększają się liczebnie i różnicują się, tworząc nowe miowłókny lub naprawiając uszkodzone 7,8,9. W trakcie tego procesu podgrupa SC musi przejść samoodnowę, wracając do stanu spoczynku (Pax7⁺), aby utrzymać długoterminową integralność puli komórek macierzystych. Samoodnowa zachodzi albo poprzez podział asymetryczny, gdzie jedna komórka potomna zachowuje cechy przypominające pnią, a druga staje się zaangażowanym miogennym przodkiem, lub podział symetryczny, gdzie obie komórki potomne zachowują tożsamość macierzystą lub różnicują się, w zależności od kontekstu fizjologicznego i niszowego 10,11,12.
SC odgrywają kluczową rolę w regeneracji mięśni, czyniąc je kluczowym obszarem w biologii mięśni szkieletowych, medycynie regeneracyjnej oraz badaniach nad dystrofią mięśniową. Zrozumienie zachowania i funkcjonowania tych komórek nie tylko rzuca światło na podstawowe procesy naprawy mięśni, ale także toruje drogę do opracowania terapii mających na celu leczenie schorzeń związanych z utratą mięśni i wspieranie regeneracji. Izolacja SC od tkanki mięśniowej jest kluczowym etapem badań in vitro , umożliwiającym badanie ich cech molekularnych, potencjału proliferacji, szlaków różnicowania oraz reakcji na różne bodźce. Jednak proces ten wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi ze względu na złożoną strukturę mięśnia, stosunkowo niską liczbę komórek satelitarnych w porównaniu z innymi typami komórek oraz konieczność zachowania ich żywotności i wytrzymałości podczas izolacji.
Obecnie do izolacji SC stosuje się trzy główne techniki: metodę preplatingu, sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) oraz sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Każda z tych metod oferuje unikalne zalety i ograniczenia pod względem czystości, wydajności, żywotności komórek oraz zachowania SC.
Metoda preplatingu wykorzystuje różnicową adhezję komórek pochodzących z mięśni, przy czym SC należą do najmniej przylegających. Po enzymatycznym trawieniu mięśni szkieletowych, powstała niejednorodna zawiesina komórek jest nakładana na płytki hodowlane, zwykle pokryte kolagenem typu I. Po inkubacji 1-24 godzin (w zależności od protokołu) w temperaturze 37°C, komórki nieprzylegające są pobierane i przenoszone na płytkę pokrytą Matrigelem do dalszej hodowli 13,14,15,16. Powstała populacja zwykle obejmuje zarówno SC, jak i fibroblasty, a także niewielką liczbę adipocytów i komórek śródbłonka17,18. Powtarzanie procesu wstępnego nakładania co 24-48 godzin przez maksymalnie tydzień dla SC izolowanych od dorosłych myszy oraz do 2 tygodni dla noworodków może poprawić czystość populacji komórek. Choć metoda ta jest opłacalna i technicznie prosta, jest pracochłonna i często prowadzi do powstawania kultur o zmiennym składzie. Metoda preplatingu jest odpowiednia dla laboratoriów bez FACS lub MACS, oferując prosty sposób wzbogacenia komórek satelitarnych przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i właściwości przypominających łodygę. Dlatego zaleca się łączenie tego podejścia z dodatkowymi metodami oczyszczania, aby zwiększyć ogólną czystość populacji komórek. W obecnym protokole zoptymalizowaliśmy etap wstępnego nakładania, używając płyt pokrytych kolagenem i dostosowując czas w zależności od modelu. Ta różnica adhezji przyspiesza usuwanie fibroblastów, skraca okres wstępnego nakładania, wykorzystuje czynniki wzrostu oraz skraca zarówno czas manipulacji, jak i stres komórkowy podczas izolacji.
FACS to szeroko stosowana metoda izolowania komórek satelitarnych oparta na ekspresji określonych markerów powierzchniowych (α7-integrina, CD34, CD29, β1-integrina, CXCR4), umożliwiająca wysoką czystość i swoistość19,20. Jednak często jest to trudne ze względu na złożoność techniczną, wysokie koszty przeciwciał oraz potrzebę specjalistycznego sprzętu. Ponadto stres mechaniczny i biochemiczny podczas sortowania może zaburzać żywotność komórek. Wymóg wygenerowania zawiesiny pojedynczej komórki może prowadzić do znacznej utraty komórek, podczas gdy poleganie na specyficznych markerach fluorescencyjnym może prowadzić do niepełnej reprezentacji heterogeniczności komórek satelitarnych. Dodatkowo trawienie enzymatyczne, stosowane do dysocjacji komórek, może rozkładać krytyczne antygeny powierzchniowe, co wpływa na dokładną identyfikację i izolację, a także może upośledzić funkcjonowanie mioblastów21,22. FACS nadaje się do izolacji populacji wysoce czystych w krótkim czasie, szczególnie gdy wymagana jest precyzyjna rozdzielczość fenotypowa. Jednak ta metoda jest mniej odpowiednia przy utrzymaniu nienaruszonych, żywotnych komórek, co jest kluczowe, ze względu na mechaniczne i biochemiczne obciążenia podczas sortowania lub w laboratoriach pozbawionych specjalistycznego sprzętu.
MACS natomiast to technika stosowana do izolowania komórek satelitarnych poprzez wiązanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami przeciwko specyficznym powierzchniowym markerom fibroblastów i komórek odpornościowych ogólnego na ich powierzchni, a następnie oddzielanie ich od niepożądanych populacji komórek za pomocą pola magnetycznego. Elucią negatywnego wyboru z fazy stacjonarnej jest populacja komórek satelitarnych interesującą. MACS umożliwia efektywne wzbogacanie komórek satelitarnych o stosunkowo wysokiej czystości i skalowalności, jednocześnie wymagając mniej specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej w porównaniu do FACS. Ponadto łagodny proces magnetycznej separacji zachowuje integralność komórek, co czyni go odpowiednim do zastosowań w dalszych fazach takich jak hodowla komórek, analiza ekspresji genów oraz badania transplantacyjne. Jednak MACS jest ograniczony przez niższą czystość, gdy potrzebne jest wiele markerów, możliwe niespecyficzne wiązanie lub przeniesienie kulek oraz brak ilościowych danych dotyczących ekspresji markerów 23,24,25.
Pomimo dostępności protokołów izolacji komórek mięśni szkieletowych, uzyskanie powtarzalnych i jednolitych pierwotnych hodowli pozostaje wyzwaniem, szczególnie ze względu na zmienność rozwojową i specyficzną dla tkanek. Izolacja SC od mięśni noworodkowych była mniej szczegółowo scharakteryzowana niż od mięśni dorosłych, z relatywnie mniejszą liczbą opublikowanych protokołów, z których wiele wymaga dalszej optymalizacji w zależności od warunków technicznych i celów eksperymentalnych 26,27,28. Często konieczne jest dostosowanie parametrów, w tym stężenia enzymów, czasu trawienia i warunków hodowli, dla różnych etapów rozwoju – zwłaszcza u noworodków – aby osiągnąć maksymalną wydajność, żywotność i czystość izolowanych komórek satelitarnych. W tym artykule demonstrujemy zoptymalizowany protokół izolacji komórek satelitarnych od mięśni szkieletowych dorosłych i noworodkowych myszy (dni poporodowe 6-14, P6-P14), łączący preplating i sortowanie MACS z korektami w czasie preplatingu i składzie medium. Protokół ten zapewnia powtarzalną populację komórek na różnych etapach rozwoju, z izolowanymi komórkami wykazującymi wysoką czystość i żywotność. Immunobarwienie wskazuje, że odsetek komórek Pax7+ zazwyczaj przekracza 97%. Ponadto te mioblasty wykazują silny potencjał różnicowania, efektywnie tworząc wielojądrowe myorurki po zastąpieniu ośrodka wzrostu ośrodkiem różnicującym. Zróżnicowane myorurki można obserwować za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej lub weryfikować za pomocą immunobarwienia na łańcuch ciężki miozyny (MHC), marker wskazujący na dojrzałe włókna mięśniowe.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; Sit komórek M&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2759</td><td></td></tr><tr><td>30 & mikro; m Sit & nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>40 & mikro; Sit komórek M&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; Sit komórek M&nbsp;</td><td>VWR</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>POCH</td><td>568760114</td><td>Rozpuszczony w dH2O do końcowego stężenia 20 mM i sterylizowany przez 0,2 & mikro; Filtr m</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, osiołka antykróliczka</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A21206</td><td>Rozpuszczony w roztworze blokującym (patrz sekcja 8.7) z rozcieńczeniem 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, antymyszy dla kóz,</td><td>Abcam</td><td>ab150113</td><td>Rozpuszczony w roztworze blokującym (patrz sekcja 8.7) z rozcieńczeniem 1:250</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AMC303.500</td><td>Rozpuszczać w wodzie do końcowego stężenia 50 mM</td></tr><tr><td>Nośniki montażowe antyfade</td><td>Vectashield</td><td>H-2000-10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw PAX7</td><td>Abcam</td><td>ab187339</td><td>Rozpuszczony w roztworze blokującym (patrz sekcja 8.7) z rozcieńczeniem 1:100</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów &nbsp;</td><td>Corning</td><td>354060</td><td>Rozpuszczony w sterylnym dH2O do stężenia stockowego 10 & mikro; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Betadyna, 100 mg/mL</td><td>EGIS Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowla komórkowa, 6 dołków, Cell+</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3902.300</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodka kurczaka&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>2850145</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, szczurzy ogon</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Rozpuszczone w 20 mM kwasu octowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ I</td><td>Sigma</td><td>C0130-500MG</td><td>Rozpuszczony w DMEM i sterylizowany za pomocą 0,2 i mikro; Filtr m</td></tr><tr><td>Rurka dysocjacyjna (rurki gentleMACS C)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysokoglukozowy</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe rury wirówkowe Falcon, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe rurki wirówkowe Falcon, 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Serum konne&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do znakowania magnetycznego (Zestaw do izolacji komórek satelitarnych)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-268</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny (separator MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel &nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS356234</td><td>Rozpuszczony w DMEM do stężenia 10% & nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4% w PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899. AK</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>VWR</td><td>392-0334</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne (kolumny LS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mięśniowe na miozynę w mięśniach szkieletowych, MHC</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32732</td><td>Rozpuszczony w roztworze blokującym (patrz sekcja 8.7) z rozcieńczeniem 1:50</td></tr><tr><td>Antena TC, 100 x 20 mm</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjator tkankowy (GentleMACS Dissociator)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Isolation of Skeletal Muscle Satellite Cells for In Vitro Myogenesis Studies

Regeneracja i wzrost mięśni szkieletowych zależą od komórek satelitarnych, czyli komórek macierzystych tkanki mięśniowej. Obecnie te komórki służą jako model in vitro , który najdokładniej oddaje naturalne procesy miogenne. Niemniej jednak izolacja komórek satelitarnych jest technicznie trudna, ponieważ występują one w niewielkich liczbach w mięśniach szkieletowych, a populacje izolowanych komórek są zazwyczaj heterogeniczne. W niniejszym badaniu opisujemy standaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania mioblastów pierwotnych z mięśni szkieletowych zarówno dorosłych, jak i noworodkowych. Procedura obejmuje sekcję mięśniową, dysocjację enzymatyczną, filtrację sekwencyjną, wstępne etapy pokrycia komórek ograniczających komórki niemiogenne oraz określone warunki hodowli do ustanowienia mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych. Protokół zawiera praktyczne wskazówki dotyczące czasu, postępowania oraz kluczowych kroków w celu zbudowania skutecznej kultury. Pierwotne mioblasty generowane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań w dalszej fazie, w tym badań nad miogenezą, analizą funkcjonalną, manipulacją genetyczną, obrazowaniem żywych komórek lub testami na narkotyki. Komórki te niezawodnie się zlewają i dojrzewają, co czyni je doskonale przystosowanymi do badania fuzji mioblastów, rozwoju mięśni, mechanizmów regeneracyjnych przywracających funkcje mięśni szkieletowych oraz ich metabolizmu.

Pomyślne wdrożenie tego protokołu daje wysoce żywotne, morfologicznie odrębne pierwotne kultury mioblastów pochodzące z mięśni kończyn tylnych zarówno dorosłych, jak i noworodkowych. Łącząc sekwencyjną filtrację przez filtry komórkowe o malejących porach z opcjonalnym sortowaniem komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), protokół ten umożliwia izolację silnie oczyszczonej populacji mioblastów. Aby jeszcze bardziej poprawić czystość izolowanych komórek Pax7+, zastosowano zoptymalizowany etap wstępnego nakładania. Po tym etapie (sekcja protokołu 5) większość fibroblastów i innych komórek niemiogennych pozostaje przylegająca (Rysunek 3) do początkowej powierzchni pokrytej kolagenem, podczas gdy mioblasty pozostają w zawiesie i następnie przyczepiają się do płytek pokrytych Matrigelem (Rysunek 2B). Opierając się na wcześniej wykazanej skuteczności konkretnych składników medium proliferacyjnego mioblastów (MPM), w tym wysokiego stężenia surowicy, suplementacji bFGF i ekstraktem z zarodka kurczaka (CEE) oraz zastosowania powłoki Matrigel – ta formuła, zoptymalizowana przez nas, zapewnia wyraźną przewagę proliferacyjną dla mioblastów nad komórkami niemiogennymi 14,30,31,35 . W związku z tym, w ciągu 72 godzin hodowli w MPM, powinny dominować małe, okrągłe lub wrzecionowate mioblasty o wysokim stosunku jądrowym do cytoplazmatycznego (Rysunek 2C). Może pozostać mniejsza populacja dużych, spłaszczonych komórek fibroblastopodobnych, zazwyczaj stanowiących mniej niż 3% hodowli.
Wydajność komórek po 72 godzinach po izolacji przy użyciu tego protokołu zależy od wieku zwierząt dawcy. Dla mioblastów wyizolowanych od jednej dorosłej myszy przy użyciu czterech mięśni kończyn tylnych (gastrocnemius, soleus, tibialis anterior i extensor digitorum longus) z obu nóg, typowy plon wynosi około 2-4 × 10⁶ komórek na zwierzę. Ponad 97% komórek wyizolowanych od dorosłych (**p < 0,01) i noworodków (***p < 0,0001) stanowiły progenitory miogenne, co potwierdza ekspresja Pax7+ (rysunek 4A,B), potwierdzając wysokie wzbogacenie progenitorów miogennych. Ta ocena czystości oparta na Pax7 została przeprowadzona po zakończeniu pełnego procesu wzbogacenia, w tym wstępnego pokładania, a następnie MACS i/lub rozszerzenia, a nie na wczesnych przylegających frakcjach prepłytowych.
Mioblasty noworodków osiągały wysoką czystość z MACS lub bez niego (rysunek 4A,B), co czyni ten protokół odpowiednim dla laboratoriów o różnym poziomie wsparcia technicznego. Jednak gdy pomija się MACS, konieczne są dodatkowe kroki wstępnego nakładania, aby osiągnąć porównywalną czystość.
Dla dorosłych mioblastów nie przeprowadzono bezpośredniego porównania statystycznego populacji sortowanych według MACS i niesortowanych. Jednak ze względu na niższą zdolność proliferacji i większe zaangażowanie w różnicowanie, oczekuje się, że MACS zwiększy wzbogacenie w porównaniu do samego preplatingu.
Po przejściu na ośrodek różnicujący (MDM) po osiągnięciu 80-90% konfluencji mioblasty efektywnie łączą się, tworząc wydłużone, wielojądrzowe myorurki w ciągu 48-72 godzin. Te myorurki są łatwo widoczne za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej (rysunek 2D) i można je dodatkowo potwierdzić immunobarwieniem na łańcuch ciężki miozyny (MHC) (rysunek 5A,B). Obecność zorganizowanych struktur sarkomerycznych w zróżnicowanych myotubach (rysunek 5B) wskazuje na dojrzewanie strukturalne zgodne z różnicowaniem miogenicznym w tych warunkach hodowlanych.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70277/70277fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Protokół krok po kroku dla efektywnej izolacji komórek satelitarnych mięśni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70277/70277fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70277/70277fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy z mikroskopii fazowej różnych metodologii omawianych w tekście. (A) Obrazy z kontrastem fazowym (20x) izolacji komórek po trawieniu. (B) Kontrast fazowy (20x) preplatingu hodowli z przyczepionymi fibroblastami, wraz z nieprzyczepionymi mioblastami. (C) Kontrast fazowy (20x) proliferujących mioblastów po przyłączeniu. (D) Kontrast fazowy (20x) zróżnicowanych myorurek. Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70277/70277fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70277/70277fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy mikroskopii fazowo-kontrastowej (20×) komórek pozostających przyczepionych po pierwszym etapie preplatingu. Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70277/70277fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70277/70277fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy wykonane pod mikroskopem kontrastowym fazowym (20x) i immunocytochemii (40x). (A) Pax7+ (zielony) i jądra barwione DAPI (jasnoniebieskim) oraz ich kolokalizacja w połączonych kanałach. (B) Analiza czystości hodowli mioblastów, ilościowa ocena procentu komórek Pax7+ znormalizowanych do jąder na pole pozyskane (jedno pole na dołek, w co najmniej sześciu dołkach). Immunobarwienie powtarzano co najmniej trzy razy, z dwoma do trzema technicznymi replikami na eksperyment. **p < 0,01, ***p < 0,0001 (Istotność statystyczna została przeanalizowana za pomocą testu U Manna Whitneya). Pasek skali = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70277/70277fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70277/70277fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji pokazujące myorurki różniące się od dorosłych myooblastów. (A) Początkujące myorurki (3 dni w hodowli) obrazowane z 20x MHC (zielone) oraz jądra barwione DAPI (jasnoniebieskim). (B) Dojrzałe myorurki (6 dni w hodowli) obrazowane w wysokości 20x oraz szczegóły struktury wzoru sarkomerycznego określone przez barwienie miozynowe. Immunobarwienie powtarzano co najmniej trzy razy, z dwoma do trzema technicznymi replikami na eksperyment. Skala = 50 μm; Powiększona skala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70277/70277fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Skeletal muscle regeneration and growth depend on satellite cells, the muscle tissue&#39;s resident stem cells. Currently, these cells serve as ...

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do izolacji żywotnych komórek satelitarnych z noworodkowych i dorosłych mięśni szkieletowych myszy. Istniejące metody zapewniają zmienną czystość, niską efektywność noworodków oraz utratę komórek wywołaną stresem. Nasza metoda zachowuje żywotność, wysoką czystość oraz powtarzalność.Na początek pobierz tkankę mięśniową szkieletu myszy i najpierw umyj ją PBS zawierającym 1% penicyliny i streptomycyny oraz kilka kropli Betadiny. Następnie szybko myj mięśnie dwa razy świeżym PBS zawierającym penicylinę i streptomycynę, aby dokładnie spłukać betadinę. Następnie, używając nożyczek do autoklawu, drobno pokrój umyte tkanki na fragmenty o długości około jednego do dwóch milimetrów.Przenieś zmielone mięśnie do rurek dysocjacyjnych tkanek zawierających 0,2% kolagenazy w DMEM. Inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby rozpocząć trawienie enzymatyczne. Za pomocą mechanicznego dysocjatora tkankowego uruchom zdefiniowany program, aby ułatwić trawienie enzymatyczne, jednocześnie zachowując żywotność komórek.Stosuj program dwukrotnie, aby zwiększyć mechaniczne zakłócenia tkanki. Następnie włóż próbki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 30 minut, aby zakończyć proces trawienia. Powtórz mechaniczną dysocjację jeszcze raz, aby zapewnić dokładną dysocjację.Potwierdź, że ośrodek trawienny staje się mętny, a fragmenty tkanek pozostają niewiele lub wcale. Następnie umieść sitko do ogniw o średnicy 100 mikrometrów na stożkowej rurce o pojemności 50 milimetrów. Za pomocą pipety zwilż sitko jednym mililitrem podgrzanego medium neutralizującego.Przelej strawioną zawiesinę mięśniową na wstępnie zwilżone sitko o średnicy 100 mikrometrów. Następnie przepłucz sitko dodatkowym jednym mililitrem medium neutralizującego, aby usunąć resztki zanieczyszczenia. Po przecieczeniu zawiesiny nad sitnikami ogniw 70- i 40-mikrometrowych, wstępnie zwilż sitko o średnicy 30 mikrometrów umieszczone na stożkowej rurce o mocy 15 milimetrów z jednym mililitrem medium neutralizującego.Następnie przepuszczamy filtrat przez sitko i ponownie myj jednym mililitrem medium neutralizującego, aby zmaksymalizować odzysk komórek. Wiruj zebraną zawiesinę komórkową w dawce 300 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod sterylną szafką biosafety ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.Potwierdź obecność białych krwinek na dnie rurki. Aby przeprowadzić sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie, najpierw zawiesi granulkę komórkową w świeżo przygotowanym buforze MACS, używając 80 mikrolitrów buforu na gram oryginalnej tkanki. Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika znakującego magnetycznie.Następnie delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza na lodzie. Dostosuj całkowitą objętość do 500 mikrolitrów z buforem sortującym dla próbek do pięciu gramów tkanki. Dla większych ilości tkanek podziel zawiesinę równomiernie na kilka rurek.Umieść kolumnę separacyjną w polu magnetycznym separatora magnetycznego. Przemyj kolumnę trzema mililitrami buforu sortującego, aby ją wyrównać. Nałóż oznaczoną zawiesinę komórkową na kolumnę.Zbierz eluant zawierający populację wzbogaconą komórkami satelitarnymi. Następnie przemyj kolumnę dwukrotnie za pomocą porcji bufora sortującego o jednym mililitrze i połącz zebrane frakcje. Wiruj łączoną zawiesinę w temperaturze 300 przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić izolowane komórki satelitarne.Rozcieńcz kolagen szczura typu I w stężeniu 20 milimolowych kwasu octowego do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Dodaj roztwór do płytek hodowlanych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Ostrożnie zasysaj roztwór kolagenu z płytek.Następnie opłucz płytki trzy razy sterylnym PBS, używając równych objętości, aby usunąć resztki kwasu. Następnie przygotuj medium proliferujące mioblasty dla dorosłych mysich lub noworodkowych mysich mioblastów. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 10 mililitrach medium proliferającego mioblast, podgrzanego do 37 stopni Celsjusza.Siej dorosłe mioblasty na płytkach pokrytych kolagenem. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po zoptymalizowanym etapie pre-powlekania większość fibroblastów i innych komórek niemiogennych pozostawała przyczepiona do początkowej powierzchni pokrytej kolagenem, podczas gdy mioblasty pozostawały w zawiesie i następnie przyczepiały się do płytek pokrytych Matrigelem.W ciągu 72 godzin hodowli w medium proliferacyjnym mioblastów dominowały małe, okrągłe, wrzecionowate mioblasty o wysokim stosunku cytoplazmatycznym jądrowym. W hodowli pozostała niewielka populacja dużych, spłaszczonych komórek fibroblastopodobnych, zazwyczaj stanowiących mniej niż 3% wszystkich komórek. Ponad 97% komórek wyizolowanych od dorosłych i noworodkowych myszy stanowiły progenitory miogenne, co potwierdza dodatnia ekspresja PAX7.Mioblasty noworodkowe osiągały wysoką czystość, niezależnie od tego, czy sortowały komórki aktywowane magnetycznie. Po przejściu na ośrodek różnicujący przy łączności 80 do 90%, mioblasty zrosły się, tworząc wydłużone wielojądrowe miorury w ciągu 48 do 72 godzin. Różnicowanie miotub zostało potwierdzone immunobarwieniem dla łańcucha ciężkiego miozyny.Obecność zorganizowanych struktur sarkomerycznych w zróżnicowanych myotubach wskazywała na dojrzewanie strukturalne w tych warunkach hodowlanych. Metoda ta umożliwia bezpośrednią obserwację zachowania komórek satelitarnych, parametrów fuzji, ekspresji markerów oraz reakcji na bodźce środowiskowe lub chemiczne. Głównym wyzwaniem jest kontrola trawienia, gęstości płyt oraz usuwania błonniku, aby zapewnić zdrowe, wysokoczyste komórki miogenne.Izolowane komórki mogą wspierać badania nad regeneracją mięśni, modelowaniem chorób, testowaniem leków oraz mechanizmami kontrolującymi różnicowanie i samoodnawianie komórek satelitarnych.

isolation-skeletal-muscle-satellite-cells-for-vitro-myogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Ten film demonstruje izolację komórek satelitarnych z tkanek mięśni rozgałęzionych głowy szczura poprzez rozwarstwienie tkanek, trawienie enzymatyczne, a następnie mechaniczne i odśrodkowe oczyszczanie. Komórki są następnie wysiewane w studzienkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową w celu różnicowania w mioblasty, a ostatecznie w miotubki i dojrzałe włókna mięśniowe.

Technika izolowania komórek satelitarnych z tkanki mięśniowej głowy szczura

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i...

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Precyzyjna identyfikacja komórek satelitarnych jest niezbędna do badania ich funkcji w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W artykule przedstawiono protokół identyfikacji komórek satelitarnych na wycinkach dorosłych mięśni szkieletowych za pomocą barwienia opartego na immunofluorescencji.

Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Poznaj zoptymalizowany protokół izolacji komórek satelitarnych z mięśni szkieletowych myszy. Metoda łączy trawienie enzymatyczne, sortowanie magnetyczne MACS i selektywną hodowlę, zapewniając ponad 97% czystość myoblastów.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Przeglądaj więcej filmów