Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów
17 lutego 2026
Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.
W tym protokole wprowadzamy metodę przygotowania nanowesykułów pochodzących od komórek macierzystych mezenchymalnych, które przypominają wesykule pozakomórkowe i zawierają wirusy AAV w celu poprawy dostarczania genów. Nazywamy je CME-AAV. W porównaniu z nowym wektorem dostarczania genów EV-AAV, CME-AAV oferują większą elastyczność w źródłach komórek i wyższy wydajność.
Aby rozpocząć, usuń podłoże hodowlane z naczynia hodowlowego zawierającego ludzkie komórki macierzyste mezenchymalne w 70 do 90% konfluencji. Za pomocą zdejmującego do komórek, oddziel komórki z naczynia hodowlowego i przenieś je do stożkowego pojemnika zawierającego PBS. Wyśrodkuj zebrane komórki z prędkością 300g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby utworzyć pellet.
Następnie wypłucz pellet komórek dwukrotnie z PBS i ponownie wyśrodkuj. Resuspenduj końcowy pellet komórek w PBS uzupełnionym o koktajl inhibitorów proteaz. Następnie poddaj zawiesinę komórek trzem cyklom mrożenia i rozmrażania, aby zniszczyć błonę komórkową i uzyskać surowy lizat.
Za pomocą pipety dokładnie zhomogenicuj lizat. Następnie wyśrodkuj z prędkością 1 000g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe. Przenieś surnatę do nowego pojemnika.
Wyśrodkuj z prędkością 18 000g przez jedną godzinę w czterech stopniach Celsjusza, aby utworzyć pellet frakcji błonowej. Odsuń surnatę i resuspenduj pellet błony w PBS, aby uzyskać surowy frakcji błony komórek macierzystych mezenchymalnych. Teraz zhomogenicuj zawiesinę błony poprzez kolejne przepuszczenie jej przez strzykawki wyposażone w igły 20 do 27 kalibru.
Wyznacz koncentrację białka w zhomogenizowanej zawiesinie błony za pomocą testu kwasu bicinchoninicowego. Przedłuż zawiesinę i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu potrzeby. Ponownie zhomogenicuj zawiesinę za pomocą strzykawki 27 kalibru po każdym cyklu rozmrażania.
Wymieszaj przygotowaną zawiesinę błony z adeno-powiązanym wirusem lub AAV w proporcji 150 mikrogramów białka na jedno razy 10 do potęgi 10 kopii genomu. Inkubując mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z delikatnym wstrząsaniem. Wprowadź mieszaninę błony i wirusa do mini ekstrudera wyposażonego w 400 nanometrową membranę poliwęglanową.
Przepuść mieszaninę przez ekstruder 20 razy, aby promować enkapsulację. Zamień 400 nanometrową membranę na 200 nanometrową membranę i powtórz ekstruzję. Zbierz zawiesinę procesu zawierającą enkapsulowany wirus, wraz z nieenkapsulowanym wirusem i pustymi wesykułami.
Scal wiele partii, jeśli to konieczne, i natychmiast przystąp do oczyszczania. Rozcieńcz roztwór jodiksanolowy 10x PBS i sterylną zdejonizowaną wodą, aby przygotować roztwory 40 i 25%. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr 40% jodiksanolu na dno 13,2 mililitrowego otwartego naczynia ultraczystego o cienkich ściankach.
Następnie nałożyć trzy mililitry 25% jodiksanolu nad warstwą 40%, aby utworzyć nieciągły gradient. Delikatnie nałożyć siedem mililitrów przetworzonej zawiesiny na szczycie gradientu. Uważaj, aby wyważyć pojemniki i załadować je do wirówki ultracentryfugacyjnej z wirującą miską.
Wyśrodkuj z prędkością 150 000g przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza, z szybkim przyspieszeniem i powolnym hamowaniem. Następnie delikatnie usuń pojemniki bez zakłócania gradientu. Zbierz frakcje po jednym mililitru od góry do dołu do oznakowanych mikrocentryfugowych pojemników o pojemności 1,5 ml.
Przechowuj wszystkie frakcje na lodzie. Teraz identyfikuj i scal frakcje siedem i osiem zawierające oczyszczone CME-AAV do nowego otwartego naczynia ultracentryfugowego. Uzupełnij objętość do 11 mililitrów PBS.
Następnie delikatnie wymieszaj za pomocą pipety jednomililitrowej. Wyśrodkuj scaloną frakcję z prędkością 150 000g przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza, z szybkim przyspieszeniem i hamowaniem. Delikatnie odsuń surnatę.
Resuspenduj pellet w 50 do 200 mikrolitrach sterylnego PBS, w zależności od pożądanej koncentracji. Przedłuż oczyszczoną preparację. Następnie przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.
Przygotuj robocze roztwory enkapsulowanego wirusa i kontrolnego wirusa w sterylnym PBS. Dodaj równe kopie genomu enkapsulowanego wirusa lub kontrolnego wirusa bezpośrednio do podłoża hodowlanego w każdej dołce. Uwzględnij ujemne dołki kontrolne z równoważną objętością PBS lub pustych cząstek wirusa.
Delikatnie przemieszaj płytkę, aby zapewnić równomierne rozłożenie i inkubację przez 24 do 72 godzin, w zależności od projektu eksperymentu. Następnie delikatnie aspirują podłoże hodowlane. Wypłucz komórki dwukrotnie z PBS bez ich przemieszczania.
Wybarwia jądra Hoechst 33342 zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi zestawami filtrów dla wzmocnionego białka flu
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Pochodne pęcherzyków zewątkórkowych (EVs) z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) stają się obiecującymi narzędziami w zastosowaniach terapeutycznych i medycynie regeneracyjnej. Niniejszy artykuł przedstawia nową platformę wykorzystującą nanopęcherzyki otoczone błoną MSC, wytwarzane za pomocą metody ekstruzji o zdefiniowanej wielkości, w celu efektywnego dostarczania wektorów terapii genowej. Te zaprojektowane pęcherzyki enkapsulują rekombinowane wektory wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV), oferując poprawioną wydajność dostarczania genów oraz skalowalność produkcji w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórek macierzystych
- Nanotechnologia
Wstęp
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometrowe pęcherzyki wydzielane przez wszystkie typy komórek, przenoszące białka, RNA i metabolity.
- EVs pochodzące z MSC posiadają potencjał terapeutyczny dzięki zdolności do modulowania zachowania komórek biorcy.
- Efektywne dostarczanie DNA za pomocą EVs jest utrudnione ze względu na słabe mechanizmy sortowania DNA.
- Poprzednie badania wykazały, że EVs zawierające AAV mogą dostarczać geny, jednak produkcja jest ograniczona przez niską wydajność i czasochłonne procesy.
Cel badania
- Opracowanie skalowalnej i wydajnej metody produkcji nanopęcherzyków otoczonych błoną MSC do dostarczania genów.
- Enkapsulacja rekombinowanych wektorów AAV wewnątrz tych pęcherzyków w celu usprawnienia transferu genów.
- Porównanie wydajności i uzysku tej platformy z konwencjonalnymi AAV oraz naturalnie wydzielanymi EV-AAVs.
Zastosowane metody
- Generowanie nanopęcherzyków otoczonych błoną MSC przy użyciu techniki ekstruzji o określonej wielkości.
- Enkapsulacja rekombinowanych wektorów AAV niosących terapeutyczne sekwencje genów wewnątrz nanopęcherzyków.
- Charakterystyka wielkości (średnica około 200 nm) i właściwości pęcherzyków.
- Porównanie wydajności dostarczania genów i wydajności produkcji w stosunku do konwencjonalnych AAV oraz EV-AAVs.
Główne wyniki
- Sprecyzowane nanowesykule MSC naśladują naturalne EV i efektywnie enkapsulują wektory AAV.
- Wesykule te osiągają znacznie wyższą wydajność dostarczania genów w porównaniu do konwencjonalnych AAV.
- Wydajność produkcji została znacznie poprawiona, przy jednoczesnym skróceniu czasu i obniżeniu kosztów w stosunku do naturalnie wydzielanych EV-AAV.
- Platforma ta umożliwia skalowalną produkcję odpowiednią do zastosowań w badaniach klinicznych.
Wnioski
- Platforma nanopęcherzyków błonowych opartych na MSC zwiększa wydajność i skalowalność dostarczania genów.
- Podejście to łączy zalety struktur naśladujących EV z transferem genów za pośrednictwem AAV.
- Technologia ta oferuje obiecującą strategię rozwoju terapii genowej w kierunku zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne i skalowalne dostarczanie genów pozostaje krytycznym wyzwaniem w procesach terapii genowej i medycyny regeneracyjnej. Opracowanie nanopęcherzyków otoczonych błoną mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), enkapsulujących rekombinowane wektory AAV, pozwala rozwiązać kluczowe problemy dotyczące wydajności dostarczania oraz uzysku produkcyjnego. Platforma ta zapewnia zwiększoną pewność prognostyczną dla translacyjnych programów terapii genowej i wspiera optymalizację portfela projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów transferu genów w systemach komórkowych istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez naśladowanie naturalnych właściwości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów dostarczania genów przy zwiększonej wydajności.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane preparaty nanopęcherzyków dla powtarzalnych testów dostarczania genów.
- Poprawia skalowalność i przepustowość testów poprzez skrócenie czasu i obniżenie kosztów produkcji.
- Umożliwia ilościowe porównanie wydajności transferu genów pomiędzy kandydowanymi wektorami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez wspieranie stabilnej ekspresji genów in vitro oraz in vivo.
- Powiązanie etapu odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki skalowalnym nośnikom dostarczania naśladującym pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV).
- Zmniejszenie ryzyka w procesie wdrażania kandydatów do terapii genowej w kierunku translacji klinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma nanopęcherzykowa integruje etapy od wczesnego odkrycia po przedkliniczną разрабоkę terapii genowej, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez dotyczących dostarczania i ekspresji genów w systemach pochodzących z MSC.
- Przesiewanie: Zapewnia odtwarzalne, ilościowe wyniki transferu genów w celu oceny kandydatów.
- Analityka: Umożliwia pomiar wydajności i uzysku dostarczania genów do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od walidacji in vitro do przedklinicznych modeli in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla różnorodnych programów terapii genowej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w dostarczaniu genów i walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje produkcję i skraca czas przygotowania do analiz w badaniach nad transferem genów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz alokację kapitału dla zasobów terapii genowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację platform dostarczania genów z uwzględnieniem ryzyka w celu wprowadzenia ich do etapu klinicznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli MSC, inżynierii nanopęcherzyków oraz pracy z wektorami AAV.
- Wymagany dostęp do aparatury do ekstruzji oraz narzędzi analitycznych do charakteryzacji pęcherzyków.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności produkcji pęcherzyków i testów dostarczania genów.
- Możliwa może być konieczność adaptacji w zależności od różnych ładunków genetycznych lub modeli chorób.
- Skalowalność produkcji i charakteryzacja pęcherzyków muszą zostać zwalidowane dla każdego zastosowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Preparation of Human Mesenchymal Stem Cell (hMSC) Membrane Fractions
2:41
Encapsulation of Adeno-Associated Virus (AAV) Within Mesenchymal Stem Cell Membrane Vesicles by Extrusion
3:43
Purification of Membrane-Encapsulated Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Ultracentrifugation
5:48
In Vitro Transduction and Fluorescence Imaging of Cells with Encapsulated and Control Adeno-Associated Virus
7:14
Results
9:02
Conclusion
