Name: Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę ekstruzji do produkcji nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych zawierających wektory AAV. Technika ta zwiększa wydajność dostarczania genów i skalowalność w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wspierana przez Program Guangdong S&T (2023B0303010002) dla DM oraz Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2025A1515011134) i BNU Faculty of Arts and Sciences Cross-disciplinary Research Project (12900-311324240581) dla YL. Ta praca została dodatkowo wspierana przez sprzęt i wiedzę techniczną dostarczoną przez Centrum Instrumentacji i Usług dla Nauki i Technologii na Beijing Normal University.

Wszystkie procedury zwierzęce zostały zatwierdzone przez komitet ds. Opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania na Uniwersytecie Normalnym w Pekinie w Zhuhai, Chiny. Wykorzystane reagenty i sprzęt są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie i formacja CME-AAV za pośrednictwem ekstruzji o określonej wielkości porów
<ol>
	<li>Produkcja rekombinowanych wektorów AAV 
	​UWAGA: Protokół produkcji AAV wykonuje się zgodnie z wcześniej opublikowanymi i powszechnie stosowanymi procedurami. Szczegółowe kroki optymalizacji i wariacje opisano we wcześniejszych badaniach12,26.
	<ol>
		<li>Hodowaj komórki HEK293T w pełnym pożywce wzrostowej i utrzymuj je na poziomie 70%-80% konfluencji w dniu transfekcji.</li>
		<li>Przygotuj trzy plazmidy kodujące (i) wektor transferu AAV zawierający gen interesujący, (ii) geny AAV rep/cap odpowiadające pożądanemu serotypowi oraz (iii) funkcje pomocnicze adenowirusa.</li>
		<li>Przeprowadź współtransfekcję komórek HEK293T trzema plazmidami, stosując ustanowioną metodę transfekcji (np. transfekcję fosforanem wapnia lub opartą na polimerach), zgodnie ze standardowymi praktykami laboratoryjnymi.</li>
		<li>Inkubować przetransfekowane komórki przez 48-72 godziny, aby umożliwić składanie się i akumulację AAV.</li>
		<li>Zbierz komórki i pożywkę hodowlańczą oraz uwolnij cząstki AAV poprzez wielokrotne cykle mrożenia i odmrażania lub równoważną metodę lizy komórkowej.</li>
		<li>Centryfuguj lizat z niską prędkością, aby usunąć szczątki komórkowe i zebrać nadstan zawierający cząstki AAV.</li>
		<li>Oczyść cząstki AAV za pomocą ultrawirowania gradientu gęstości lub innej ustanowionej metody oczyszczania.</li>
		<li>Wymień oczyszczone wektory AAV na sterylny bufor fosforanowy (PBS) i przechowuj alikwoty w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie frakcji membrany MSC 
	UWAGA: Ludzkie komórki mezenchymalne (MSC) zostały izolowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Komórki były hodowane i rozmnażane w ustalonych warunkach lub zmienionych protokołach laboratoryjnych. Tożsamość MSC można potwierdzić poprzez ocenę ekspresji markerów fenotypowych takich jak CD73, CD90 i CD105 za pomocą cytometrii przepływowej. Wielorakość MSC jest weryfikowana przez ich zdolność do różnicowania się w osteoblasty, chondrocyty i adipocyty in vitro. Komórki są gotowe do pobrania, gdy osiągną 70%-90% konfluencję. Poniższe procedury niekoniecznie muszą być wykonywane w warunkach sterylnych.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną i oddziel MSC z naczynia hodowlanego za pomocą skrobaczka komórkowego.</li>
		<li>Zbierz oddzielone komórki do szyjkowego probówka zawierającej PBS i wyśrodkuj przez 5 min przy 300 x g w 4 °C, aby osadzone komórki.</li>
		<li>Przepłucz komórki dwa razy za pomocą PBS, wyśrodkując za każdym razem przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.</li>
		<li>Zawieś końcowy osad komórek w PBS uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteaz.</li>
		<li>Poddaj zawiesinę komórkową trzem cyklom mrożenia i odmrażania, aby rozerwać błonę plazmatyczną i wygenerować surowy lizat komórkowy.</li>
		<li>Pippetuj lizat dokładnie, aby go homogenizować, następnie wyśrodkuj przez 20 min przy 4 °C, aby usunąć szczątki komórkowe.</li>
		<li>Przenieś nadstan do nowej probówki i wyśrodkuj przez 1 h przy 4 °C, aby osadzone frakcje membrany.</li>
		<li>Odsuń nadstan i zawieś wynikający osad membranowy w PBS. Ta zawiesina reprezentuje surową frakcję membrany MSC i będzie używana do enkapsulacji AAV.</li>
		<li>Homogenizuj zawiesinę membranową, sekwencyjnie przepuszczając ją przez strzykawki wyposażone w igły 20 G do 27 G.</li>
		<li>Wyznacz koncentrację białka zawiesiny membranowej za pomocą testu BCA. Rozdziel i przechowuj zawiesinę w -80 °C lub przejdź bezpośrednio do następujących kroków. Ponownie homogenizuj zawiesinę membranową za pomocą strzykawki 27 G po każdym cyklu odmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formacja CME-AAV za pośrednictwem ekstruzji
	<ol>
		<li>Wymieszaj przygotowaną zawiesinę membranową z AAV w określonym stosunku 150 µg białka membranowego na 1 x 1010 kopii genomu (g.c.) AAV. Inkubowaj mieszaninę w 37 °C przez 30 min z delikatnym wstrząsanem.</li>
		<li>Zaladuj mieszaninę membrany-AAV na mini-ekstruderze wyposażonym w 400 nm poliwęglowanową (PC) membranę. Przepuść próbkę przez ekstruder 20 razy, aby promować enkapsulację membrany-AAV.</li>
		<li>Zamień 400 nm membranę PC na 200 nm membranę i powtórz proces ekstruzji 20 razy, aby jeszcze bardziej zmniejszyć heterogeniczność wielkości pęcherzyków.</li>
		<li>Zbierz przetworzoną mieszaninę. Jeśli wymagana jest większa ilość, połącz wiele partii ekstruzji. Powstała zawiesina zawiera CME-AAV, wraz z nie

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+clinical+applications+of+in+vivo+gene+therapy+with+AAVs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Current clinical applications of in vivo gene therapy with AAVs.</a> Mol Ther. 29 (2), 464-488 (2021).</li>
<li>Crunkhorn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+aav+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Profiling aav tropism.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 183(2023).</li>
<li>Kosaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+loading+capacity+and+patterns+of+packaged+DNA+in+AAV+genomes+of+different+sizes+using+long-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the loading capacity and patterns of packaged DNA in AAV genomes of different sizes using long-read sequencing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (2), 101474(2025).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Mol Ther. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Lopez-Gordo, E., Chamberlain, K., Riyad, J. M., Kohlbrenner, E., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+adeno-associated+virus+serotypes+and+engineered+adeno-associated+virus+capsid+variants%3A+Tropism+differences+and+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Natural adeno-associated virus serotypes and engineered adeno-associated virus capsid variants: Tropism differences and mechanistic insights.</a> Viruses. 16 (3), 442(2024).</li>
<li>Louis Jeune, V., Joergensen, J. A., Hajjar, R. J., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+anti-adeno-associated+virus+antibodies+as+a+challenge+in+AAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Pre-existing anti-adeno-associated virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy.</a> Hum Gene Ther Methods. 24 (2), 59-67 (2013).</li>
<li>Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+adeno-associated+virus-9-neutralizing+antibody+in+Chinese+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevalence of adeno-associated virus-9-neutralizing antibody in Chinese patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Gene Ther. 35 (1-2), 26-35 (2024).</li>
<li>Directed evolution of AAV mutants for enhanced gene delivery. Schaffer, D. V., Maheshri, N. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004, 3520-3523 (2004).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+sialylated+N-glycans+on+adeno-associated+virus+capsids+for+targeted+gene+delivery+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Engineering sialylated N-glycans on adeno-associated virus capsids for targeted gene delivery and therapeutic applications.</a> J Control Release. 380, 563-578 (2025).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav-containing+exosomes+as+a+novel+vector+for+improved+gene+delivery+to+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Aav-containing exosomes as a novel vector for improved gene delivery to lung cancer cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 707607(2021).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-encapsulated+adeno-associated+viruses+for+therapeutic+gene+delivery+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-encapsulated adeno-associated viruses for therapeutic gene delivery to the heart.</a> Circulation. 148 (5), 405-425 (2023).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+an+exosome-associated+adeno-associated+viral+vector+enhances+retinoschisin+1+gene+transduction+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of an exosome-associated adeno-associated viral vector enhances retinoschisin 1 gene transduction in the mouse retina.</a> Hum Gene Ther. 32 (13-14), 707-716 (2021).</li>
<li>Breuer, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineering+of+lymphocytes+after+systemic+exosome-associated+AAV+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery.</a> Sci Rep. 10 (1), 4544(2020).</li>
<li>Cheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+aspects+of+extracellular+vesicle-associated+AAV+allows+increased+vector+yield+and+insight+into+its+transduction+and+immune-evasive+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Probing aspects of extracellular vesicle-associated AAV allows increased vector yield and insight into its transduction and immune-evasive properties.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (1), 101407(2025).</li>
<li>Elmore, Z. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+accessory+protein+is+an+adeno-associated+viral+egress+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated accessory protein is an adeno-associated viral egress factor.</a> Nat Commun. 12 (1), 6239(2021).</li>
<li>Deshetty, U. M., Sil, S., Buch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+heart%3A+Encapsulated+viruses+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Extracell+Vesicles+Circ+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the heart: Encapsulated viruses to the rescue.</a> Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (1), 114-118 (2024).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repair+of+spinal+cord+injury+based+on+miR-124-3p-loaded+mesoporous+silica+camouflaged+by+stem+cell+membrane+modified+with+rabies+virus+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Targeted repair of spinal cord injury based on miR-124-3p-loaded mesoporous silica camouflaged by stem cell membrane modified with rabies virus glycoprotein.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (21), e2309305(2024).</li>
<li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+stem+cell+membrane-camouflaged+nanocomplex+for+microRNA-mediated+repair+of+myocardial+infarction+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of stem cell membrane-camouflaged nanocomplex for microRNA-mediated repair of myocardial infarction injury.</a> Biomaterials. , 257-120256 (2020).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+mesenchymal+stem+cell+membrane-coated+nanoparticle+delivery+of+mkp5+inhibits+hepatic+fibrosis+through+the+Ire%2Fxbp1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Biomimetic mesenchymal stem cell membrane-coated nanoparticle delivery of mkp5 inhibits hepatic fibrosis through the Ire/xbp1 pathway.</a> J Nanobiotechnology. 22 (1), 741(2024).</li>
<li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+secreted+from+CXCR4+overexpressing+mesenchymal+stem+cells+promote+cardioprotection+via+akt+signaling+pathway+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes secreted from CXCR4 overexpressing mesenchymal stem cells promote cardioprotection via akt signaling pathway following myocardial infarction.</a> Stem Cells Int. 2015, 659890(2015).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+treating+human+diseases%3A+Molecular+mechanisms+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in treating human diseases: Molecular mechanisms and clinical studies.</a> Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 262(2025).</li>
<li>Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extrusion+technique+for+nanosizing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (4), 36(2016).</li>
<li>Tackenberg, M. W., Kleinebud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+liquids+via+extrusion--A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of liquids via extrusion--A review.</a> Curr Pharm Des. 21 (40), 5815-5828 (2015).</li>
<li>Bai, J. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dean-flow-coupled+elasto-inertial+focusing+accelerates+exosome+purification+to+facilitate+single+vesicle+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Dean-flow-coupled elasto-inertial focusing accelerates exosome purification to facilitate single vesicle profiling.</a> Anal Chem. 95 (4), 2523-2531 (2023).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+gene+delivery+system+coupled+with+extracellular+vesicle-encapsulated+AAV+for+improving+diabetic+wound+through+promoting+vascularization+and+remodeling+of+inflammatory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Biomimetic gene delivery system coupled with extracellular vesicle-encapsulated AAV for improving diabetic wound through promoting vascularization and remodeling of inflammatory microenvironment.</a> J Nanobiotechnology. 23 (1), 242(2025).</li>
<li>Smith, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+equivalence+of+stem+cell+and+stem+cell-derived+extracellular+vesicle+transplantation+to+repair+the+irradiated+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Functional equivalence of stem cell and stem cell-derived extracellular vesicle transplantation to repair the irradiated brain.</a> Stem Cells Transl Med. 9 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Liang, Y., Lehrich, B. M., Zheng, S., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+in+biomarker+identification+for+extracellular+vesicle-based+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Emerging methods in biomarker identification for extracellular vesicle-based liquid biopsy.</a> J Extracell Vesicles. 10 (7), e12090(2021).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+adeno-associated+virus+neutralizing+antibodies+in+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of adeno-associated virus neutralizing antibodies in males with Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Gene Ther. 34 (9-10), 430-438 (2023).</li>
<li>Yan, B., Liang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+therapeutics+for+extracellular+vesicles%3A+Delivering+CRISPR+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">New therapeutics for extracellular vesicles: Delivering CRISPR for cancer treatment.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15758(2022).</li>
<li>Hu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+membrane-camouflaged+polymeric+nanoparticles+as+a+biomimetic+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 10980-10985 (2011).</li>
<li>Aryal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+membrane-cloaked+polymeric+nanoparticles+for+controlled+drug+loading+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte membrane-cloaked polymeric nanoparticles for controlled drug loading and release.</a> Nanomedicine (Lond). 8 (8), 1271-1280 (2013).</li>
<li>Zhang, W., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+membrane-camouflaged+targeted+delivery+system+in+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Stem cell membrane-camouflaged targeted delivery system in tumor.</a> Mater Today Bio. 16, 100377(2022).</li>
</ol>

Dr. Daopin Wu jest pracownikiem Guangdong Hengqin United Life Science Co., Ltd. Firma nie udostępniła finansowania dla tego badania i nie miała wpływu na projekt badania, zbieranie danych, analizę danych, przygotowanie rękopisu, ani decyzję opublikowania. Pozostali autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Krytyczne kroki protokołu CME-AAV
Ten protokół opisuje metodę wytwarzania MSC otoczonych membraną AAV, a kilka kroków jest kluczowych dla udanego tworzenia CME-AAV. Po pierwsze, staranne wstępne przetwarzanie błony komórkowej jest niezbędne. Celem tego kroku jest uzyskanie fragmentów błony, które są odpowiednie do ekstruzji, jednocześnie minimalizując zanieczyszczenia przez DNA jądrowe, białka cytozolowe i organelle podkomórkowe. Ponadto, wielkość fragmentów błony jest kluczow...

Terapia genowa stanowi przełomowe podejście w leczeniu chorób genetycznych i nabytych, poprzez wprowadzanie, zastępowanie lub wyciszanie określonych genów w celu przywrócenia normalnej funkcji komórkowej. W ciągu ostatnich dwóch dekad postępy w inżynierii wektorów i strategiach dostarczania znacznie rozszerzyły terapię genową. Wśród różnych opracowanych systemów wektorowych, adeno-assosjowany wirus (AAV) stał się jedną z najbardziej udanych i szeroko stosowanych platform ze względu na korzystny profil bezpieczeństwa, efektywne przeprowadzenie i długotrwałą ekspresję genów zarówno w komórkach dzielących się, jak i nie dzielących się1,2. Do tej pory wiele terapeutyk opartych na AAV otrzymało aprobatę regulacyjną do użytku klinicznego, w tym leczenie atrofii mięśniowej rdzenia kręgowego, dystrofii siatkówki i hemofilii, co oznacza ważne milenium w medycynie translacyjnej3. Szerokie tropizmy i niska immunogenność wektorów AAV umożliwiły również ich zastosowanie w różnorodnych tkankach, w tym w wątrobie, mięśniach, układzie nerwowym centralnym i oku4. W rezultacie AAV stał się wiodącą platformą dla in vivo dostarczania genów, wspierającą trwające badania przedkliniczne i kliniczne ukierunkowane na zaburzenia metaboliczne, neurologiczne i sercowo-naczyniowe.
Mimo niezwykłego sukcesu klinicznego, terapia genowa oparta na AAV napotyka na kilka wewnętrznych wyzwań, które nadal ograniczają jej szersze zastosowanie. Jednym z głównych ograniczeń jest ograniczona pojemność pakietowania genomu kapsydu AAV (~4,7 kb), która ogranicza jego zastosowanie do dostarczania dużych lub wielu terapeutycznych genów5,6. Ponadto biodystrybucja i tropizm komórkowy wektorów AAV są w dużej mierze determinowane przez ich serotypy, z których każdy wykazuje odmienne powinowactwo do określonych tkanek. Chociaż zastosowane zostały rozległe inżynierie kapsydu i strategie wyświetlania peptydów w celu poprawy docelowania do tkanek i efektywności transdukcji, osiągnięcie precyzyjnego i przewidywalnego tropizmu w różnych kontekstach biologicznych pozostaje znaczącą przeszkodą7. Innym krytycznym ograniczeniem jest występowanie przeciwciał neutralizujących (NAbs) przeciwko naturalnym serotypom AAV w populacji ludzkiej. Nawet niskie tytry NAbs mogą znacznie zmniejszyć efektywność transdukcji wektora, ograniczając kwalifikację pacjenta i komplikując wielokrotne dawkowanie8,9. Różne strategie, takie jak racjonalna przeprojektowanie kapsydu, reżimy immunosupresyjne i przemijająca wymiana osocza, zostały zbadane w celu złagodzenie neutralizacji opornej na przeciwciała10,11, jednak te podejścia oferują tylko częściową lub przejściową ulgę. Łącznie te ograniczenia zmniejszają ogólną skuteczność terapeutyczną i powtarzalność dostarczania genów z wykorzystaniem AAV w ustawieniach klinicznych.
W ostatnich latach otoczony dodatkowym wektorem AAV (EV-AAV) został zbadany jako alternatywny wektor z potencjalną możliwością pokonania kilku kluczowych ograniczeń konwencjonalnych AAV12,13,14,15. Podczas pakowania wektora część cząstek AAV może być wydzielany poprzez ścieżki transportu wezykulowego i zostać zamknięta w wezykułach pozakomórkowych. Proces ten jest uważany za zaangażowanie białka uzupełniającego wiązanie do membrany kodowanego przez AAV (MAAP), które ułatwia wyjście wirusa i promuje wiązanie do membrany16,17. Powstałe cząstki EV-AAV wykazują lepszą efektywność transdukcji i zwiększoną odporność na przeciwciała neutralizujące w porównaniu z konwencjonalnym AAV, głównie ze względu na błonę wezykuliarną, która promuje przyjmowanie przez komórki i zapewnia częściowe osłonięcie przed rozpoznawaniem przeciwciał18. Jednak pomimo tych zalet, produkcja EV-AAV nadal jest nieefektywna. Zazwyczaj tylko niewielka frakcja genomów wektora (około 0,5%–12%) jest wydzielana do pożywki kultury jako AAV stowarzyszone z EV, podczas gdy większość pozostaje wewnątrzkomórkowa lub istnieje jako wolne AAV12,13. W konsekwencji wymaga to dużej skali produkcji, aby uzyskać wystarczającą wydajność wektora. Co więcej, wytwarzanie EV-AAV było głównie demonstrowane przy użyciu komórek producentów HEK293T, których EV mogą wykazywać szybkie usuwanie w wątrobie, krótki okres półtrwania w krążeniu i potencjalne zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego. Te ograniczenia podkreślają potrzebę bardziej efektywnej i personalizowanej strategii owijania błoną, motywując rozwój platformy AAV owijającej błonę komórkową (CME-AAV) przedstawionej w niniejszym badaniu.
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i ich EV były szeroko badane ze względu na ich regeneracyjny potencjał i właściwości uchylające się

<table><tbody><tr><td>Bioluminescence imaging system</td><td>PerkinElmer</td><td>IVIS Spectrum optical imaging system (Lumina III)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin potassium salt</td><td>Yeasen Biotechnology</td><td>40902ES03</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Yeasen Biotechnology</td><td>40130ES76</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon-coated copper grid 200 mesh</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TEM-FCF400CU</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500BT</td><td></td></tr><tr><td>Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix</td><td>Yeasen Biotechnology</td><td>11205ES08</td><td></td></tr><tr><td>High-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>NTA instrument</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Open-top thinwall ultra-clear tube for ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep iodixanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4%</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>V900929</td><td></td></tr><tr><td>qPCR instrument</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td>QS6 real-time PCR system&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rotor for high-speed centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Swing-bucket rotor for ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscope&nbsp;</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XE-100</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>NC1375332</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (200 nm)</td><td>Cytiva</td><td>10417004</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (400 nm)</td><td>Cytiva</td><td>10417104</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Development of Mesenchymal Stem Cell Membrane-Enveloped Nanovesicles for Enhanced Gene Delivery

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące od pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) obiecują wiele w zastosowaniach terapeutycznych i medycynie regeneracyjnej. EV to nanoskalowe pęcherzyki wydzielane przez wszystkie znane typy komórek, zawierające różnorodne ładunki, w tym białka zakotwiczone w błonie, rozpuszczalne czynniki, wiele gatunków RNA i metabolity, które regulują fizjologię i zachowanie komórek odbiorców. Podczas gdy EV pochodzące od MSC lub inżynieryjne mogą dostarczać terapeutyczne białka i RNA, dostarczanie DNA za pośrednictwem EV pozostaje wyzwaniem z powodu braku efektywnych mechanizmów sortowania sekwencji DNA do wewnątrz pęcherzyków. Poprzednie prace z naszej grupy i innych wykazały, że EV zawierające wirusy adeno-stowarzyszonych (AAV) umożliwiają ukierunkowane dostarczanie do jądra komórkowego i trwałe ekspresję genów in vitro i in vivo. Jednak ich produkcja i izolacja były ograniczone niską wydajnością i czasochłonnymi procedurami. Tutaj opisujemy opracowanie nanopęcherzyków otulonych membraną MSC, wygenerowanych przez metodę wyciskania o określonej wielkości, dla efektywnego dostarczania genów. Te pęcherzyki, o średnicy około 200 nm, naśladują właściwości naturalnych EV, jednocześnie enkapsulując rekombinancyjne wektory AAV zawierające terapeutyczne sekwencje genów. W porównaniu z konwencjonalnymi AAV, inżynieryjne pęcherzyki MSC poprawiły wydajność dostarczania genów i osiągnęły znacznie wyższe plony przy mniejszym czasie i kosztach w stosunku do naturalnie wydzielanych EV-AAV. Podsumowując, przedstawiamy nowatorską platformę nanopęcherzyków membranowych opartych na MSC, która łączy zalety struktur naśladujących EV z transferem genów za pośrednictwem AAV. To podejście poprawia wydajność dostarczania i skalowalność produkcji, oferując obiecującą strategię dla rozwoju terapii genowej w kierunku translacji klinicznej.

MSC użyte w tym badaniu zostały izolowane z ludzkiego tkanki pępowiny zgodnie z protokołami zgodnymi z odpowiednimi wytycznymi etycznymi. Ułamki błony MSC zostały przygotowane zgodnie z opisanym protokołem. AAV9.EGFP został wyprodukowany wewnętrznie za pomocą przejściowego systemu transfekcji z dwoma plazmidami w komórkach HEK293T, zgodnie z wcześniejszymi raportami12,26. Do produkcji CME-AAV preparaty błony i AAV9.EGFP były współinkubowane w proporcji 150 µg bia...

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Mesenchymal stem cell (MSC)-derived extracellular vesicles (EVs) hold great promise for therapeutic applications and regenerative medicine. EVs are ...

W tym protokole wprowadzamy metodę przygotowania nanowesykułów pochodzących od komórek macierzystych mezenchymalnych, które przypominają wesykule pozakomórkowe i zawierają wirusy AAV w celu poprawy dostarczania genów. Nazywamy je CME-AAV. W porównaniu z nowym wektorem dostarczania genów EV-AAV, CME-AAV oferują większą elastyczność w źródłach komórek i wyższy wydajność.Aby rozpocząć, usuń podłoże hodowlane z naczynia hodowlowego zawierającego ludzkie komórki macierzyste mezenchymalne w 70 do 90% konfluencji. Za pomocą zdejmującego do komórek, oddziel komórki z naczynia hodowlowego i przenieś je do stożkowego pojemnika zawierającego PBS. Wyśrodkuj zebrane komórki z prędkością 300g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby utworzyć pellet.Następnie wypłucz pellet komórek dwukrotnie z PBS i ponownie wyśrodkuj. Resuspenduj końcowy pellet komórek w PBS uzupełnionym o koktajl inhibitorów proteaz. Następnie poddaj zawiesinę komórek trzem cyklom mrożenia i rozmrażania, aby zniszczyć błonę komórkową i uzyskać surowy lizat.Za pomocą pipety dokładnie zhomogenicuj lizat. Następnie wyśrodkuj z prędkością 1 000g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe. Przenieś surnatę do nowego pojemnika.Wyśrodkuj z prędkością 18 000g przez jedną godzinę w czterech stopniach Celsjusza, aby utworzyć pellet frakcji błonowej. Odsuń surnatę i resuspenduj pellet błony w PBS, aby uzyskać surowy frakcji błony komórek macierzystych mezenchymalnych. Teraz zhomogenicuj zawiesinę błony poprzez kolejne przepuszczenie jej przez strzykawki wyposażone w igły 20 do 27 kalibru.Wyznacz koncentrację białka w zhomogenizowanej zawiesinie błony za pomocą testu kwasu bicinchoninicowego. Przedłuż zawiesinę i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu potrzeby. Ponownie zhomogenicuj zawiesinę za pomocą strzykawki 27 kalibru po każdym cyklu rozmrażania.Wymieszaj przygotowaną zawiesinę błony z adeno-powiązanym wirusem lub AAV w proporcji 150 mikrogramów białka na jedno razy 10 do potęgi 10 kopii genomu. Inkubując mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z delikatnym wstrząsaniem. Wprowadź mieszaninę błony i wirusa do mini ekstrudera wyposażonego w 400 nanometrową membranę poliwęglanową.Przepuść mieszaninę przez ekstruder 20 razy, aby promować enkapsulację. Zamień 400 nanometrową membranę na 200 nanometrową membranę i powtórz ekstruzję. Zbierz zawiesinę procesu zawierającą enkapsulowany wirus, wraz z nieenkapsulowanym wirusem i pustymi wesykułami.Scal wiele partii, jeśli to konieczne, i natychmiast przystąp do oczyszczania. Rozcieńcz roztwór jodiksanolowy 10x PBS i sterylną zdejonizowaną wodą, aby przygotować roztwory 40 i 25%. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr 40% jodiksanolu na dno 13,2 mililitrowego otwartego naczynia ultraczystego o cienkich ściankach.Następnie nałożyć trzy mililitry 25% jodiksanolu nad warstwą 40%, aby utworzyć nieciągły gradient. Delikatnie nałożyć siedem mililitrów przetworzonej zawiesiny na szczycie gradientu. Uważaj, aby wyważyć pojemniki i załadować je do wirówki ultracentryfugacyjnej z wirującą miską.Wyśrodkuj z prędkością 150 000g przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza, z szybkim przyspieszeniem i powolnym hamowaniem. Następnie delikatnie usuń pojemniki bez zakłócania gradientu. Zbierz frakcje po jednym mililitru od góry do dołu do oznakowanych mikrocentryfugowych pojemników o pojemności 1,5 ml.Przechowuj wszystkie frakcje na lodzie. Teraz identyfikuj i scal frakcje siedem i osiem zawierające oczyszczone CME-AAV do nowego otwartego naczynia ultracentryfugowego. Uzupełnij objętość do 11 mililitrów PBS.Następnie delikatnie wymieszaj za pomocą pipety jednomililitrowej. Wyśrodkuj scaloną frakcję z prędkością 150 000g przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza, z szybkim przyspieszeniem i hamowaniem. Delikatnie odsuń surnatę.Resuspenduj pellet w 50 do 200 mikrolitrach sterylnego PBS, w zależności od pożądanej koncentracji. Przedłuż oczyszczoną preparację. Następnie przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.Przygotuj robocze roztwory enkapsulowanego wirusa i kontrolnego wirusa w sterylnym PBS. Dodaj równe kopie genomu enkapsulowanego wirusa lub kontrolnego wirusa bezpośrednio do podłoża hodowlanego w każdej dołce. Uwzględnij ujemne dołki kontrolne z równoważną objętością PBS lub pustych cząstek wirusa.Delikatnie przemieszaj płytkę, aby zapewnić równomierne rozłożenie i inkubację przez 24 do 72 godzin, w zależności od projektu eksperymentu. Następnie delikatnie aspirują podłoże hodowlane. Wypłucz komórki dwukrotnie z PBS bez ich przemieszczania.Wybarwia jądra Hoechst 33342 zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi zestawami filtrów dla wzmocnionego białka flu

development-mesenchymal-stem-cell-membrane-enveloped-nanovesicles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Ten protokół opisuje system przeszczepiania komórek za pomocą genetycznie modyfikowanych, wstrzykiwanych sferoidów. Sferoidy komórkowe są hodowane na mikrowzorcach i odzyskiwane po wprowadzeniu genów za pomocą nanomiceli polipleksowych. System ten ułatwia przedłużoną ekspresję transgenu z przeszczepionych komórek u zwierząt gospodarza, przy jednoczesnym zachowaniu wrodzonej funkcji komórek.

Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Choroby związane z wiekiem są związane z wieloma defektami składników cytoplazmy. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania pęcherzyków błony komórkowej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana jako środek terapii zastępczej cytoplazmy w celu poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem.

Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Opracowaliśmy prosty i tani protokół ładowania kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) w cząsteczkach wirusopodobnych. Cząstki te, zwane "nanoostrzami", umożliwiają skuteczne dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA w komórkach unieśmiertelnionych i pierwotnych, a także in vivo.

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

W tym miejscu przedstawiamy podejście do terapii genowej, które dostarcza chitozan pokryty ABE bezpośrednio do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.

Ulepszone dostarczanie i ekspresja genów za pomocą dokostnego wstrzykiwania nanocząstek chitozanu Enkapsulowane plazmidy edytora zasad adeninowych

Poznaj metodę ekstruzji do produkcji nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych zawierających wektory AAV. Technika ta zwiększa wydajność dostarczania genów i skalowalność w terapii genowej.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Przeglądaj więcej filmów