Name: Wielokanałowa cytometria przepływowa oparta na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj wielokanałową cytometrię przepływową opartą na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T. Ta metoda umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu cytokin i mediatorów cytotoksycznych z ograniczonych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to zostało sfinansowane przez Inicjatywę Innowacyjnych Leków 2 Wspólne Przedsięwzięcie w ramach umowy o grant numer 945393, T2EVOLVE. To Wspólne Przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z Europejskiego Programu Badań i Innowacji Horyzont 2020, Europejskiej Federacji Przemysłu Farmaceutycznego i Stowarzyszeń (EFPIA) oraz Europejskiego Towarzystwa Hematologicznego (EHA) (dla M.H., C.Q., M.L.), ERA-NET TRANSCAN-3 (wspólne finansowanie WE z 2021, SmartCAR-T dla M.H. i M.L.), Wilhelm-Sander-Stiftung (grant nr 2022.134.1 dla M.L.), Fundacji Paula i Rodgera Riney (dla M.H. i M.L.), IZKF Würzburg (S-511, C-543 dla M.L.), Niemieckiej Fundacji Badań Naukowych (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221 (podprojekt A03 i A06 dla M.H. i M.L.); SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (podprojekty A02 M.H. i C04 M.L.) i CRC1525 (grant na początek dla M.L.), Bawarskie Centrum Badań nad Rakiem (BZKF; TANGO dla M.H. i M.L.), Nagroda INCA od Novartis (dla M.L.)

Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane od anonimowych, zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej zgody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Izby Lekarskiej Nadrenii Północnej (#2020272) i przeprowadzone zgodnie z wymaganymi regulacjami etycznymi i dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
1. Kospołkultura komórek CAR T
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę komórek inżynieryjnie zmodyfikowanych ludzkich komórek CAR T bez antygenu kognitywnego i w jego obecności, np. komórek nowotworowych prezentujących antygen w proporcji 2,5:1 (efektor : komórki docelowe).</li>
	<li>Określ jeden lub wiele punktów czasowych pobrania supernatantu w celu analizy wydzielanych cytokin raz lub analizy kinetyki cytokin w określonym przedziale czasowym, np. po 4, 8, 16, 24 i 48 godzinach. 
	UWAGA: Supernatants mogą być używane bezpośrednio lub mogą być zamrożone na późniejsze użycie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie standardu i próbki
<ol>
	<li>Odzyskaj standard analityczny dodając 200 μL buforu lub pożywki do kultury komórkowej do pelletu i delikatnie wymieszaj. Przygotuj sześć rurek z reagentami i wykonaj 1:5 serię rozcieńczeń odzyskiwanego standardu, do 3,2 pg/mL lub 0,6 pg/mL (w zależności od anality), i przygotuj próbkę blank.</li>
	<li>Zbierz supernatanty kospołkultur CAR T, na przykład 16 h lub 24 h po kospołkulturze. Opcjonalnie zebrać komórki CAR T do równoległego fenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wiruj próbki przez 10 min w temperaturze 4°C przy 10 000 × g . Użyj supernatantów w stanie surowym lub rozcieńcz je tak, aby pasowały do zakresu krzywej standardowej.</li>
</ol>
3. Przebieg testu
<ol>
	<li>Zmiksuj mieszankę kul z przechwytywaniem, aby dokładnie je resuspendować. Dodaj 50 μL standardu lub próbki, wraz z 20 μL wstępnie rozcieńczonych kulek, do dołków płytki 96-dołkowej z filtrem.</li>
	<li>Inkubację przez 2 h w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Dwa razy spłucz dołki z 200 μL buforu za pomocą manifoldu próżniowego lub wirówki.</li>
	<li>Dodaj 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 1 (w buforze). Inkubację przez 1 h w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Dwa razy spłucz.</li>
	<li>Dodaj 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 2 (w buforze). Inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Raz spłucz.</li>
	<li>Do akwizycji, resuspenduj próbki w 200 μL buforu. Przegląd przebiegu testu jest przedstawiony na Rysunku 1.</li>
</ol>
4. Nabywanie i analiza danych
<ol>
	<li>Nabywaj dane na cytometrze przepływowym wyposażonym w niebieskie i czerwone lasery (wymagane są kanały PE, FITC i APC). Podczas pracy z cytometrami przepływowymi MACSQuant, używaj szablonów Trybu Ekspresowego dla w pełni zautomatyzowanego bramkowania i analizy danych.</li>
	<li>Alternatywnie, wgraj pliki danych FSC lub MQD do narzędzia internetowego InspectoR, które wykonuje zautomatyzowane pomiary ilościowe cytokin i zapewnia gotowe do eksportu wyniki niezależne od używanego instrumentu.</li>
	<li>Upewnij się, że sprawdziłeś prawidłowe rozdzielenie 12 różnych populacji kulek przechwytujących w kanałach FITC i PE.</li>
	<li>Zastosuj krzywą standardową, aby obliczyć stężenia cytokin, i eksportuj oraz wizualizuj wyniki.</li>
	<li>W celu nabywania danych na cytometrze przepływowym MACSQuant, użyj 2D kodu kreskowego flakonu z kulkami przechwytującymi, który zawiera wszystkie istotne ustawienia nabywania.
		<ol>
			<li>Po zalogowaniu się do oprogramowania, wybierz MACSPlex Filter Plate jako półkę próbek i kliknij przycisk Kod kreskowy na pasku narzędzi, aby aktywować czytnik 2D kodów.</li>
			<li>Podaj flakon do czytnika, upewniając się, że kod jest skierowany w stronę migającego światła na optymalnej odległości 0,5–2,5 cm.</li>
			<li>Na karcie Autolabel, przypisz Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) i NoLabel. Dla szeregowych rozcieńczeń standardu komórek cytotoksycznych T/NK, zdefiniuj pozycje grup i na karcie Ustawienia, wybierz Tryb Ekspresowy z Rodzajem: Analiza i Tryb: MACSPlex_Standard, stosując delikatne mieszanie, jeśli to konieczne.</li>
			<li>Nieznane próbki są przypisywane w podobny sposób, z określonymi pozycjami, opcjonalnym grupowaniem i wybraniem Trybu Ekspresowego, Rodzaju: Analiza i Trybu: MACSPlex_Próbka na karcie Ustawienia, w tym opcjonalnymi identyfikatorami próbek i opisami.</li>
			<li>Upewnij się, że definicje półek są poprawne w tabeli Eksperyment, upewnij się prawidłowych poziomów płynu w dołkach płytki z fil

<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

M.L. i M.H. są wymienieni jako wynalazcy w zgłoszeniu patentowym WO2021/058811A1. M.H. jest wymieniony jako wynalazca w zgłoszeniach patentowych i przyznanych patentach dotyczących technologii CAR T, które zostały złożone przez Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA oraz przez Uniwersytet w Würzburgu, Würzburg, Niemcy. M.H. jest współzałożycielem i właścicielem udziałów w T-CURX GmbH, Würzburg, Niemcy. M.H. otrzymał honoraria od Celgene/BMS, Janssen, Kite/Gilead. J.J, A.R. i C.E. są pracownikami Miltenyi Biotec.

Test multipleksowy został zastosowany do profilowania rozpuszczalnych odpowiedzi mediatorów odpornościowych w kulturach współhodowanych komórek CAR T. Komórki CAR T współhodowanie z komórkami docelowymi dodatnimi dla antygenu wykazywały zwiększoną sekrecję IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzymy B i IL-2, co jest zgodne z aktywacją efektorów i funkcją cytotoksyczną4,5,8. W przeciwieństwie do kontroli ujemnych dla antygenu, które wykazywały niską produkcję cytokin, co pokazuje zdolność testu do rozróżniania odpowiedzi specyficznych dla antygenu w badanych warunkach5,8. Wyniki te potwierdzają przydatność testu do oceny czynności komórek CAR T, w tym do zastosowań w analizie związanej z aktywnością, profilowaniem związanym z bezpieczeństwem i badaniami mechanizumu działania.
Chociaż stały panel 12 analitów zapewnia ogólny przegląd aktywności odpornościowej komórek CAR T, może nie być praktyczne wychwytywanie pełnej gamy analitów we wszystkich zastosowaniach. Dla skupionych przepływów pracy, takich jak walidacja testu czy testowanie kontroli jakości (QC) produktów komórek CAR T, panel można zmniejszyć do ograniczonego podzbioru (np. IL-2, IFN-γ i TNF-α), aby usprawnić analizę, zachowując czułość funkcjonalną1,2.
Kluczowe kroki w protokole obejmują projekt kultury współhodowania komórek CAR T i odpowiedni wybór warunków pobierania próbek. W szczególności czas współhodowania i liczba komórek efektorowych (stosunek E:T) bezpośrednio wyznaczają wielkość cytokin i powinny być określone podczas konfiguracji testu5,6. Ponadto należy dostosować rozcieńczenie próbki, aby upewnić się, że stężenia analitów znajdują się w zakresie dynamicznym testu1,2. Dlatego rozwiązywanie problemów powinno skupiać się na weryfikacji wydajności krzywej standardowej i dostosowywaniu warunków współhodowania lub czynników rozcieńczania, jeśli sygnały wypadają poza zakres ilościowy1,2.
W porównaniu z tradycyjnymi pojedynczymi testami ELISA, platforma multipleksowa oparta na cytometrii przepływowej generuje dane z wysokim zagęszczeniem, wieloanalitowe z minimalnych objętości próbek. Umożliwiając jednoczesne pomiary wielu analitów w pojedynczej próbce, multipleksowanie może zmniejszyć ogólne zużycie odczynników, zwiększyć wydajność próbek i skrócić czas testu w porównaniu z wykonywaniem wielu pojedynczych testów1,2. Zautomatyzowane opcje pozyskiwania i standaryzowane opcje analizy mogą potencjalnie zmniejszyć zmienność zależną od użytkownika i wspierać powtarzalność i skalowalność w różnych ustawieniach eksperymentalnych lub produkcyjnych5,8. Standardowa wrażliwość wykrywania ELISA zazwyczaj waha się od 16 do 2000 pg/mL (może być niższa dla zestawów wysokiej czułości)7. W ramach platformy przedstawionej w niniejszym badaniu, najniższe wykrywalne stężenia wahały się od 0,05 pg/mL dla najbardziej wrażliwych analitów do około 93,8 pg/mL dla tych o zasadniczo niższej czułości testu. W ramach wewnętrznych ocen ponad 74% zmierzonych analitów wykazywało granice wykrywalności poniżej 5 pg/mL, a 38% było wykrywalne poniżej 1 pg/mL, co podkreśla ogólną wrażliwość systemu. Ponieważ wrażliwość multipleksowa może różnić się w zależności od cytokin, potencjalna konkurencja epitopów pozostaje ważnym czynnikiem. Aby zminimalizować takie zakłócenia, test wykorzystuje nie nakładające się epitopy do wychwytywania i wykrywania każdego anality, zmniejszając tym samym stronniczość związaną z konkurencją i poprawiając niezawodność pomiaru w warunkach multipleksowych.
Wydajność testu multipleksowego może różnić się w zależności od analitów, w zależności od wrażliwości testu i kontekstu biologicznego, a pod pewnymi warunkami stężenia analitów mogą zbliżać się do górnej granicy wykrywalności i powinny być zatem oceniane podczas konfiguracji testu. Z kolei niektóre anality (np. MCP-1 i IL-4 w niniejszym badaniu) mogą pozostać niewykrywalne w zależności od warunków eksperymentalnych. Ponadto czynniki przedanalizyczne, takie jak obsługa próbek, mogą wpływać na pomiary cytokin, a spójne warunki przetwarzania powinny być utrzymywane, aby zapewnić możliwość porównania.
Ogólnie rzecz biorąc, to podejście multipleksowe umożliwia wydajną i ilościową charakteryzację czynności komórek CAR T. W porównaniu z większością istniejących platform wieloanalitowych wykrywania cytokin, test jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi i zawiera narzędzie oprogramowania związane z urządzeniem, które ułatwia pozyskiwanie i analizę danych. Chociaż wieloanalitowe wykrywanie cytokin było stosowane w innych ustawieniach immunologicznych, niniejsza pra

Charakterystyka funkcjonalna jest niezbędna w badaniach limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), ponieważ dostarcza ona wglądu w potencję, bezpieczeństwo i mechanizmy działania tych terapii. Zrozumienie sygnatur cytokin i mediatorów cytotoksycznych pomaga w ocenie skuteczności terapeutycznej oraz potencjalnych działań niepożądanych, zapewniając opracowanie bezpiecznych i skutecznych metod leczenia. Tradycyjne testy jednoparametrowe, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), mają pewne ograniczenia, m.in. wymagają dużych objętości próbek, długiego czasu przetwarzania i osobnych serii pomiarowych dla każdego analitytu, oferując jednocześnie ograniczony zakres dynamiczny w poszczególnych próbkach1,2. W przeciwieństwie do nich, wieloparametrowe testy oparte na kuleczkach umożliwiają jednoczesną detekcję wielu rozpuszczalnych mediatorów, co skraca czas przetwarzania i zmniejsza zapotrzebowanie na materiał biologiczny, zwiększając jednocześnie zakres dynamiczny1,2. Taka efektywność i szczegółowość analiz sprawiają, że testy multipleksowe są cennymi narzędziami w rozwoju badań nad limfocytami T CAR3,4,5.
Analiza multipleksowa przedstawiona w niniejszym badaniu wykorzystuje koraliki przechwytujące, które wykazują określone profile fluorescencji w kanałach fluoresceiny izotiocyjanianu (FITC) i fykoerytryny (PE) oraz są pokryte specyficznymi przeciwciałami przeciwko rozpuszczalnym analitom. Podczas inkubacji z próbką koraliki te selektywnie wiążą docelowe anality z roztworu. Po przechwyceniu analitów dodawane są przeciwciała detekcyjne w celu utworzenia specyficznych dla analitów kompleksów typu kanapka. Przeciwciała te są bezpośrednio koniugowane z allofikocyjaniną (APC) (detekcja bezpośrednia) lub z biotyną (detekcja pośrednia). W przypadku detekcji pośredniej wymagana jest następująca inkubacja z przeciwciałem antybiotynowym sprzężonym z APC (Rysunek 1). Powstałe kompleksy – składające się z koralików przechwytujących, analitów i przeciwciał detekcyjnych – są analizowane metodą cytometrii przepływowej w celu ilościowego oznaczenia stężeń analitów. Analiza multipleksowa jest technologią opartą na płytkach, obejmującą zdefiniowane standardy służące do generowania specyficznych dla danego analitu krzywych wzorcowych1,2.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70344/70344fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Zasada działania technologii cytokinowej i schemat analizy. Analiza opiera się na 12 populacjach koralików wychwytujących (Capture beads) kodowanych fluorescencyjnie, sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla analizowanych substancji. Po inkubacji z próbką tworzą się kompleksy koralik-analit, które mogą być wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu specyficznych przeciwciał detekcyjnych. Schemat analizy obejmuje 1) przygotowanie standardów analizy i badanych próbek na płytce filtracyjnej, 2) inkubację z koralikami wychwytującymi, 3) inkubację z przeciwciałami anty-analitowymi znakowanymi biotyną w celu utworzenia kompleksów kanapkowych, 4) inkubację z przeciwciałami anty-biotynowymi znakowanymi APC, 5) resuspensję w buforze do pomiaru oraz 6) akwizycję próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70344/70344fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Opisany w niniejszym badaniu test multipleksowy jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi wyposażonymi w laser niebieski (np. 488 nm; kanały FITC i PE) oraz laser czerwony (np. 635 nm; kanał APC). Ponieważ cytometry przepływowe są powszechnie dostępne w laboratoriach badawczych, placówkach klinicznych i środowiskach kontroli jakości, kompatybilność ta ułatwia wdrożenie metody bez konieczności stosowania dodatkowej specjalistycznej aparatury5. W kontekście testowania funkcjonalności komórek CAR-T podejście to umożliwia multiparametryczną ocenę odpowiedzi funkcjonalnych w ramach powszechnie dostępnych procesów analitycznych6. Test ten oferuje istotne zalety dla badań nad komórkami CAR-T, umożliwiając jednoczesną kwantyfikację kluczowych analitytów, w tym GM-CSF, Granzymu B, interferonu (IFN)-γ, interleukiny (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, białka przyciągającego monocyty-1 (MCP-1), perforyny oraz czynnika nekrozy nowotworów (TNF)-α (panel cytotoksyczności ludzkiej). Mediatory te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia aktywacji komórek CAR-T, funkcji efektorowych oraz uwalniania cytokin związanych z bezpieczeństwem4,5,7,8.
Przebieg analizy obejmuje opcje automatycznego bramowania i analizy danych przy użyciu oprogramowania powiązanego z urządzeniem, a także niezależnych od urządzenia, internetowych narzędzi analitycznych5. Funkcje te wspierają usprawnione przetwarzanie danych profilowania cząsteczek efektorowych komórek CAR T poprzez ograniczenie zakresu ręcznej interwencji. Stosowanie zautomatyzowanej analizy może przyczynić się do poprawy spójności w obsłudze danych i ułatwić bardziej efektywną ocenę odczytów funkcjonalnych8.
Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i skalowalną metodę multipleksową do profilowania mediatorów immunologicznych w komórkach CAR T. Dzięki pomiarowi 12 różnych analitów w jednej próbce, podejście to jest szczególnie istotne dla badań mechanistycznych, wczesnych etapów badań oraz badań towarzyszących. Na późniejszych etapach terapii komórkami CAR T korzystne może być zmniejszenie liczby mierzonych cytokin, szczególnie w regulowanym, ograniczonym czasowo środowisku kontroli jakości (QC) podczas testów uwalniania leku. W tym celu z zaprezentowanego panelu można wybrać od 1 do 7 cytokin, aby zaprojektować niestandardowy test cytokinowy, który może zostać zwalidowany do analizy zmodyfikowanych komórek T. Dzięki temu opisany protokół jest idealnie dopasowany do różnorodnych zastosowań zarówno w badaniach, jak i w warunkach kontroli jakości, zarówno we wczesnych, jak i późnych etapach terapii komórkami CAR T3,4,5,9.

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Test wieloplexowy oparty na mikrokroplach cytokin do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Narzędzie internetowe do zautomatyzowanego bramkarstwa i analizy danych MACSPlex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Urządzenie do cytometrii przepływowej wielopleksowych pomiarów danych</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Urządzenie do cytometrii przepływowej wielopleksowych pomiarów danych</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Oprogramowanie do zautomatyzowanego bramkarstwa i analizy</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Optymalizowany wolny od surowicy środek do hodowli komórek przeznaczony do hodowli i ekspansji ludzkich i mysiech komórek T</td></tr></tbody></table>

wielokanałowa cytometria przepływowa oparta na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek car t

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Profilowanie komórek CAR T stanowi wyzwanie ze względu na ich niejednorodność, złożone reakcje immunologiczne i ograniczoną dostępność próbek. Testy wielokrotne umożliwiają ocenę funkcjonalną poprzez jednoczesne wykrywanie szerokiego zakresu cząstek efektorowych, w tym cytokin, chemokin i czynników cytotoksycznych. W niniejszym opracowaniu opisano przeznaczony do cytometrii przepływowej test wielokrotny oparty na kulkach, służący do analizy wydzielania cząstek efektorowych przez ludzkie komórki CAR-T. Nadstany komórek CAR T są inkubowane z mieszaniną kulek uchwytujących, zawierających wiele populacji zakodowanych fluorescencyjnie, sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla anality. Te kulki wiążą rozpuszczalne cele w próbce, tworząc kompleksy kula-analyt, które następnie są wykrywane za pomocą oznaczonych przeciwciał detekcyjnych. Test obejmuje panel czynników immunologicznych takich jak interferon (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, czynnik nekrozujący guz (TNF)-α, IL-6, IL-10, granulocytarno-makrofagowy czynnik stymulujący kolonie (GM-CSF) oraz Granzym B. Zastosowanie wcześniej określonych standardów umożliwia ilościowe pomiary wielu anality z pojedynczej próbki. Pozyskiwanie i analizę danych można przeprowadzić za pomocą zautomatyzowanych podejść do bramkowania dostarczonych przez oprogramowanie związane z urządzeniami lub narzędzia internetowe, ułatwiając przetwarzanie danych. Podsumowując, przedstawiony test wielokrotny umożliwia wieloparametryczną analizę funkcjonalności komórek CAR T i może być stosowany w kontekstach takich jak badania, testy kontroli jakości, badania mechanizmu działania oraz charakterystyka funkcjonalna.

Identyfikacja reprezentatywnych populacji koralików wychwytujących kodujących 12 analitów rozpuszczalnych
Populacje kulek przechwytujących zidentyfikowano przy użyciu kanałów FITC i PE cytometru przepływowego. Wyraźne skupiska kulek reprezentujące poszczególne anality zostały jednoznacznie rozdzielone na wykresie dwuosiowym, w tym IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 oraz GM-CSF (Rysunek 2). Każda populacja wykazała unikalną sygnaturę fluorescencji, co potwierdza pomyślną detekcję multipleksową i wyraźne rozróżnienie mierzonych cytokin oraz cząsteczek efektorowych.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70344/70344fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Detekcja reprezentatywnych populacji multipleksowych kulek wychwytujących. Kuleczki wychwytujące posiadają immanentną intensywność fluorescencji, która może być wykorzystana do rozróżnienia poszczególnych populacji specyficznych dla danego analitycznego czynnika. Wykres rozrzutu przedstawia separację sygnałów specyficznych dla analitycznych czynników na podstawie intensywności fluorescencji w kanałach FITC (B1) i PE (B2). Obraz przedstawia reprezentatywny profil 12 populacji kulek wychwytujących kodujących GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin oraz TNF-α. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70344/70344fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Reprezentatywny profil stężenia cytokin w komórkach CAR-T po kokulturze z komórkami nowotworowymi
Po kokulturze komórek CAR T z komórkami docelowymi nowotworu ilości cytokin określono za pomocą panelu cytotoksyczności ludzkiej w badaniu multipleksowym (Rysunek 3). Komórki CAR T wydzielały wysokie poziomy Granzyme B (49 950,2 pg/mL), IFN-γ (48 367,8 pg/mL), TNF-α (7 055,2 pg/mL) oraz GM-CSF (6 653,5 pg/mL), co wskazuje na silną aktywację i cytotoksyczną funkcję efektorową w odpowiedzi na kontakt z nowotworem. Poziomy IL-2 przekroczyły górną granicę wykrywalności (&gt;10 000 pg/mL), co jest spójne z silnym sygnałem proliferacyjnym. Próbka nie została dalej rozcieńczona ani ponownie zmierzona. W przeciwieństwie do nich, cytokiny związane z odpowiedziami regulacyjnych lub alternatywnych helperskich komórek T, w tym IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 oraz MCP-1, występowały na niskich lub niemal niewykrywalnych poziomach. Wyniki te sugerują, że komórki CAR T wywołały głównie odpowiedź immunologiczną typu 1 (Th1/cytotoksyczną), charakteryzującą się wysoką aktywnością efektorową i ograniczoną produkcją cytokin immunosupresyjnych.
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70344/70344fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywny profil cytokinowy komórek CAR-T po ko-kulturze z komórkami nowotworowymi. Zmodyfikowane komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) poddano nocnej ko-kulturze z komórkami nowotworowymi JeKo-1. Nadnadk hücre kultury zebrano po 16 godzinach inkubacji i odwirowano w celu usunięcia cząsteczek. Rozcieńczone próbki przeanalizowano przy użyciu panelu cytotoksyczności ludzkiej w analizie multipleksowej. Wykonano dwie krzywe wzorcowe i określono stężenia wszystkich 12 analitów. Przedstawiono reprezentatywny wynik analizy i obliczeń stężeń specyficznych dla poszczególnych analitów z wykorzystaniem trybu Express Mode cytometru przepływowego. Wykres słupkowy oraz dołączona tabela przedstawiają obliczone poziomy (picogram/mililitr) 12 cząsteczek efektorowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70344/70344fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Kinetyka wydzielania cytokin przez komórki CAR T po stymulacji swoistej dla antygenu
Po kokulturze komórek CAR T z komórkami docelowymi wykazującymi (Antigen⁺) lub nieposiadającymi (Antigen⁻) swoistego antygenu, monitorowano wydzielanie cytokin w czasie, wykorzystując ludzki panel cytotoksyczności w teście multipleksowym. Komórki CAR T wykazały szybkie i silne uwalnianie cytokin po rozpoznaniu antygenów Antigen⁺, z wyraźną nadekspresją Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF oraz IL-2 w ciągu 8–24 h, osiągając poziomy szczytowe do 48 h (Rysunek 4). Wzorzec ten wskazuje na silną aktywację i cytotoksyczną funkcję efektorową po związaniu antygenu. Zaobserwowano również umiarkowane wzrosty poziomów IL-6, IL-17A,&#160;IL-21 oraz Perforiny, podczas gdy poziomy IL-4, IL-10 i MCP-1&#160;pozostały niskie lub nieznacznie podwyższone. W przeciwieństwie do tego, kokultury z antygenami Antigen⁻ wykazały minimalną indukcję cytokin dla wszystkich analizowanych parametrów (Rysunek 4). Wspólnie dane te demonstrują, że aktywacja komórek CAR T i produkcja cytokin efektorowych następują specyficznie w odpowiedzi na rozpoznanie antygenu i nasilają się w czasie.
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70344/70344fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Kinetyka wydzielania cząsteczek efektorowych przez komórki CAR T współhodowane z komórkami docelowymi antygen-dodatnimi lub antygen-ujemnymi&#8203;. Modyfikowane komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) współhodowano z komórkami docelowymi wykazującymi ekspresję (Antigen⁺) lub brakiem ekspresji (Antigen⁻) poznawczego antygenu dla komórek CAR T przez 4, 8, 16, 24 i 48 h. W każdym punkcie czasowym pobrano naddenewstki hodowli i przeanalizowano je przy użyciu panelu cytotoksyczności ludzkiej w teście multipleksowym, aby ilościowo określić szeroki panel rozpuszczalnych analitów efektorowych w czasie. Przedstawiono kinetykę cytokin dla 12 analitów (picogram/mililitr). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70344/70344fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł przedstawia wielofunkcyjną metodę opartą na korzystaniu z mikrocząstek do citomtryi przepływowej, służącą do ilościowego wyznaczania do 12 cytokin i cząszek efektorowych z nadstanów komórek chimerycznych receptorów antygenowych (CAR), co umożliwia szybkie, powtarzalne analizy funkcji inżynieryjnych komórek T przy użyciu małych objętości próbek.

Wielokanałowa cytometria przepływowa oparta na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Nasze badania koncentrują się na funkcjonalnej charakterystyce komórek CAR T, w ramach których opracowano kompatybilny z cytometrią przepływową test multipleksowy do profilowania sekrecji cząsteczek efektorowych. Procedura ta może zostać zastosowana w badaniach nad komórkami CAR T w celu charakterystyki funkcjonalnej, analiz mechanistycznych, testów kontroli jakości (QC) oraz oceny aktywności.W pierwszej kolejności należy przygotować hodowle komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR T) człowieka oraz komórki docelowe, które albo wykazują ekspresję, albo nie wykazują ekspresji cognatywnego antygenu, zachowując stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych na poziomie 2,5 do 1. Należy określić jeden lub kilka punktów czasowych pobierania supernatantu w celu analizy wydzielanych cytokin lub monitorowania kinetyki cytokin w określonym przedziale czasowym.Zrekonstytuuj standard analityczny, dodając 200 µL buforu lub pożywki do hodowli komórkowej do osadu, a następnie delikatnie wymieszaj. Przygotuj sześć probówek z odczynnikiem i wykonaj seryjne rozcieńczenia standardu w stosunku od 1 do 5, aż do osiągnięcia stężenia 3,2 pg/mL lub 0,6 pg/mL. Przygotuj próbkę ślepą. W określonych godzinach po rozpoczęciu kokultury odwiruj kokulturę z prędkością 300 g przez pięć minut w temperaturze 21 °C. Nadlodówki wykorzystaj bezpośrednio lub rozcieńcz, aby dopasować je do zakresu krzywej standardowej.Nawilż płytkę filtracyjną MACSPlex, dodając 200 µL buforu MACSPlex do każdej studzienki, a następnie użyj kolektora próżniowego lub wirówki, aby odessać płyn, aż studzienki zostaną opróżnione. Wymieszaj mieszankę kulek wychwytujących w wortexie, aby dokładnie resuspender kulki. Dodaj 50 µL standardu lub próbki oraz 20 µL uprzednio rozcieńczonych kulek do studzienek 96-dołkowej płytki filtracyjnej. Inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy wstrząsaniu z prędkością 450 rpm. Przemyj studzienki dwukrotnie 200 µL buforu, korzystając z kolektora próżniowego. Dodaj do studzienek 100 µL odpowiednio rozcieńczonego w stosunku od 1 do 50 odczynnika detekcyjnego 1. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy wstrząsaniu z prędkością 450 rpm. Przemyj studzienki dwukrotnie. Dodaj do studzienek 100 µL odpowiednio rozcieńczonego w stosunku od 1 do 50 odczynnika detekcyjnego 2. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy wstrząsaniu z prędkością 450 rpm. Przemyj studzienki raz i resuspender próbki w 200 µL buforu.Użyj dwuwymiarowego kodu kreskowego na probówce z kuleczkami przechwytującymi, aby wczytać ustawienia akwizycji do cytometru przepływowego MACSQuant. Po zalogowaniu się do oprogramowania wybierz płytkę filtracyjną MACSPlex jako rack na próbki. Kliknij przycisk Barcode na pasku narzędzi, aby aktywować czytnik kodów 2D. Przystaw probówkę do czytnika tak, aby kod kreskowy był skierowany w stronę migającego światła w odległości od 0,5 do 2,5 centymetra. W karcie Autolabel przypisz kuleczki przechwytujące jako MPx human cytotoxic T, and natural killer cell i wybierz Nolabel. Zdefiniuj pozycje grup dla rozcieńczeń seryjnych standardu dla cytotoksycznych limfocytów T i komórek NK. W karcie Settings wybierz Express Mode. Ustaw typ na Analysis i tryb na MACSPlex_Standard. Następnie zastosuj delikatne mieszanie. W podobny sposób przypisz próbki nieznane i zdefiniuj ich pozycje. Opcjonalnie pogrupuj próbki oraz wprowadź identyfikatory i opisy próbek. W karcie Settings ponownie wybierz Express Mode. Ustaw typ na Analysis i tryb na MACSPlex_Sample. W tabeli eksperymentu zweryfikuj, czy definicje racków są poprawne. Upewnij się, że poziomy cieczy w dołkach płytki filtracyjnej są odpowiednie i rozpocznij pomiar. Wykorzystując kanały dla fikoerytryny (PE), izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) oraz allofikocyjaniny (APC), wykonaj akwizycję danych na cytometrze przepływowym wyposażonym w lasery niebieski i czerwony. Potwierdź, że w cytometrze przepływowym MACSQuant używane są szablony trybu express do automatycznego bramkowania i analizy danych. Alternatywnie prześlij pliki danych FSC lub MQD do narzędzia internetowego InspectoR w celu zautomatyzowanego ilościowego pomiaru cytokin i uzyskania wyników gotowych do eksportu. Zweryfikuj prawidłową separację 12 różnych populacji kuleczek przechwytujących w kanale FITC względem PE. Zastosuj krzywą standardową, aby obliczyć stężenia cytokin. Na koniec wyeksportuj i zwizualizuj wyniki.Dzięki zastosowaniu wieloparametrowego kodowania kulek, poszczególne grupy kulek reprezentujące poszczególne anality rozdzielono wyraźnie na wykresie dwuosiowym. Po kokulturze z docelowymi komórkami nowotworowymi komórki CAR T wydzielały wysokie poziomy granzymu B, interferonu gamma (IFN-gamma), czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-alpha) oraz czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), co wskazywało na silną aktywację i cytotoksyczną funkcję efektorową. Poziomy interleukiny-2 (IL-2) przekroczyły górną granicę wykrywalności, co jest zgodne z silną sygnalizacją proliferacyjną. Cytokiny związane z odpowiedziami regulacyjnych lub alternatywnych pomocniczych limfocytów T, w tym IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 oraz białko chemokoina dla monocytów 1 (MCP-1), występowały na niskich poziomach lub były niemal niewykrywalne. Komórki CAR T wykazywały szybkie i intensywne uwalnianie cytokin po rozpoznaniu antygenowo-dodatnich celów, z silną nadekspresją granzymu B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF i IL-2 w ciągu od 8 do 24 godzin, osiągając poziomy szczytowe do 48 godzin. Zaobserwowano również umiarkowane wzrosty poziomu IL-6, IL-17A, IL-21 oraz perforyny. Poziomy IL-4, IL-10 i MCP-1 pozostały niskie lub były umiarkowanie podwyższone. Kokultury z antygenowo-ujemnymi celami wykazały minimalną indukcję cytokin dla wszystkich analizowanych parametrów.Niniejszy protokół umożliwia ilościowe oznaczenie cytokin, chemokin i mediatorów cytotoksycznych, które odzwierciedlają aktywację i funkcję efektorową komórek CAR T. Najważniejszymi kwestiami w tym protokole są czas trwania kokultury, stosunek efektorów do celu, rozcieńczenie próbek oraz utrzymanie mierzalnych poziomów analitów. Po wykonaniu tej procedury profilowanie naddatku można połączyć z analizą cytometryczną przepływową, fenotypowaniem komórek CAR T lub testami cytotoksyczności.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Analiza cytokin filmu łzowego pomaga w badaniu różnych chorób oczu. Testy multipleksowe oparte na kulkach są proste i czułe oraz umożliwiają testowanie wielu celów w próbkach o małych objętościach. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania cytokin filmu łzowego za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.

Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Cytometria przepływowa może być wykorzystana do oceny stanu chromatyny w limfocytach T. Protokół ten pozwala naukowcom interpretować dowody na dekondensację chromatyny podczas aktywacji limfocytów T, co przejawia się wzrostem średniej intensywności kwitnienia (MFI) fluorescencyjnych przeciwciał histonu...

Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny stanu chromatyny w limfocytach T

Poznaj wielokanałową cytometrię przepływową opartą na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T. Ta metoda umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu cytokin i mediatorów cytotoksycznych z ograniczonych próbek.

Wielokanałowa cytometria przepływowa oparta na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T

Przeglądaj więcej filmów