Name: Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T13:08:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder z tkanki miażdżycowej po endarterektomii wieńcowej pacjentów po CABG. Protokół umożliwia zachowanie integralności jąder do analizy snRNA-seq, wspierając badania heterogeniczności komórkowej niestabilnych blaszek miażdżycowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Indyjską Radę Badań Medycznych (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) oraz współpracę z Instytutem Kardiologii i Centrum Badawczym ONZ Mehta w Ahmedabadzie. Khushi Jani dziękuje University Grant Commission (UGC) oraz Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) rządu Indii za przyznanie Joint CSIR-UGC NET kwalifikacji (NTA Reference No.: 241620143543).

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Człowieka Instytutu Kardiologii i Centrum Badawczego ONZ Mehta (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) oraz Gujarat Biotechnology University (GBU_IHEC/2023/006). Przed pobraniem próbki uzyskano świadomą zgodę wszystkich uczestników. Do obecnego badania wybrano pacjentów poddawanych operacji pomostowania wieńcowego z endarterektomią wieńcową. Po chirurgicznym usunięciu tkanka endarterektomii została natychmiast umieszczona w bezsurowiczym medium RPMI, utrzymywana w temperaturze 4 °C i transportowana do laboratorium w ciągu około 12 godzin w krioikalu. Zobacz Tabelę materiałów , aby poznać szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w następującym protokole.
1. Izolacja jąder
UWAGA: Wszystkie etapy wykonuj na lodzie i używaj sterylnych materiałów. Przygotuj wszystkie bufory świeżo.
<ol>
	<li>Umyj tkankę raz lub dwa za pomocą bezsurowicowego medium RPMI, aby usunąć plamy i fragmenty krwi. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i zapisz wagę.</li>
	<li>Używając ostrza chirurgicznego (nr 10), pokrój tkankę na małe kawałki o rozmiarze ∼1 mm3 .</li>
	<li>Przygotuj 1 mL buforu lizy, łącząc 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 (z użyciem roztworów zapasowych po 1 M dla każdego składnika), 0,1% (v/v) Nonidet P-40 w wodzie wolnej od nukleazy. Dodawaj składniki kolejno w następującej kolejności: najpierw woda wolna od nukleazy, a na końcu Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ i NP-40, aby uniknąć pienia. UWAGA: Bufor lizowy powinien być przygotowany świeżo w dniu użycia i przechowywany w chłodzie przez cały czas. Nie zastygaj.</li>
	<li>Do tkanki dodaj schłodzony bufor lizowy o pojemności 1 mL w rurce mikrowirówki o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Lizuj tkankę na lodzie mikrotłuczkiem, delikatnie, równomiernie i na przemian kręcąc mikrotłuczkiem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie. Kontynuuj lizę przez około 30 minut, dbając o to, by próbka pozostała zimna przez cały czas. UWAGA: Rozłóż tkankę do mętności. Użyj końcówki 1000 μL, aby delikatnie mieszać pipetowaniem.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór za pomocą sitnika o wielkości poru 100 μm do rurki wirówki o pojemności 15 mL, aby usunąć zanieczyszczenia i kawałki tkanki. UWAGA: Filtrat powinien wyglądać mniej mętnie, z widocznymi zanieczyszczeniami na sicie.</li>
	<li>Wiruj jądra w 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą obrotowego wirnika łyżkowego. UWAGA: Na dnie rurki powinien utworzyć się widoczny pellet.</li>
	<li>Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu, nie naruszając granulatu.</li>
	<li>Przygotuj bufor do mycia i rezawiesji jąder, łącząc 1% albuminy surowicy bydłej (BSA) (przy użyciu 10% roztworu stock), 0,2 U/μL inhibitora RNazy (przy użyciu 20 U/μL roztworu zapasowego) w 1X soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Dodawaj składniki kolejno w następującej kolejności: najpierw DPBS, potem BSA, a na końcu inhibitor RNazy. UWAGA: Bufor powinien być przygotowany świeżo w dniu użycia i przechowywany w chłodzie na lodzie przez cały czas. Nie zastygaj.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet w buforze do mycia jąder i ponownej zawiesiny. Przed użyciem schłodzić bufor na lodzie.</li>
	<li>Oceń skuteczność lizy i żywotność komórek, barwiąc 5 μL trypanowym niebieskim i licząc w hemocytometrze. UWAGA: Jeśli nadal są obecne żywotne komórki, wiruj w 500 x g przez 5 minut w 4 °C, a następnie powtarzaj sekcje 3-10.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór za pomocą sita o wielkości poru 30 μm do rurki wirówki o pojemności 15 mL, aby usunąć zanieczyszczenia i grudki.</li>
	<li>Wiruj jądra w 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą obrotowego wirnika łyżkowego.</li>
	<li>Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu, a następnie ponownie zawiesij pellet w 1 mL bufora do mycia jąder i resuspendacji.</li>
</ol>
2. Charakterystyka izolowanych jąder
<ol>
	<li>Trypanowe barwienie niebieskie do oceny integralności jąder.<ol>
		<li>Pobierz 15 μL izolowanego jądra zawiesiny w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodaj 5 μL barwnika trypan blue (0,4% w/v) i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby prawidłowo się zabarwić.</li>
		<li>Załaduj 10 μL mieszanki barwistej na hemocytometr.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem złożonym, odwróconym w celu obejrzenia morfologii i liczenia jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej zawiesiny pojedynczego jąder<ol>
		<li>Weź 1 mL zawiesiny izolowanych jąder i wiruj zawiesinę jąder w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika łyżkowego z obrotowym wirnikiem.</li>
		<li>Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu i ponownie zawiesij pellet w 200 μL FACS Buffer (1X PBS i 1% BSA).</li>
		<li>Podziel 200 μL jąder zawieszonych ponownie na dwa aliquoty: zachowaj 100 μL jako kontrolę bez barwienia i użyj 100 μL jako próbki barwionej.</li>
		<li>Dodaj 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 mg/mL zapas) do barwionej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut przed analizą cytometryczną przepływu.</li>
		<li>W cytometrze przepływowym używanym w tym badaniu używa się lasera fioletowego przy 405 nm i wykrywa przy użyciu 448/45 nm. Najpierw przeprowadź próbkę kontrolną bez barwienia i pozyskaj minimum 10 000 zdarzeń z całej populacji.</li>
		<li>Ustaw napięcie na 183 V dla rozpraszania w przód (FSC), 300 V dla rozpraszania bocznego (SSC) i 400 V dla V450 (laser DAPI). Ustaw próg na 10 000 dla FSC. UWAGA: Wszystkie ustawienia napięcia i wzmocnienia instrumentu są stałe na wszystkich próbkach, aby zachować spójność.</li>
		<li>Wykreśl pole rozproszenia w przód (FSC-A) względem wysokości rozpraszania w kierunku przód (FSC-H), aby odróżnić singlety od dubletów i agregatów. Narysuj bramkę wokół zdarzeń pokazującą liniową relację, aby zachować tylko jądra singletów.</li>
		<li>Wygeneruj wykres dwuwymiarowy FSC-A względem pola rozpraszania bocznego (SSC-A). Zastosuj szeroką bramkę obejmującą całą populację rozpraszania, ponieważ izolowane jądra zazwyczaj wykazują heterogeniczny profil rozpraszania bez wyraźnych podpopulacji.</li>
		<li>Stwórz dwuwymiarowy wykres gęstości (pseudokolor) SSC-A kontra Violet o obszarze 450 nm (V450-A). Użyj kontrolki niebarwionej, aby zdefiniować fluorescencję tła i precyzyjnie ustawić bramkę. Zidentyfikuj i zlokalizuj odrębną populację DAPI⁺ odpowiadającą nienaruszonym jądrom. UWAGA: Ponieważ stosowany jest pojedynczy fluorochrom (DAPI), kompensacja fluorescencyjna nie jest wymagana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie izolowanych jąder za pomocą mikroskopii konfokalnej<ol>
		<li>Weź 50 μL zawiesiny jąder i dodaj 1 μL DAPI (1 mg/mL) do barwionej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL, wymieszaj delikatnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności przed obrazowaniem konfokalnym.</li>
		<li>Zamontuj 5 μL zawieszenia zabarwionych jąder na czystą szklaną szkiełkę i przykryj ją pokrywką. UWAGA: Unikaj fiksacji, aby zachować morfologię jądrową.</li>
		<li>Wizualizuj jądra za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Otwórz oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i najpierw obserwuj w jasnym polu 10X, a potem przełącz na 40X jasne pole.</li>
		<li>Uzyskanie obrazów konfokalnych za pomocą laserowego skanującego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektor spektralny i obiektywy PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). Wzbudzić DAPI za pomocą lasera 405 nm i zbierać emisję między 429-474 nm.</li>
		<li>Parametry obrazowania były następujące:<ol>
			<li>Tryb detektora: wielokanałowy (GaAsP)</li>
			<li>Skaner: Galvano jednokierunkowy</li>
			<li>Tryb skanowania: pasmo</li>
			<li>Średnia linii: 2X</li>
			<li>Rozdzielczość: 1024 × 1024 piksele</li>
			<li>Czas zatrzymania: 2,0 μs</li>
			<li>Rozmiar otworu: 47,7 μm</li>
			<li>Moc lasera: 0,1-9,3% (w zależności od natężenia pola)</li>
			<li>Wzmocnienie detektora: 37,8-45,9%</li>
			<li>Zoom: 1,0x</li>
			<li>Kalibracja: 0,43-0,58 μm/piksel</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskaj wszystkie zdjęcia aparatem AX z minimalnym trybem przesłuchów i identycznych konfiguracji optycznej, a system perfect focus (PFS) powinien być aktywny podczas obrazowania, aby zachować stabilność na płaszczyźnie z.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roth, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+cardiovascular+diseases+and+risk+factors-+1990-2019%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).</li>
<li>de Winther, M. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+opportunities+of+single-cell+biology+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis.</a> Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).</li>
<li>Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cells+in+cholesterol+accumulation+and+atherosclerotic+plaque+instability%3A+a+perspective+on+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Cardiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis.</a> Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).</li>
<li>Ajoolabady, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+atherosclerosis%3A+pathophysiology+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms.</a> Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).</li>
<li>Dawson, L. P., Layland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+coronary+plaque+features%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Ther%22%5BJournal%5D)">High-risk coronary plaque features: a narrative review.</a> Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).</li>
<li>Tong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+magnetic+particle+imaging+of+vulnerable+atherosclerotic+plaque+with+active+myeloperoxidase-targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles.</a> Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+computed+tomography+angiography+assessment+of+high-risk+plaques+in+predicting+acute+coronary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cardiovasc.+Med%22%5BJournal%5D)">Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome.</a> Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).</li>
<li>Kinoshita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+plaques+on+coronary+computed+tomography+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc.+Imaging%22%5BJournal%5D)">High-risk plaques on coronary computed tomography angiography.</a> JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).</li>
<li>Canu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multimodality+imaging+of+coronary+vulnerable+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cardiovasc.+Med%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient.</a> Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+coronary+computed+tomography+angiography-derived+plaque+features+in+the+diagnosis+of+optical+coherence+tomography-defined+vulnerable+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Quant.+Imaging+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques.</a> Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).</li>
<li>Chiorescu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerable+atherosclerotic+plaque%3A+is+there+a+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature.</a> Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).</li>
<li>The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Front.+Cardiovasc.+Med%22">Front. Cardiovasc. Med</a>. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).</li>
<li>Adam, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+of+atherosclerotic+vascular+disease-latest+insights+in+the+research+field%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field.</a> Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).</li>
<li>Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+in+human+atherosclerotic+plaques+reveals+a+novel+smooth+muscle+cell+subtype+that+possesses+multi+differentiation+potential+and+shapes+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment.</a> Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).</li>
<li>Kelly, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+endarterectomy%3A+analysis+of+the+society+of+thoracic+surgeons+adult+cardiac+surgery+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database.</a> Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).</li>
<li>Ghatanatti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+endarterectomy%3A+recent+trends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+DIAGNOSTIC+Res%22%5BJournal%5D)">Coronary endarterectomy: recent trends.</a> J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+cell+populations+and+differential+gene+expression+patterns+in+control+and+aneurysmal+human+aortic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue.</a> Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).</li>
<li>Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+transcriptome+of+calcified+atherosclerotic+plaque+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution.</a> Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).</li>
<li>Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+single-cell+RNA+sequencing+to+better+understand+how+diseased+cells+behave+the+way+they+do+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+of+haematopoietic+cells+in+fresh+and+frozen+human+atheroma+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue.</a> Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).</li>
<li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li>
<li>Williams, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+in+atherosclerosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research.</a> Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+Nuclear+intermediate+filament+proteins+with+fundamental+functions+in+nuclear+mechanics+and+genome+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation.</a> Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).</li>
<li>Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics in disease.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).</li>
<li>Dechat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+major+factors+in+the+structural+organization+and+function+of+the+nucleus+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin.</a> Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).</li>
<li>Oh, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+type+distribution+between+single-cell+and+single-nucleus+RNA+sequencing%3A+enrichment+of+adherent+cell+types+in+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing.</a> Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).</li>
<li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li>
<li>Gulko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry-assisted+single-nucleus+RNA+sequencing+of+human+and+mouse+adipose+tissue+with+sample+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).</li>
<li>Fernandez, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+immune+landscape+of+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques.</a> Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).</li>
<li>Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NP-40+fractionation+and+nucleic+acid+extraction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).</li>
<li>Wirka, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atheroprotective+roles+of+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+and+the+TCF21+disease+gene+as+revealed+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis.</a> Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+reveals+a+novel+cell+state+during+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+potential+therapeutic+targets+for+atherosclerosis+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human.</a> Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Litviňuková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+the+adult+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of the adult human heart.</a> Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+survey+of+cell+diversity+and+functional+maturation+in+postnatal+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts.</a> Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).</li>
<li>Rani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+use+of+RPMI+Medium+to+preserve+cell+morphology+for+pleural%2Fperitoneal+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology.</a> J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).</li>
<li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relief%3A+emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

Zoptymalizowany sposób izolacji jąder od ludzkiej tkanki endarterektomii wieńcowej opisany jest w obecnym protokole. Opisany tutaj protokół izolacji jądrowej został specjalnie zaprojektowany, aby przezwyciężyć krytyczne ograniczenia w pozyskiwaniu żywotnych, nienaruszonych komórek z zaawansowanych miażdżycowych blaszek wieńcowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść scRNA-seq, które opierają się na surowym trawieniu enzymatycznym i dysocjacji mechanicznej21,30<sup class="xref"...

Miażdżycowa choroba sercowo-naczyniowa (ASCVD) jest wiodącą na świecie przyczyną zgonów i niepełnosprawności, a pomimo znaczących postępów terapeutycznych, jej obciążenie pozostajeniezmniejszone. Miażdżyca to przewlekła choroba zapalna ściany tętnicy, napędzana przez złożone i dynamiczne interakcje między różnorodnymi populacjami komórek, które wspólnie koordynują cichy przebieg od wczesnej choroby subklinicznej do zmieniających życie zdarzeń sercowo-naczyniowych (CV)2.
W średnich i dużych tętnicach nagromadzenie się cholesterolu w makrofagach jest cechą charakterystyczną miażdżycy3. Płytka miażdżycowa składa się z kwasów tłuszczowych, cholesterolu, komórek zapalnych, wapnia, fibryny, komórek mięśni gładkich, komórek śródbłonka oraz zanieczyszczeń komórkowych wewnątrz podśródbłonka4. Blaszki miażdżycowe dzielą się na dwa typy: niskiego ryzyka i wysokiego ryzyka. Płytki wysokiego ryzyka rozpoznaje się po tendencji do wywoływania kolejnego zdarzenia sercowo-naczyniowego, zazwyczaj poprzez mechanizmy takie jak erozja płytki lub pęknięcie5.
Cechy płytk wysokiego ryzyka obejmują duże rdzenie lipidowe, kilka komórek zapalnych, mniej komórek mięśni gładkich, cienką włóknistą czapkę, mikrozwapnienie, krwotok wewnątrzblaszkowy, naczynia neo-naczyniowe oraz martwicze jądro6. Wykrywanie blaszek wysokiego ryzyka przeprowadza się klinicznie za pomocą nieinwazyjnych i inwazyjnych metod obrazowania, mianowicie angiografii wieńcowej komputerowej (CCTA) oraz optycznej tomografii koherencyjnej (OCT), odpowiednio 7,8. Pomimo licznych postępów w obrazowaniu sercowo-naczyniowym, nadal trudno jest przewidzieć pęknięcie płytki miażdżycowej powodującej zawał mięśnia sercowego (MI), a nie zawsze jest to przydatne w warunkach klinicznych9.
Pomimo dekad badań, wciąż brakuje nam wiarygodnych, krążących biomarkerów, które mogłyby konkretnie zidentyfikować fenotypy płytk wysokiego ryzyka, co pozostawia istotną lukę w naszym klinicznym leczeniu miażdżycy. Podkreśla to potrzebę stosowania strategii molekularnych, które mogą scharakteryzować te płytki na bardziej fundamentalnym poziomie biologicznym 7,10. W tym kontekście markery oparte na RNA zyskały znaczną uwagę, ponieważ mogą uchwycić złożoną aktywność transkrypcyjną zachodzącą w mikrośrodowisku płytki11. Najnowsze osiągnięcia w sekwencjonowaniu pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) okazały się szczególnie skuteczne, oferując bezprecedensową rozdzielczość profilowania pojedynczych komórek w miażdżycowych płytkach oraz odkrywania odrębnych populacji komórek, wzorców ekspresji genów oraz szlaków molekularnych leżących u podstaw podatności na płytki12,13. Pomimo tych osiągnięć, istnieje niewielka wiedza na temat procesów regulacyjnych, interakcji oraz funkcjonalnego znaczenia różnych typów komórek związanych z rozwojem miażdżycy14.
Gdy obciążenie miażdżycą jest silne i rozlane, chirurgiczna rewaskularyzacja staje się ostateczną strategią leczenia. Endarterektomia wieńcowa (CE) to chirurgiczne uzupełnienie operacji przeszczepu pomostowania tętnic wieńcowych (CABG), podczas której mechanicznie usuwa się płytkę miażdżycową z rozlanie chorych tętnic wieńcowych, aby umożliwić przeszczep pomostowy i osiągnąć całkowitą rewaskularizację mięśnia sercowego15,16. Płytki miażdżyce i preparaty endarterektomii są szczególnie trudne do obróbki, ponieważ zawierają obfite ilości tkanki martwiczej, osadów lipidowych, fibryny i zwapnienia. Gdy te tkanki są rozkładane do analizy, generują one znaczne ilości zanieczyszczeń, które zatykają filtry i układy mikrofluidyczne, co czyni izolację żywotnych pojedynczych komórek niezwykle trudną17,18. W rzeczywistości jedno z badań na płytkach szyjnym wykazało, że żywotne komórki stanowiły mniej niż 1% wszystkich cząstek po przetworzeniu tkankowym; reszta to były po prostu szczątkipłaskowe 18.
Dodatkowo trudność pogłębia fakt, że płytki miażdżycowe znajdują się w stanie przewlekłego stresu metabolicznego i oksydacyjnego, gdzie komórki podlegające apoptozie, starzeniu i innym procesom zwyrodnieniowym sprawiają, że błony komórkowe stają się coraz bardziej delikatne i podatne na uszkodzenia, co czyni izolację żywotnych pojedynczych komórek niezwykle trudną 18,19,20. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie potrzebne do przygotowania próbek do scRNA-seq często uszkadza te już uszkodzone komórki, co dodatkowo obniża żywotność i prowadzi do niskiego tempa wychwytywania komórek. Proces ten również prowadzi do selektywnej utraty populacji komórek delikatnych lub rzadkich, co wprowadza istotne uprzedzenia zarówno w danych transkryptomicznych, jak i w typach komórek reprezentowanych w końcowych wynikach. Problem ten staje się jeszcze bardziej widoczny w przypadku zwapnionych lub mocno chorych blaszek, gdzie surowe warunki przetwarzania potrzebne do rozkładu tkanki powodują dodatkowe uszkodzenia żywotności komórek 18,21,22.
Dla kontrastu, jądro pozostaje strukturalnie nienaruszone nawet w tych niekorzystnych warunkach23. Wynika to głównie z otoczki jądrowej, podwójnej lipidowej dwuwarstwy wzmocnionej przez laminy jądrowe (lamin A/C i Lamin B), które zapewniają mechaniczną sztywność i odporność na obciążenia osmotyczne, enzymatyczne i fizyczne, które łatwo zakłócają błonę plazmatyczną 24,25. Błonka jądrowa zachowuje także morfologię jądrową nawet wtedy, gdy otaczająca cytoplazma jest poważnie uszkodzona26. To sprawia, że sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) jest bardziej praktyczną i niezawodną alternatywą dla sekwencjonowania RNA jednokomórkowego (scRNA-seq) do profilowania tkanki miażdżycowej27. Poprzez przechwytywanie informacji transkrypcyjnej z nienaruszonych jąder zamiast całych komórek, snRNA-seq omija ograniczenia narzucone przez słabą żywotność komórek i wysoką zawartość zanieczyszczeń, umożliwiając dokładniejsze i kompleksowe profilowanie transkryptomiczne mikrośrodowiska płytki18.
Dlatego w niniejszym badaniu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji jąder opracowany specjalnie dla tkanki endarterektomii wieńcowej, wykorzystujący lizę na bazie niejonowego detergentu oraz empirycznie skorygowany czas trwania lizy w zależności od stopnia zwapnienia tkanek, aby konsekwentnie uzyskać wysokiej jakości jądra o zachowanej integralności strukturalnej i RNA, odpowiednią do dalszej analizy snRNA-seq.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; Sitnik m</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; Sitnik m</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>HiMedia</td><td>TC546-25G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>MPW</td><td>NA</td><td>https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Nikon</td><td>NA&nbsp;</td><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Odwrócony mikroskop konfokalny Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)</td></tr><tr><td>Pokrywki</td><td>HiMedia</td><td>BG011C</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z szerokim pyskiem CRYOCHIL</td><td>Tarsonowie</td><td>883191</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Rurka wirówki (15 mL)</td><td>Tarsonowie</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Przepływowy cytometr &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>663029</td><td>BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Axibio</td><td>CCB 100</td><td></td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówki (1,5 mL)</td><td>Tarsonowie</td><td>500010C</td><td></td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówki (5 mL)</td><td>Tarsonowie</td><td>500050</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotłuczek</td><td>Tarsonowie</td><td>160020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>HiMedia</td><td>MB143-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleazy</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Sigma</td><td>333540201</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp;</td><td>Riwiera</td><td>72910135</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>302643-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Single Nuclei Isolation from Coronary Endarterectomy Tissue of Coronary Artery Bypass Graft Patients

Miażdżyca to przewlekła, postępująca choroba zapalna, charakteryzująca się nagromadzeniem blaszki nazębnej w ścianach tętnic. W trakcie powstawania blaszek niektóre zmiany stają się niestabilne, określane jako płytki wysokiego ryzyka, i mogą powodować zawał mięśnia sercowego (MI). Płytka miażdżycowa składa się z komórek mięśni gładkich, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych, komórek tłuszczowych oraz komórek martwicy, z których każda może powodować pęknięcie płytki. Kluczowe jest badanie niejednorodności komórkowej wewnątrz blaszek miażdżycowych, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw niestabilności blaszki. Przedstawiamy łatwy do powtórzenia protokół izolowania i walidacji jąder z ludzkiej tkanki endarterektomii wieńcowej pobranej od pacjentów poddawanych operacji przeszczepu tętnic wieńcowych (CABG). Wszystkie tkanki są przechowywane na mokrym lodzie w medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI), aby zachować integralność komórek przed zbiorem. Próbki tkanek są drobno mielone, a następnie delikatnie rozbijane mikrotłuczkiem w buforze lizy, aby rozdzielić komórki i uwolnić jądra. Następnie izolowane jądra są oceniane pod kątem integralności i wydajności za pomocą testu wykluczenia trypanowego niebieskiego w mikroskopie złożonym odwróconym. Barwienie DAPI umożliwia wizualizację nienaruszonych jąder za pomocą mikroskopii konfokalnej, a cytometria przepływowa zapewnia ilościową identyfikację opartą na fluorescencji w celu oceny wydajności izolacji jądrowej i potwierdzenia populacji jądrowej. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod izolacji poprzez dysocjację pojedynczych komórek, izolacja jądrowa zmniejsza stres komórkowy i utrzymuje natywne środowisko transkryptomiczne, zapobiegając tym samym zmianom w ekspresji genów. Wysokiej jakości przygotowanie jądrowe uzyskane tą metodą jest kompatybilne z późniejszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq).

Tkanka do endarterektomii wieńcowej u ludzi została pobrana od pacjentów poddawanych operacji CABG. Tkanka została zważona i przetworzona w celu izolacji jąder, a dalsze izolowane jądra potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej (Rysunek 1).
Ocena jakości izolacji jąder w Trypanowym błębie Zważono tkankę przechowywaną w medium RPMI i wymierzono 247,8 mg. Tkanka była drobno pokrojona, a następnie ujednoliczana w buf...

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Atherosclerosis is a chronic, progressive inflammatory condition characterized by the accumulation of plaque in the walls of arteries. During the ...

Naszym głównym celem badań jest mapowanie różnorodności komórkowej w niestabilnych płytkach miażdżycowych w celu zrozumienia interakcji międzykomórkowych, a następnie opracowanie markerów prognostycznych opartych na RNA. Kruchość błony utrudnia izolację pojedynczych komórek od tkanki uzyskanej podczas endarterektomii. Dlatego protokół ten polega na izolowaniu zachowanych jąder, umożliwiając profilowanie transkryptomiczne płytki wysokiego ryzyka.Na początek zbierz wszystkie odczynniki i lodówkę do przeprowadzenia procedury. Umyj tkankę raz lub dwa za pomocą bezsurowicowego medium RPMI, aby usunąć plamy i fragmenty krwi. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i zapisz wagę.Używając chirurgicznego ostrza numer 10, pokrój tkankę na małe kawałki o wielkości około jednego milimetra sześciennego. Następnie dodaj jeden mililitr schłodzonego buforu lizy, a tkankę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Wszy tkankę na lodzie za pomocą mikrotłuczka, stosując delikatną, stałą siłę i kręcąc mikrotłuczkiem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.Kontynuuj lizę przez około 30 minut, trzymając próbkę w lodzie. Przefiltruj roztwór przez sitko o rozmiarze porów 100 mikrometrów do rurki wirówki o pojemności 15 milimetrów, aby usunąć zanieczyszczenia i kawałki tkanek. Wiruj jądra w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego.Następnie usuwam supernatant za pomocą zwykłej końcówki pipety bez naruszania pelletu. Przed użyciem schładz jądra w buforze resuspension na lodzie. Ponownie zawiesij granulek w schłodzonym jądrze do przemycia i zawieszenia.Szybko oceń skuteczność lizy i żywotność komórek, dodając pięć mikrolitrów Trypan Blue do aliquotu próbki i licząc komórki za pomocą hemocytometru. Jeśli pod mikroskopem obserwuje się żywotne komórki, powtórz etapy lizy, filtracji i wirowania. Następnie przefiltruj roztwór przez sitko o wielkości porów 30 mikrometrów do rurki wirówki o pojemności 15 milimetrów, aby usunąć zanieczyszczenia i grudki.Wiruj jądra w 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego. Po odwirowaniu usuń supernatant za pomocą zwykłej końcówki pipety bez zakłócania granulki i ponownie zawiesij granulek w buforze przemycia i zawieszenia jąder o jednym mililitrze. Należy pobrać 15 mikrolitrów zawiesiny izolowanych jąder w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj pięć mikrolitrów barwnika Trypan Blue o masie 0,4% na objętość do zawiesiny jąder i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie. Po pięciominutowej inkubacji załaduj 10 mikrolitrów mieszanki barwistej na hemocytometr. Obserwuj próbkę pod mikroskopem złożonym odwróconym, aby zbadać morfologię i policzyć liczbę jąder.Weź jeden mililitr izolowanego jądrowego zawieszenia i wiruj w napięciu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego. Usuń supernatant za pomocą zwykłej końcówki pipety z przewierciem, nie naruszając granulki. Ponownie zawiesić pellet w buforze sortującym komórki aktywowanym fluorescencją o pojemności 200 mikrolitrów, złożonym z PBS i 1% surowicy probuminowej w surowicy bydlęcej.Podziel 200 mikrolitrów zawieszonych jąder na dwie aliquoty. Zachowaj 100 mikrolitrów jako kontrolę bez barw, a pozostałe 100 mikrolitrów wykorzystaj jako próbkę zabarwioną. Dodaj jeden mikrolitr DAPI z roztworu zapasowego jeden miligram na mililitr do barwionej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr.Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez pięć minut. Ustaw cytometr przepływowy tak, aby używał lasera fioletowego na 405 nanometrów i wykrywał 448 na 45 nanometrów. Najpierw przeprowadź próbkę kontrolną bez barwienia i zgromadzić minimum 10 000 zdarzeń z całej populacji.Wygeneruj wykres obszaru rozproszenia w kierunku przód względem wysokości rozrzutu w kierunku przednim, aby odróżnić singlety od dubletów i agregatów. Narysuj bramkę wokół zdarzeń pokazującą liniową relację, aby zachować tylko jądra singletów. Następnie generuj wykres dwuwymiarowy powierzchni rozproszenia w kierunku przedniego względem bocznego obszaru i stosuj szeroką bramkę obejmującą całą populację rozrzutu.Teraz stwórz pseudokolorowy wykres gęstości 2D z obszarem rozpraszania bocznego względem fioletowego obszaru 450 nanometrów. Użyj kontrolki niebarwionej, aby zdefiniować fluorescencję tła i umiejscowić bramkę prowadzącą. Zidentyfikuj i zlokalizuj odrębną populację DAPI odpowiadającą nienaruszonym jądrom.Weź 50 mikrolitrów zawiesiny jąder i dodaj jeden mikrolitr DAPI z roztworu surowego o jednym miligramie na mililitr, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez pięć minut przed obrazowaniem konfokalnym. Zamontuj pięć mikrolitrów zabarwionych jąder na czystym szkle, a pokrywa pokrywa się z pokrywą.Następnie otwórz oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i obserwuj jądra w jasnym polu 40x. Na koniec wykonaj obrazy konfokalne za pomocą mikroskopu konfokalnego z laserowym skaningiem. Wzbudzić DAPI za pomocą lasera 405 nanometrów i zebrać emisję między 429 a 474 nanometrami.Po izolacji jądrowej i barwieniu Trypanowym na niebiesko zaobserwowano odrębną populację jąder bez nienaruszonych żywotnych komórek, co potwierdza skuteczną lizę tkanek. Izolowane jądra pod mikroskopem wyglądały jako gęste, okrągłe, ciemnoniebieskie ciała, co wskazuje na udaną izolację jądrową. Zwapniała tkanka płytkowa powodowała niższą wydajność jądrową i obniżoną jakość jądrową.Cytometria przepływowa grupy kontrolnej wykazała 77,88% singletów i 0,19% pozytywnych zdarzeń DAPI, co odzwierciedla bazową autofluorescencję. Próbka barwiona DAPI wykazała 68,1% singletów i 25,31% jąder DAPI dodatnich, co wskazuje na wyraźne przesunięcie fluorescencji. Analiza histogramu wykazała przesunięcie fluorescencji w prawo jąder barwionych DAPI w porównaniu do populacji jąder niebarwionych.Obrazowanie konfokalne zabarwionej próbki wykazało jasnoniebieskie jądra fluorescencyjne, które wyglądały na nienaruszone i jednolicie oznaczone. Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra zidentyfikowała 16 odrębnych klastrów komórkowych po redukcji wymiarowości. Największym wyzwaniem podczas realizacji tego protokołu jest wysokie ryzyko zwapnienia w tkance, które krytycznie pogarsza jakość i wydajność jąder.Transkryptom twarzy to kolejne podejście, które możemy wykorzystać do uzyskania szczegółowych informacji, dzięki czemu dostarczy nam informacji o ekspresji genów specjalnych oraz interakcjach między komórkami.

single-nuclei-isolation-from-coronary-endarterectomy-tissue-coronary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

To badanie przedstawia chirurgiczny model przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego spowodowanego postępującym zwężeniem tętnicy wieńcowej, skutkującym upośledzeniem funkcji serca bez zawału. Po niedokrwieniu zwierzęta przechodzą pomostowanie tętnic wieńcowych poza pompą z nasierdziowym umieszczeniem plastra kolagenowego obciążonego egzosomami pochodzącymi z komórek macierzystych. Ta terapia wspomagająca poprawia funkcję mięśnia sercowego i powrót do zdrowia.

Chirurgiczny model przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego u świń leczony egzosomem z plastrem kolagenowym i pomostowaniem aortalno-wieńcowym poza pompą

Poznaj metodę izolacji jąder z tkanki miażdżycowej po endarterektomii wieńcowej pacjentów po CABG. Protokół umożliwia zachowanie integralności jąder do analizy snRNA-seq, wspierając badania heterogeniczności komórkowej niestabilnych blaszek miażdżycowych.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Przeglądaj więcej filmów