Name: Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Naucz się izolować i hodować komórki z wzbogaconych stref kory nadnerczy myszy. Ta metoda umożliwia badanie specyficznej fizjologii zG i zF oraz produkcji hormonów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło zostało wsparte przez FAPESP (Fundacja Badań São Paulo, Brazylia), numer projektu 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), oraz wsparcie 2R01DK123694 (dla DTB) i fundusze z Działu Endokrynologii w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie (DTB).

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Zastosowaniami w Dziedzinie Badań w Boston Children’s Hospital (IACUC) na podstawie zgody numer 00002611. Pełna lista wszystkich materiałów użytych w tym protokole, w tym reagentów, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu, znajduje się w Tabeli Materiałów, wraz z odpowiednimi producentami i numerami katalogowymi, aby zapewnić możliwość powtórzenia eksperymentu.
Pierwotne kultury komórek strefy glomerularnej i fasciculata nadnerczy myszy 
Metody użyte do ustanowienia pierwotnych kultur komórek nadnerczy myszy dorosłych samców typu dzikiego (Mus musculus, C57BL/6) w tym badaniu zostały zaadaptowane z procedury pierwotnie opracowanej dla szczurów Sprague-Dawley28. Aby potwierdzić segregację i tożsamość populacji komórek strefy glomerularnej i fasciculata, zastosowano model śledzenia linii za pomocą myszy Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (znanych również jako-Cre)1,2,3,4 oraz Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (znanych również jako ROSAmT/mG)29.
Przygotowanie przed zabiegiem 
Materiały 
Dwa zestawy kleszczy i nożyczek do powierzchniowych nacięć oraz inny zestaw do nacięcia jamy brzusznej (Dodatek Rysunek 1A). Podgrzanie pożywki kulturalnej i PBS (37 °C). Przygotowanie 2 naczyń (P60) z DMEM/F-12. Przygotowanie 3 naczyń (P60) z podgrzanym PBS do płukania gruczołów kolejno (kąpiele 1, 2 i 3) (Dodatkowe Rysunki 1B, 1–3) oraz 1 naczynia do przechowywania nadnercza w roztworze (Dodatkowe Rysunki 1B, 4). Przygotowanie 2 naczyń (P60) z papierem filtracyjnym na powierzchni (Dodatkowe Rysunki 1C, 1–2). Przygotowanie 2 naczyń P60 z 500 µL roztworu do trawienia i oznakowane jako glomerulosa (zG) lub fasciculata (zF) (Dodatkowe Rysunki 1D, zG, zF). Przygotowanie 2 probówek, oznakowanych jako zG i zF, i dodanie 4,5 mL roztworu do trawienia.
Roztwory 
Aby przygotować roztwór do trawienia, kolagenazę typu I (stężenie końcowe 4 mg/mL) i DNAzę I (stężenie końcowe 0,04 mg/mL) rozpuszczono w 5 mL czystego DMEM/F-12 medium. Roztwór przefiltrowano do 50 mL probówki za pomocą strzykawki i filtra 0,22 µM. Roztwór do trawienia należy przygotowywać świeżo za każdym razem.
Zwierzęta 
Aby uzyskać pierwotne kultury wzbogacone o komórki strefy glomerularnej i fasciculata nadnerczy myszy, użyto 10–15 młodych dorosłych samców myszy, w wieku około 6–7 tygodni. Samice mają nieco większe nadnercza niż samce, a do tego protokołu można użyć obu płci. Jednak w tym badaniu użyto tylko samców, aby uniknąć potencjalnej interferencji z strefą X obecną u młodych samic, zapewniając dokładne separację stref. Myszy uśmiercono poprzez wdychanie CO₂ zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Śmierć potwierdzono brakiem oddechu i brakiem reakcji odruchowej. Gruczoły nadnerczy wycięto natychmiast, w ciągu 3–5 minut po potwierdzeniu śmierci, aby zachować żywotność tkanki.
Pozycja i ekspozycja jamy brzusznej 
Mysz została umieszczona w pozycji twarzą do dołu na sterylnej płaskiej powierzchni (Rysunek 1A). Sierść zwierzęcia dezynfekowało się 70% alkoholem. Do nacięć skórnych użyto kleszczy i nożyczek, a drugi zestaw do nacięcia jamy brzusznej. W początkowej fazie wykonano nacięcie w rejonie pachwinowym brzucha, którego przedłużeniem było nacięcie skierowane bocznie w kierunku klatki piersiowej po obu stronach, aby eksponować otrzewną (Rysunek 1B). Skórę ostrożnie odstawiono, a następnie ścięgna brzucha, aby eksponować jamę brzuszną (Rysunek 1C). Początkowe nacięcie powinno być powierzchowne, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. Przejść do warstwy mięśniowej ostrożnym nacięciem, a następnie eksponować jamę brzuszną. Unikaj rozerwania naczyń krwionośnych, ponieważ krwotok może utrudnić zlokalizowanie gruczołów nadnerczy i opóźnić pobieranie. Zmień narzędzia chirurgiczne, aby zminimalizować zakażenie mikrobiologiczne.
Identyfikacja i pobieranie lewego gruczołu nadnerczy 
Lewy gruczoł nadnerczy znajduje się w środkowej części i powyżej lewego nerki w otrzewnej, ma kształt owalny i różową bar

<ol><li>Zelander, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+the+adrenal+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Zellforsch.+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).</li>
<li>Nishimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+zonation+in+humans+under+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).</li>
<li>Freedman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+zonation+results+from+lineage+conversion+of+differentiated+zona+glomerulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells.</a> Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).</li>
<li>Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+morphology+in+zona+glomerulosa+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).</li>
<li>Gwynne, J. T., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipoproteins+in+steroidogenesis+and+cholesterol+metabolism+in+steroidogenic+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands.</a> Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+rosettes+in+the+zona+glomerulosa+of+human+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex.</a> J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).</li>
<li>Leng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+and+FGFR2+regulate+postnatal+rosette-based+adrenocortical+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis.</a> Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).</li>
<li>Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+zonation%3A+clues+from+11%CE%B2-hydroxylase+and+aldosterone+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).</li>
<li>Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+and+adipose+tissue+morphology+and+metabolism+in+Cushing%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).</li>
<li>Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-specific+nuclear+receptor+is+essential+for+adrenal+and+gonadal+development+and+sexual+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cel.+l%22%5BJournal%5D)">A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation.</a> Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).</li>
<li>Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Ching, S., Vilain, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+Sonic+Hedgehog+in+the+mouse+adrenal+leads+to+adrenocortical+hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia.</a> Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).</li>
<li>Kim, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+%CE%B2-catenin+in+Sf1-expressing+cells+impairs+development+and+maintenance+of+the+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex.</a> Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).</li>
<li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+%CE%B2-catenin+activation+induces+adrenal+hyperplasia+and+promotes+adrenal+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).</li>
<li>Basham, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ZNRF3-dependent+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+gradient+is+required+for+adrenal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis.</a> Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).</li>
<li>Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+Hedgehog+and+WNT+signaling+promote+adrenal+gland+regeneration+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice.</a> Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).</li>
<li>Heikkilä, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-4+deficiency+alters+mouse+adrenal+cortex+function%2C+reducing+aldosterone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production.</a> Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).</li>
<li>Drelon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+inhibits+WNT+signalling+in+adrenal+cortex+zonation+and+prevents+malignant+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development.</a> Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).</li>
<li>Heaton, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+adrenocortical+tumorigenesis+in+mice+and+humans+through+insulin-like+growth+factor+2+and+%CE%B2-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin.</a> Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).</li>
<li>Borges, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+activation+cooperates+with+loss+of+p53+to+cause+adrenocortical+carcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice.</a> Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).</li>
<li>Borges, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+Wnt+signaling+triggered+by+WNT2B+drives+adrenal+aldosterone+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Sasano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+apoptosis+in+normal+and+pathologic+human+adrenal%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal.</a> Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).</li>
<li>Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation%2C+movement%2C+and+differentiation+during+maintenance+of+the+adult+mouse+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex.</a> PLoS One. 8 (12), e81865(2013).</li>
<li>Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).</li>
<li>Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-+and+L-type+calcium+channels+maintain+calcium+oscillations+in+the+murine+zona+glomerulosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa.</a> Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).</li>
<li>Penton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task3+potassium+channel+gene+invalidation+causes+low+renin+and+salt-sensitive+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension.</a> Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).</li>
<li>Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+growth+regulatory+pathways+in+primary+rat+adrenal+cells+and+mouse+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Berber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho%2FROCK+signaling+and+%CE%B1-catenin+mediate+%CE%B2-catenin-driven+hyperplasia+in+the+adrenal+cortex+via+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions.</a> J. Clin. Invest. , (2026).</li>
<li>Smith, T. T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+treadmill+running+reduces+systemic+inflammation+yet+worsens+upper+limb+discomfort+in+a+rat+model+of+work-related+musculoskeletal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskelet.+Disord%22%5BJournal%5D)">Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders.</a> BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).</li>
<li>Kremer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+signatures+of+the+outer+and+inner+zones+of+the+rat+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex.</a> J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).</li>
<li>Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zonation+and+homeostasis+in+the+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).</li>
<li>Pignatti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+causes+adrenal+hyperplasia+by+blocking+zonal+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation.</a> Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).</li>
<li>Romero, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disabled-2+is+expressed+in+the+adrenal+zona+glomerulosa+and+is+involved+in+aldosterone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion.</a> Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).</li>
<li>Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+tumorigenesis+targeted+by+the+corticotropin-regulated+promoter+of+the+aldo-keto+reductase+AKR1B7+gene+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Res%22%5BJournal%5D)">Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice.</a> Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).</li>
<li>Vidal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adrenal+capsule+is+a+signaling+center+controlling+cell+renewal+and+zonation+through+Rspo3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3.</a> Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).</li>
<li>Dörner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLI1%2B+progenitor+cells+in+the+adrenal+capsule+of+the+adult+mouse+give+rise+to+heterotopic+gonadal-like+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+human+adrenal+glands+that+uses+a+sequential+processing+medium+to+facilitate+cortical-medullary+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab%22%5BJournal%5D)">3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development.</a> Clin. Lab. 70 (12), (2024).</li>
<li>Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+cultivation+of+adrenal+cells+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).</li>
<li>Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effect+of+FGF2%2C+synthetic+peptides+1%E2%80%9328+N-POMC+and+ACTH+on+proliferation+in+rat+adrenal+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures.</a> Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).</li>
<li>Gazdar, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+adrenocortical+carcinoma+cell+line+that+expresses+multiple+pathways+of+steroid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis.</a> Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).</li>
<li>Wang, T., Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adrenocortical+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human adrenocortical carcinoma cell lines.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych związanych z tym badaniem.

W niniejszym badaniu przedstawiono udoskonalony protokół, który generuję kultury komórek nadnerczy myszy pierwotnych wzbogaconych o komórki zG (OF) i zF (IF), które wiernie odtwarzają tożsamość strefową i funkcję steroidogeniczną każdej strefy. Protokół ten powinien umożliwić szczegółowe zbadanie biologii komórkowej i molekularnej kory nadnerczy w kontekście strefy, wspierając badania nad białkami, szlakami sygnałowymi oraz mechanizmami zaangażowanymi w rozwój, różnicowanie, funkcję i odnowę kory nadnerczy, przy zmniejsz...

Cienka torebka mezenchymalna otula gruczoł nadnerczy myszy, który składa się z dwóch głównych przedziałów: zewnętrznej kory i wewnętrznej rdzeni. Kora nadnerczy dorosłego samca myszy jest dalej podzielona na odrębne strefy, strefę cebulkowatą (zG) i strefę pręcikowatą (zF), każda z unikalnymi cechami morfologicznymi i funkcjonalnymi1,2,3,4. Główną funkcją kory nadnerczy jest produkcja hormonów steroidowych, w tym mineralokortykoidów (aldosteron) i glikokortykoidów (kortikosteron u myszy)5. ZG jest najbardziej zewnętrzną i najbardziej zwartą strefą i składa się z owalnych komórek ułożonych w struktury różyczkowate, które wyrażają syntazę aldosteronu (CYP11B2), umożliwiającą produkcję aldosteronu2,3,5,6,7. Wydzielanie aldosteronu jest głównie regulowane przez układ renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS), potas i w mniejszym stopniu ACTH5,8. ZF składa się z większych komórek ułożonych w promieniste sznury/wiązki, stanowi większość (około 85%) kory i jest regulowana głównie przez ACTH2,3,5,9. Wiele ścieżek sygnałowych orkiestruje rozwój, utrzymanie i funkcjonowanie gruczołów nadnerczy, regulując dynamikę komórek progenitorowych, zonowanie i aktywność steroidogenną. Wśród nich, SF-1 (Steroidogenic Factor-1, Nr5a1) jest głównym regulatorem niezbędnym do specyfikacji, proliferacji i produkcji hormonów kory nadnerczy10. Sygnalizacja Sonic hedgehog (Shh), aktywna w zG, promuje ekspansję komórek progenitorowych i wspiera odnawianie kory w zG11,12,13.
Sygnalizowanie Wnt, szczególnie przez kanoniczny szlak β-kateniny, jest kluczowe dla zonowania nadnerczy i integralności kory. U myszy, normalna wielkość i zonowanie kory nadnerczy są regulowane przez gradient aktywności sygnałowej WNT, rozciągający się od torebki do zF. Ten gradient jest wspierany przez zlokalizowany wyraz ligandów WNT i potencjalników, głównie WNT4 w zG, oraz WNT2B i R-spondiny (RSPO1 i/lub RSPO3) w torebce7,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Kora nadnerczy jest utrzymywana przez biegunowe przepływ komórek z proliferacyjnych komórek progenitorowych zlokalizowanych w subkapsularnej/zewnętrznej strefie zG, które dają początek zróżnicowanym komórkom zG, które migrują w kierunku zF. Gdy komórki przechodzą z zG do zF, przechodzą zmiany w ekspresji genów i funkcji, określane jako trans-dyferencjacja. Ten model został mocno wsparty przez badania śledzące linię rodową, za pomocą transgennej linii myszy ASCre/+, która specyficznie celowana jest na komórki produkujące aldosteron w zG23,24,25.
W celu badania biologii nadnerczy zastosowano kilka podejść in vitro opartych na dysocjacji całej gruczołu nadnerczy26,27,28. Na przykład, jedno badanie opisuje dysocjację kory nadnerczy w celu przeprowadzenia analiz elektrofizjologicznych i patch-clamp27, a inne badanie zastosowało dysocjowane komórki kory nadnerczy do zbadania mechanizmów sygnałowania związanych z fizjologią nadnerczy i regulacją ciśnienia krwi26. Chociaż te metodologie dostarczyły ważnych wnikliwości funkcjonalnych, opierają się one na komórkach z całych preparatów nadnerczy, a nie na separacji stref kory przed hodowlą komórek.
Biorąc pod uwagę złożoność i różnorodność histologiczną gruczołu nadnerczy, zrozumienie odrębnych ról jego komórkowych przedziałów jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw funkcji nadnerczy. W niniejszym badaniu ustanowiono pierwotne hodowle komórek kory nadnerczy myszy, wzbogacone o komórki zG lub zF. Główną zaletą tej metody jest wytwarzanie wzbogaconych komórek zG hodowlą, umożliwiającą eksperymentalne modyfikowanie ścieżek sygnałowania i czynników środowiskowych, aby lepiej zbadać jego specyficzną rolę w biologii kory nadnerczy. Obejmuje to badanie utrzymania komórek progenitorowych, mechanizmów leżących u podstaw plastyczności strefowej i trans-dyferencjacji w kierunku zF oraz modelowanie składu macierzy zewnątrzkomórkowej. Równolegle ta metoda generuje wysoce wzbogacone hodowle komórek zF, zapewniając

<table><tbody><tr><td>Rozdzielacz stożkowy (50 mL )</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Filtrostrzykawka 0,22 &micro;m</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)</td><td>SLGV033RS</td><td>Filtracja roztworu trawiącego</td></tr><tr><td>10 mL jednorazowa strzykawka</td><td>BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>300912</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>5 mL pipeta serologiczna</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>4487</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>10 mL pipeta serologiczna</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>4488</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki pipet (P200)</td><td>Axygen (Union City, CA, USA)</td><td>TF-200-R-S</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki pipet (P1000)</td><td>Axygen (Union City, CA, USA)</td><td>TF-1000-R-S</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Płytka kulturowa P60</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>430166</td><td>Przeznaczone do hodowania tkanek</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>3527</td><td>Przeznaczone do hodowania tkanek</td></tr><tr><td>Sterylny papier filtrowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Usuwanie tłuszczu i wsparcie w rozcinaniu</td></tr><tr><td>Środek DMEM/F-12</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>11320033</td><td>Formuła 1:1</td></tr><tr><td>Izolowane fetalne surowica bydła (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>10082147</td><td>Inaktywowane termicznie</td></tr><tr><td>Dodatek ITS</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>41400045</td><td>100X</td></tr><tr><td>Dodatek GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (100X)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>15140122</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>17100-017</td><td>Trawienie tkanki</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>DN25-1</td><td>Trawienie tkanki</td></tr><tr><td>Angiotensyny II (Ang II)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>A9525</td><td>Stymulacja hormonalna</td></tr><tr><td>Adrenokortykotropinowy hormon (ACTH)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>A0298</td><td>Stymulacja hormonalna</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>F6886</td><td>Stymulacja cAMP</td></tr><tr><td>Chlorku potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>P9541</td><td>Stymulacja aldosteronem</td></tr><tr><td>Chlorku sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>S7653</td><td>Kontrola pojazdu</td></tr><tr><td>Małe nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>14060-09</td><td>Rozcinanie</td></tr><tr><td>Skalpel z jednorazowym ostrzem</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>10003-12</td><td>Mikrorozcinanie</td></tr><tr><td>Drążki</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>11252-00</td><td>Rozcinanie</td></tr><tr><td>Zaokrąglone drążki</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>11251-10</td><td>Rozcinanie</td></tr><tr><td>Kopułkowy dyfuzor powietrza</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>N/A</td><td>Sterylne przetwarzanie tkanki</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>N/A</td><td>Hodowla komórek</td></tr><tr><td>Centryfuga</td><td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td><td>N/A</td><td>Pelletowanie komórek</td></tr><tr><td>Komora do liczenia Neubauera</td><td>Hausser Scientific (Horsham, PA, USA)</td><td>1490</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>Środek RIPA do lizy i ekstrakcji</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>89901</td><td>Ekstrakcja białka</td></tr><tr><td>Kompleks inhibitorów proteaz Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>87786</td><td>Ekstrakcja białka</td></tr><tr><td>Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>FB120</td><td>Sonizacja</td></tr><tr><td>System RIA</td><td>Tecan (Männedorf, Switzerland)</td><td>MG13051</td><td>Ilościowa analiza hormonów</td></tr><tr><td>Cobra II Auto-Gamma Counter</td><td>Berthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)</td><td>N/A</td><td>Pomiar radioaktywności</td></tr><tr><td>Zestaw ELISA kortykosteronu (96-dołkowy)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>55-CORMS-E01</td><td>Pomiar hormonów</td></tr><tr><td>Środek montujący ProLong Gold Antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>P36930</td><td>Środek montażowy</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne mysie przeciwko Dab2</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>610464</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne kurczaka przeciwko GFP</td><td>Aves Labs (Tigard, OR, USA)</td><td>GFP-1020</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne królicze przeciwko RFP</td><td>Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)</td><td>600-401-379</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594 kozła przeciwko myszy</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-11005</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594 kozła przeciwko kurczakowi</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-11042</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 647 kozła przeciwko królikowi</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-21244</td><td>Przeciwciało

ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Establishment of Zone-Enriched Primary Cultures from the Mouse Adrenal Cortex

Gruczoł nadnerczy myszy jest otoczona warstwą komórek mezenchymalnych (kapsułą) i zawiera leżącą w głębi korę zorganizowaną w wyraźne strefę skoncentryczne o specjalistycznych funkcjach endokrynny: strefę ziarnistą (zG), która wytwarza aldosteron i strefę pręcikowatą (zF), która wytwarza kortikosteron. Nawa nadnerczy, znajdująca się w centrum gruczołu, wytwarza katecholaminy. Badania mechanizmu działania komórek z każdej strefy kory nadnerczy były ograniczone przez brak in vitro modeli, które zachowują ich strefowo-specyficzne cechy molekularne, komórkowe i funkcjonalne. Aby przezwyciężyć tę ograniczenie, opracowano podejście do frakcjonowania z wykorzystaniem mikrosekcji dorosłych gruczołów nadnerczy myszy. Metoda ta oddziela komórki nadnerczy od samców myszy na zewnętrzną frakcję wzbogaconą o zG (OF), zawierającą komórki kapsułki i zG oraz wewnętrzną frakcję wzbogaconą o zF (IF), która zawiera komórki zF i nadnerczy. Te frakcje zostały wykorzystane do wygenerowania dwuwymiarowych (2D) pierwotnych kultur wzbogaconych o komórki zG lub zF. Analiza ekspresji genów potwierdziła, że kultury wzbogacone o zG wykazują wysokie poziomy markerów zG (Cyp11b2, Dab2 i Shh), wraz ze zwiększoną liczbą markerów szlaku Wnt/β-kateniny (Wnt4, Lef1). W przeciwieństwie do tego, kultury wzbogacone o zF wykazywały wyższą ekspresję markerów zF (Cyp11b1 i Akr1b7) i niższe poziomy markerów szlaku Wnt/β-kateniny, zgodnie ze strefowym podpisem transkrypcyjnym zF. Ekspresja markerów steroidogenicznych (Nr5a1, Star) potwierdziła nadnerczowe pochodzenie obu frakcji komórek. Hydroksylaza tyrozyny wskazuje na obecność komórek nadnerczy w kulturach wzbogaconych o zF. Funkcjonalnie, kultury wzbogacone o zG wytwarzały aldosteron w warunkach podstawowych i wykazywały zwiększoną produkcję w odpowiedzi na angiotensynę II, potas i hormon aktywujący komórki wytwarzające kortykotropinę (ACTH). Z kolei kultury wzbogacone o zF wytwarzały kortikosteron w warunkach podstawowych i wykazywały zwiększone wydzielanie w odpowiedzi na stymulację ACTH. Ogólnie, ten protokół reprezentuje niezawodny, powtarzalny i biologicznie istotny model in vitro do badania biologii kory nadnerczy. System ten umożliwia strefowo-specyficzne badanie szlaków sygnałowych, mechanizmów molekularnych i reakcji fizjologicznych.

Ustanowienie i charakterystyka strefowo wzbogaconych kultur pierwotnych komórek nadnerczy 
Pierwotne kultury komórek nadnerczy zostały pomyślnie ustalone z OF, wzbogacone o komórki zG, oraz z IF, wzbogacone o komórki zF. Przedstawiające obrazy kulturalnych komórek przedstawiono na Rysunku 2A (OF-zG) i Rysunku 2B (IF-zF). Aby ocenić wzbogacenie komórek zG i nie-zG w tych kulturach, wykorzystano model myszy AS<...

Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

The mouse adrenal gland is encapsulated by a mesenchymal cell layer (capsule) and contains an underlying cortex organized into distinct concentric zones ...

Moje badania dotyczyły regulacji mikrośrodowiska nadnerczy, koncentrując się na sygnałowaniu ACM i Wnt w różnicowaniu strefy ziarnistej i prążkowanej oraz rozwoju guzów. Istniejące metody nie pozwalają wyraźnie odróżnić stref nadnerczy. Ten protokół wzbogaca ZG i ZF, umożliwiając badanie różnych typów komórek.Ten protokół można zastosować do badania adrenofizjologii w ZG i ZF, w tym zonizacji i różnicowania komórek. Aby odizolować gruczoł nadnerczy do strefy wzbogaconej w kulturę pierwotną, użyj 10 do 15 młodych dorosłych myszy, w wieku około sześciu do siedmiu tygodni. Po uśmierceniu myszy ułóż ją w pozycji leżącej na plecach na sterylnej płaskiej powierzchni i wyczyść futro zwierzęcia 70%alkoholem.Za pomocą nożyczek wykonaj początkowy nacięcie w okolicy pachwinowej brzucha. Przedłuż nacięcie w kierunku bocznym w stronę klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić otrzewną. Ostrożnie odstąp skórę.Następnie delikatnie cofnij mięśnie brzucha, aby odsłonić jamę, unikając uszkodzenia naczyń krwionośnych, aby zachować jasne widzenie gruczołów nadnerczy. Zmień narzędzia chirurgiczne, aby zminimalizować zakażenie drobnoustrojami. Zidentyfikuj lewy gruczoł nadnerczy zlokalizowany medialnie i powyżej lewej nerki w otrzewnej o owalnym kształcie i różowym zabarwieniu otoczonym białym tkanką tłuszczową.Za pomocą tępych kleszczy ostrożnie przesuń sąsiednie narządy, aby poprawić widoczność gruczołu nadnerczy. Za pomocą nożyczek usuń większość otaczającej tkanki tłuszczowej krótkimi kontrolowanymi cięciami, aby odizolować gruczoł nadnerczy. Unikaj bezpośredniego chwytania gruczołu nadnerczy, aby zapobiec uszkodzeniu jego torebki.Natychmiast umieść odizolowany gruczoł nadnerczy w naczyniu hodowlanym P60 zawierającym 10 mililitrów podgrzanego pojemnika DMEM F-12, aż wszystkie próbki zostaną zebrane. Następnie zidentyfikuj prawą gruczoł nadnerczy zlokalizowaną bocznie i powyżej prawej nerki w otrzewnej, zauważając, że jego bliskość wątroby, wznoszącej się części okrężnicy i pobliskich naczyń krwionośnych może utrudniać wizualizacje. Ostrożnie manipuluj żyłami nerkowymi i tętnicami nerkowymi, aby uniknąć przypadkowych cięć i krwawień.Po odizolowaniu prawego gruczołu nadnerczy, używając tej samej procedury co dla lewego gruczołu nadnerczy, umieść obie gruczoły razem w tej samej misce. Wytrzyj naczynie hodowlane 70%alkoholem przed przeniesieniem gruczołów do wyciągu laminarnego. Następnie przemyj gruczoły nadnerczy trzykrotnie, sekwencyjnie przenosząc je przez naczynia zawierające PBS w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Po ostatnim płukaniu zebrane i utrzymane tkanki w czwartym naczyniu zawierającym podgrzanym DMEM, aby zachować żywotność podczas przygotowania wielu gruczołów. Przenieś gruczoły nadnerczy na papier filtrujący do dysekcji. Następnie, za pomocą drobnych kleszczy, chwytaj gruczoł nadnerczy za przylegającą tkankę tłuszczową.Ostrożnie przeprowadź dysekcję tłuszczu na papierze filtrującym za pomocą kontrolowanych ruchów, aby uniknąć uszkodzenia torebki. Upewnij się, że gruczoł jest gładki i nienarużony, oraz wolny od nadmiaru tkanki tłuszczowej i łącznej. Ostrożnie przenieś gruczoły nadnerczy na świeży papier filtrujący, aby ułatwić precyzyjną dysekcję mikro.Za pomocą drobnych kleszczy delikatnie ściśnij torebkę gruczołu nadnerczy. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie promieniowe w gruczołach bez całkowitego przecięcia tkanki. Wywierz lekką siłę mechaniczną, aby wypchnąć zawartość kory na zewnątrz przez nacięcie.Wystaw materiał wewnętrzny gruczołu, zachowując połączenie torebki i strefy ziarnistej z końcówką kleszczy. Zidentyfikuj wypchnięty wewnętrzny materiał gruczołowy jako strefę prążkowaną i miąższ. Rozpocznij trawienie enzymatyczne dopiero po przetworzeniu wszystkich gruczołów, aby zapewnić odpowiednie mechaniczne rozdzielenie stref zewnętrznych i wewnętrznych.Po wyśrodkowaniu zawieś zebrane komórki w pojemniku hodowli. Po utworzeniu hodowli komórek nadnerczy wykonaj charakteryzację molekularną hodowanych komórek za pomocą analizy ekspresji genów i barwienia immunologicznego. Pierwotne hodowle komórek nadnerczy zostały pomyślnie utworzono z zewnętrznej frakcji wzbogaconej w komórki strefy ziarnistej i wewnętrznej frakcji wzbogaconej w komórki strefy prążkowanej.Model myszy do śledzenia pochodzenia umożliwił wizualizacje specyficznej dla strefy ziarnistej ekspresji mGFP napędzanej przez promotor Cyp11b2. Ekspresja mGFP była przeważnie obserwowana w hodowlach wzbogaconych w strefę ziarnistówkę, podczas gdy hodowle wzbogacone w strefę prążkowaną wykazywały przede wszystkim ekspresję mTomato. Wyższe poziomy ekspresji względnej Cyp11b2, Dab2 i Sonic hedgehog były obserwowane w hodowlach zewnętrznej frakcji w porównaniu z hodowlami wewnętrznej

establishment-zone-enriched-primary-cultures-from-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Systemy hodowli komórek chromafinowych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z wydzielaniem w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wykorzystywaną do wycięcia nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinowych.

Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy metodę izolowania nadnerczy od myszy, naprawiania tkanek, dzielenia ich na sekcje i przeprowadzania barwienia immunofluorescencyjnego.

Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Naucz się izolować i hodować komórki z wzbogaconych stref kory nadnerczy myszy. Ta metoda umożliwia badanie specyficznej fizjologii zG i zF oraz produkcji hormonów in vitro.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Przeglądaj więcej filmów