ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NEB dziękuje Andrew Tomlinsonowi za podzielenie się metodą oraz Lucy Firth za udoskonalenia. Dziękujemy Abhishekowi Bhattacharyi za przedstawienie Rysunku 5A. Dziękujemy Joynerowi Cruzowi, Jonathanowi Gonzalezowi, Chelsea Nguyen i Jensenowi Northrupowi. Badania w laboratorium autorów są finansowane z grantów NIH (GM120451 i CA284362). Rysunek 2 i 4 zostały stworzone za pomocą Biorender.

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Tworzenie narzędzia transferowego
<ol>
	<li>Użyj szczypiec, aby wyciąć ~2,5 cm drutu wolframowego o średnicy 0,005". Użyj kleszczy, aby uformować jeden koniec drutu w haczyk lub pętlę (Rysunek 3). Włóż drugi koniec do uchwytu na igły. Będzie on używany do przenoszenia dysków z minimalnym lub żadnym transferem cieczy. Pętla może być łatwiejsza w użyciu, ale haczyk przenosi mniej płynu między roztworami.</li>
</ol>
2. Rozcinanie i utrzymywanie dysków wyobrażenia z czułami ocznymi
<ol>
	<li>Larwy płucz ~7,5 mL buforem fosforanu sodu (pH7,2) w szalce Petriego (średnica 60 mm), aby usunąć wszelkie materiały muchowe lub inne zanieczyszczenia. Zobacz krok 6, gdzie można znaleźć rozbiórkę dysków wyimaginowanych skrzydeł, a nie dysków z czułkami oczu. Oba te dyski wyimaginowane znajdują się w przedniej części ciała (Rysunek 4). UWAGA: PBS może być również stosowany zamiast buforu fosforanowego w krokach 2.1–2.3.</li>
	<li>Przenieś larwy do szalki Petriego zawierającej świeży bufor. UWAGA: Niektórzy pracownicy wolą rozcinać pojedyncze larwy w pojedynczych kapkach buforowych w szalce Petriego o średnicy 60 mm; Inni używają preparatów typu depression well.</li>
	<li>Podczas obserwacji pod mikroskopem rozcinającym, trzymaj larwy ~50% długości ciała za pomocą kleszczy. Użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i pociągnąć. Tarcze z czułami ocznymi wychodzą przyczepione do części ustnych. Mózg może również pozostać przymocowany do dysków ocznych.</li>
	<li>Użyj narzędzia drutowego, aby przenieść rozciętą tkankę do małej szalki Petriego (średnica 35 mm) zawierającej ~3 mL utrwalacza, np. 3,7% formatywu formaldehydu w buforze fosforanu sodu 0,1 M (pH7,2), powstałej przez rozcieńczenie 37% roztworu bulwaru formowanego przez 37% formę formaldehydu. UWAGA: Przestrzegaj lokalnie zatwierdzonych procedur bezpieczeństwa w zakresie obsługi formaldehydu. 3,7% formatyw formatywny to prosty utrwalający środek, który będzie satysfakcjonujący w wielu przypadkach, ale inne utrwalacze mogą być optymalne dla niektórych antygenów. PBS lub PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) może być używany jako bufor utrwalający zamiast 0,1 M fosforanu sodu, a roztwór formaldehydu można uzyskać przez rozpuszczenie stałego paradehydu, zamiast z koncentrowanego roztworu zapasowego. Utrwalacz paraformaldehyd-lizynoperiodian (PLP) łączy łagodniejsze wiązanie białek z sieciowaniem węglowodanowym i lepiej zachowuje struktury błonowe12. Na przykład glikoproteina Drosophila Scabrous pozostaje antygenowa po wiązaniu PLP, ale nie po utrwaleniu formaldehydu. Przygotuj PLP świeżo w następujący sposób: (1) Dodaj 2 g proszku paraformaldehydu do 25 mL wody dejonizowanej w stożkowej kolbie w okapie i mieszaj na niskim ogniu; (2) Zanurz pipetę w 50% roztworze wodorotlenku sodu i przelej do mieszanki śladową ilość płynu (znacznie mniej niż jedną kroplę). Paraformaldehyd powinien rozpuścić się w ciągu kilku minut, bez wrypnięcia roztworu. Podczas chłodzenia roztworu 8% roztworu formaldehydu rozpuścić 0,36 g lizyny w 10 mL wodzie dejonizowanej, 7,5 mL 0,1 M fosforanu sodu pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO4 i trzymać na lodzie. Wymieszaj 15 mL tego zimnego buforowanego roztworu lizyny z 5 ml świeżego 8% formaldehydu i 50 mg periodianu sodu w probówce z nakrętką 50 mL, wymieszaj przez wirowanie i użyj jako świeży.</li>
	<li>Po 15–20 minutach w temperaturze pokojowej przenieś rozciętą tkankę do kolejnej szalki Petriego zawierającej 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 7,2). UWAGA: PBS może być również stosowany zamiast buforu fosforanowego. Utrwalanie na lodzie może być preferowane dla niektórych antygenów lub gdy chce się obrazować endogenną fluorescencję GFP lub RFP wyrażaną w tkance. Fiksacja PLP zawsze trwa 45 minut na lodzie.</li>
</ol>
3. Blokowanie i inkubacja z pierwotnym przeciwciałem
<ol>
	<li>Przenieś tkankę do 35 mm szalki Petriego zawierającej ~3 mL buforu do płukania przeciwciał NSG w celu blokowania. Inkubuj szalkę Petriego na lodzie przez co najmniej 15 minut. NSG to 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 7,2), 0,1% saponiny, 5% normalnej surowicy koziej. Zapasy buforowe do mycia są przechowywane w filtrach sterylizowanych w temperaturze 4 °C. UWAGA: Różne bufory płukania mogą być optymalne dla konkretnych przeciwciał. Na przykład, podczas gdy saponina jest łagodnym, niejonowym detergentem, który szczególnie rozpuszcza błonę plazmatyczną, inne detergenty mogą być preferowane do wykrywania antygenów w jądrze. Dodatkowym przykładem jest przeciwciało opracowane przeciwko jądrowemu białku atonalnemu przez Jarmana i in.13 najbardziej immunoreaktywne w buforach zawierających NP40 jako detergent. Zobacz Tabelę Materiałów , aby poznać przepisy na alternatywne bufory płukania: PDT, PBT lub NSG. Przy użyciu normalnego serum jako białka blokującego idealnie powinno ono pochodzić z gatunku, w którym powstaje przeciwciało wtórne, np. z normalnej surowicy kozi, jeśli ma się stosować przeciwciała wtórne dla koz, lub z normalnej surowicy osła, jeśli ma być stosowane przeciwciała wtórne dla osła. W praktyce nie ma to większego znaczenia.</li>
	<li>Podczas blokowania usuń niepożądane tkanki z dysków wyimaginowanych pociatłów ocznych za pomocą cienkich kleszczy, z wyjątkiem haczyków na usta. Na razie zostaw aparaty ustne przymocowane, żeby ułatwić przenoszenie. UWAGA: Tkanka obca, np. mózg, również może być pozostawiona do montażu szkiełka (krok 5.4), o ile nie przeszkadza to w barwieniu lub widoczności.</li>
	<li>Podczas blokowania przygotuj rozcieńczenie 1:100 roztworu przeciwciał mAb40-1a w NSG, np. 1 μL przeciwciał w 100 μL NSG. Mieszaj przez pipetowanie, nie przez wirowanie. UWAGA: mAb40-1a to przeciwciało monoklonalne podwyższone przeciwko beta-galaktozydazie. Optymalne rozcieńczenie przeciwciał i bufor płukania różnią się w zależności od zastosowanych przeciwciał.</li>
	<li>Do każdej z maksymalnie sześciu dołków w pierwszej kolumnie mikrodołków z 60 dołkami należy dodać roztwory przeciwciał 13 μL. Stożkowe mikrootwory z prostymi bokami są ważne dla przejrzystości optycznej. Jeśli potrzebne jest więcej niż sześć dołków, zacznij drugą minitackę.</li>
	<li>Przenieś dyski wyimaginowane z okiem i czułkami, najlepiej nadal przyczepione do aparatów ustnych, do pierwotnego roztworu przeciwciał pojedynczo za pomocą pętli drutu lub haczyka. UWAGA: Liczba dysków wyimaginowanych, które można dodać do każdej dołki, zależy od przeciwciała. Zbyt duża ilość tkanek może wyczerpać niektóre przeciwciała do tego stopnia, że etykietowanie się zmniejsza. 5 par na studnię zwykle wystarcza. W ten sposób ~60 dysków można łatwo oznaczyć za pomocą 6 rzędów mikromiarek z 60 dołkami. Dla każdego rzędu można stosować różne przeciwciała. Czy roztwory przeciwciał można ponownie użyć, wymaga badań empirycznych dla każdego przypadku; To nie jest rutyna w naszym laboratorium.</li>
	<li>Zamknij płytę z pokrywką i zabezpiecz parafilmem, aby ograniczyć parowanie. Inkubuj na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 4 godziny do nocy. Kołysanie nie jest konieczne. UWAGA: Optymalny czas i temperatura inkubacji przeciwciał zależą od przeciwciała. W wielu przypadkach wystarczy 1–2 godziny w temperaturze pokojowej, ale niektóre przeciwciała dają lepsze wyniki po inkubacji w 4 °C, a inkubacja w 4 °C często bywa wygodna w nocy. W bardzo nielicznych przypadkach optymalne mogą być inkubacje pierwotnych przeciwciał trwające 2–3 dni. Zamknięcie pokrywki mikrodołka jest konieczne tylko podczas inkubacji dłuższej niż ~4 godziny.</li>
</ol>
4. Mycie i inkubacja z przeciwciałami wtórnymi
<ol>
	<li>Po każdej studni przeciwciała należy dodać 13 μL buforu NSG do kolejnych trzech kolumn dołków, ponieważ próbki będą płukane trzykrotnie. Przekładaj próbki na 5 minut do każdego dołka kolejno.</li>
	<li>Podczas mycia przygotuj rozcieńczenie 1:200–400 fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał wtórnych w buforze NSG, np. 0,5 μL przeciwciała w 100 μL NSG. Mieszaj przez pipetowanie, nie przez wirowanie. Wiruj roztwór zapasowy przeciwciał wtórnych przez 60 sekund (z maksymalną prędkością) przed rozcieńczeniem, ponieważ agregaty przeciwciał mogą niespecyficznie wiązać się z powierzchnią tkanki. UWAGA: Optymalne rozcieńczenie przeciwciał wtórnych może się różnić w zależności od producenta. Dostępne są przeciwciała sprzężone z Alexą lub cyjaniną po odejmowaniu dla innych gatunków, aby ułatwić wielokrotne znakowanie.</li>
	<li>Dodaj 13 μL roztworu przeciwciał wtórnych do następnej (5-tej) kolumny studni.</li>
	<li>Przenieś próbki do przeciwciała wtórnego za pomocą pętelki lub haczyka. </li>
	<li>Zamknij płytę z pokrywką i zabezpiecz parafilmem, aby ograniczyć parowanie. Inkubuj na lodzie przez 4 godziny przez noc. UWAGA: Optymalny czas i temperatura inkubacji przeciwciał zależą od przeciwciała. W wielu przypadkach wystarczy 1–2 godziny w temperaturze pokojowej, ale niektóre przeciwciała dają lepsze wyniki po inkubacji w 4 °C, a inkubacja w 4 °C często bywa wygodna w nocy. Zamknięcie pokrywki mikrodołka jest konieczne tylko podczas inkubacji dłuższej niż ~4 godziny.</li>
</ol>
5. Mycie i montaż tkanek do mikroskopii
<ol>
	<li>Przygotuj kolejne trzy kolumny dołków po wtórnym odwiercie przeciwciał z 13 μL NSG. Przekładaj próbki przez każdy dołek przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieś próbki do końcowego płukania w 9. odwiercie, używając 13 μL buforu fosforanu sodu 0,1M (pH 7,2). To płukanie buforowe jest konieczne, gdy bufory płukania zawierają składniki wytrącające się w medium montażowym.</li>
	<li>. Dodaj 13 μL medium montażowego do ostatniej (10.) kolumny odwiertów. Nośnik montażowy powstaje poprzez rozpuszczenie 2% n-propylowego galianu w 75% glicerolu oraz 25% 0,1 M buforu fosforanu sodu, pH 7,2. Przygotowuj świeże medium montażowe co tydzień, mieszając komponenty na obrotowej platformie. Pozwól, by pęcherzyki powietrza się rozwieźły przed użyciem. UWAGA: Materiały montażowe są również dostępne komercyjnie.</li>
	<li>Pipeta 20 μL nośnika montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym. Przenieś próbki do medium na szkiełku. To ostatnia okazja do usunięcia niechcianej tkanki. Z dysków czulankowych należy usunąć narządy gębowe skórkowe.</li>
	<li>Aby ułożyć próbki tak, aby nie dryfowały podczas nakładania szkła okrywowego, użyj narzędzia drutowego do wyciągania próbek z głównego dropu montażu. Delikatnie opuszczaj czyste szkło osłonowe o grubości #1,5 o wymiarach 22 mm x 40 mm na prowokację za pomocą kleszczy, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pozwól slajdom stać na godzinę w kartonowym uchwycie, aby materiał montażowy się osadł. Unikaj poruszania szkiełek, ponieważ delikatne próbki mogą ulec uszkodzeniu, jeśli przesuwa się szkło osłonowe.</li>
	<li>Gdy szkło okładkowe się osadzi, zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Nie ruszaj ani nie naciskaj na szybę pokrywy podczas tego procesu. Pozwól lakierowi do paznokci wyschnąć co najmniej godzinę przed obrazowaniem. UWAGA: Niestety, większość kosmetycznych lakierów do paznokci obecnie używa rozpuszczalników, które nie rozprowadzają się równomiernie na szkiełkach i nie są użyteczne, dlatego należy uzyskać naukowy lakier do paznokci.</li>
	<li>Szkiełka przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki zazwyczaj można fotografować i ponownie obrazować przez kilka miesięcy. UWAGA: Preparaty można również przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Rozkładanie i naprawianie dysków wyimaginowanych skrzydeł
<ol>
	<li>Aby rozłożyć dyski wyimaginowane skrzydłowe zamiast dysków wyobrażonych z antenami ocznymi, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami zamiast kroków 2.3–2.5 powyżej.</li>
	<li>Pod mikroskopem rozcinającym chwyć larwalne nastroje gębowe drobnymi kleszczemi. Za pomocą nożyczek do mikrosekcji przeciąć larwy na pół 30%–40% długości od przedniej części ciała.</li>
	<li>Odwróć przednią część larwy, rozkładając otwarty, przecięty koniec larwy za pomocą drugiej pary kleszczy i przepychając przez nią głowę oraz aparaty gębowe, podobnie jak odwracając skarpetkę</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przenieść odwrócone larwy przednie do utrwalacza do małej szalki Petriego (średnica 35 mm) zawierającej ~2,5 mL utrwalacza, np. 3,7% formalnego dehydu w buforze fosforanu sodu o pojemności 0,1 M (pH 7,2), powstałego przez rozcieńczenie 37% roztworu bulwaru formowanego formaldehydem w PBS. UWAGA: W razie potrzeby odwrócone tusze można przenieść do 400 μL utrwalacza w rurce mikrofuge, co ułatwia fiksację w okapie oparowym. Te same opcje fiksacyjne dostępne dla fiksacji dysku oczno-wyobrażonego dotyczą także fiksacji tarczy skrzydeł (patrz UWAGA na kroku 2.4). Optymalne fiksowanie i oznaczanie dysków wyobrażeniowych z okiem i czułami zwykle jest takie samo dla dysków skrzydeł.</li>
	<li>Po 15–20 minutach w temperaturze pokojowej przenieś rozciętą tkankę do kolejnej szalki Petriego zawierającej 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 7,2). UWAGA: Te same opcje bufora płukania dostępne dla fiksacji dysku oczno-wyobrażonego dotyczą także fiksacji tarczy skrzydłowej (patrz UWAGA w kroku 2.4). Optymalny bufor do oznaczania dysków wyobrażonych z okiem i czułami zwykle jest taki sam dla dysków skrzydeł.</li>
	<li>Usuń tarcze skrzydeł z larw za pomocą cienkich kleszczy. Jeśli nadal są obecne, mniejszy dysk haltere i tarcza na nodze można albo teraz zdjąć, albo pozostać przymocowane do tarcz skrzydeł, aby ułatwić przenoszenie. UWAGA: Tarcze skrzydłowe mogą nie być łatwo widoczne w tuszce, dopóki nie zostanie usunięte ciało tłuszczowe lub inna tkanka (zawsze przed jej usunięciem należy zidentyfikować tkankę). Dyski skrzydłowe są największymi dyskami wyimaginowanymi i są przyczepione do ściany ciała, ściśle powiązanej z tchawicą. Mają kształt łzy, podobny do zarysu South America1 (Rysunek 4).</li>
	<li>Kontynuuj kroki 3–5 jak powyżej.</li>
</ol>

<ol><li>Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , CSHL Press. 747-841 (1993).</li>
<li>Tripathi, B. K., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The wing imaginal disc.</a> Genetics. 220 (4), iyac020(2022).</li>
<li>Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Eye development.</a> Methods. 68 (1), 252-259 (2014).</li>
<li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li>
<li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li>
<li>Held, L. I. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LIJ+%22Imaginal+discs%3A+The+genetic+and+cellular+logic+of+pattern+formation%22">Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation</a>. , Cambridge University Press. (2002).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).</li>
<li>Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. 
 <a target="_blank" href="https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak">https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak</a> (1990).</li>
<li>Rubin lab manual. , The Rubin Lab. 
 <a target="_blank" href="https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page">https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page</a> (1990).</li>
<li>Mitchison, T. J., Sedat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigenic+determinants+in+whole+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos.</a> Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+protocols%22">Drosophila protocols</a>. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mclean, I. W., Nakane, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodate-lysine-paraform-aldehyde+fixative+a+new+fixative+for+immunoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).</li>
<li>Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal+is+the+proneural+gene+for+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 369, 398-400 (1994).</li>
<li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-dye%3A+A+combinatorial+marking+system+to+visualize+and+genetically+manipulate+clones+during+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster.</a> Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).</li>
<li>Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+c%2Febp+class+bzip+proteins+in+the+growth+and+cell+competition+of+rp+%28%27minute%27%29+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila.</a> Elife. 9, e50535(2020).</li>
<li>Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+notch+signalling+pathway+is+required+for+enhancer+of+split+bhlh+protein+expression+during+neurogenesis+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo.</a> Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).</li>
<li>Kiparaki, M., Baker, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+assessing+translation+in+living+Drosophila+imaginal+discs+by+o-propargyl-puromycin+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).</li>
<li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (91), e51792(2014).</li>
<li>Yan, S. J., Li, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larval+imaginal+discs+to+study+low-dose+radiation-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest.</a> Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+of+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling of imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).</li>
<li>Phalle Bde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+whole-mount+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of whole-mount imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).</li>
<li>Morimoto, K., Tamori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diagnosis+of+tumors+in+Drosophila+imaginal+disc+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia.</a> J Vis Exp. (125), e55901(2017).</li>
<li>Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+NL+%22Confocal+microscopy+methods+and+protocols.+Methods+in+molecular+biology%22">Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology</a>. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Barwienie przeciwciał tkanek Drosophila za pomocą 60-dołkowych płytek stożkowych metodą Tomlinsona i Ready'ego daje doskonałe wyniki i jest bardzo niezawodne, ponieważ każdy dysk wyimaginowany jest śledzony pod mikroskopem rozcinającym podczas każdej manipulacji. Metoda wymaga jedynie niewielkich ilości odczynników przeciwciał i z każdym krokiem wymienia roztwory bardziej kompleksowo, ponieważ próbki są przekazywane z bardzo niewielką ilością towarzyszącej cieczy. Jest szczególnie odpowiedni do obsługi niewielki...

Dyski wyimaginowane u Drosophila to tkanki progenitorowe, które są odstawiane podczas embriogenezy i rosną w larwie bez różnicowania się, przyczyniając się do struktur naskórka dorosłych w stadiumpoczwarki 1. Ich badania dostarczyły wielu wglądów w mechanizmy wzorcowania rozwojowego, przy czym dyski wyimaginowane oczu i skrzydeł zostały szczególnie dobrze zbadane 2,3,4,5,6. Immunohistochemia jest szczególnie przydatna do badania przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów w dyskach wyobrażonych, a także do charakteryzowania zachowań komórek, w tym podziału komórkowego i śmierci komórkowej.
Aby ułatwić dodatkowe wymagania mikroskopowej analizy elektronowej dysków ocznych znakowanych przeciwciałami, Tomlinson i Ready opracowali protokół na małą skalę, który jest szczególnie ekonomiczny pod względem odczynników i zapewnia bardzo wysoki poziom niezawodności oraz możliwości personalizacji7. Ich metoda jest opisana w wersji drukowanej, ale nie ma dostępnych materiałów wideo 3,8,9. Metoda ta jest łatwo modyfikowana do oznaczania innych dysków wyobrażających (lub innych tkanek) i może być stosowana do dysków wyobrażających skrzydeł, oprócz dysków wyobrażających się z czułami oczu.
Oznaczanie przeciwciał w dyskach wyimaginowanych Drosophila podąża za ogólnym zarysem obowiązującym dla dowolnej tkanki10 (Rysunek 1). Tkanka musi zostać rozczłonkowana i utrwalona przed inkubacją za pomocą przeciwciał specyficznych dla interesujących białek. Po wypłukaniu niewiązanego przeciwciała dodaje się oznakowane (często fluorescencyjne) przeciwciało wtórne, które wiąże się z pierwotnym przeciwciałem, które samo jest związane z interesującym białkiem w tkance unieruchomionej. Po umyciu w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał wtórnych, tkanka może być zamontowana do mikroskopowego badania i zobrazować interesujące białka. Dostępnych jest wiele ogólnych opisów tego procesu, które można zastosować do dysków wyobrażonych i innych tkanek Drosophila 11. Tutaj przewidziano protokół dla metody Tomlinsona & Ready'ego, w którym próbki tkanek są przekazywane indywidualnie między małymi dołkami inkubacyjnymi na mikrodołce i obserwowane przez mikroskop stereo na każdym etapie (rysunek 2). To podejście najlepiej sprawdza się przy barwieniu mniejszej liczby tkanek naraz (dziesiątek próbek) i nie jest idealne dla dużych partii (czyli setek). To podejście wymaga jedynie małych objętości roztworu po 13 μL w każdej dołku, dlatego można je wykonać przy bardzo małej ilości przeciwciał. Ponieważ utrata tkanek jest minimalna, nie ma minimalnej wielkości próbki, a nawet pojedyncze dyski wyimaginacyjne mogą być niezawodnie przetwarzane.

<table><tbody><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher</td><td>7558-79-4</td><td>Na2HPO4 – fosforan sodu dwubazowy bezwodnisty. Można stosować inne stany hydratacji, ale zmieniają masę cząsteczkową</td></tr><tr><td>Kleszcze: Kleszcze Dumont #5 Biologie</td><td>Narzędzia do nauki wysokiej klasy</td><td>11252-20</td><td>Styl: #5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Kształt końcówki: prosty</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Długość: 11 cm</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sejf autoklawu: Tak</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Wskazówki: Biologia</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Wymiary końcówki:</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Stop / Materiał: Inox</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>Klasa biologii molekularnej, 37% Formaldehyd. 500ml</td></tr><tr><td>Utrwalacz formaldehydu</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>3,7% formaldehydu w 0,1M buforze fosforanu sodu pH7.2 uzyskanym przez rozcieńczenie z 37% materiału.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna, 98%</td><td>Termonaukowe</td><td>J62225.22</td><td></td></tr><tr><td>mAb40-1</td><td>DHSB</td><td>40-1a-s</td><td>Antybeta-galaktozydaza</td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5520</td><td>Probówki 1,5 mL do przechowywania próbek.</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikroprzecięcia</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>15003-08</td><td>Krawędź tnąca 5 mm, prosta końcówka, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher</td><td>7558-80-7</td><td>NaH2PO4 – fosforan sodu Jednozasadowy bezwodnisty. Jeśli używasz nawadnionej formy, waga potrzebna do przygotowania roztworu 0,1M zmienia się.</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td></td><td></td><td>75% roztwór glicerolu w 0,1M buforze fosforanu sodu pH7,2 z 2,5% n-propylowym galianem. Mieszaj przez inwersję, aby zminimalizować ilość bąbelków.</td></tr><tr><td>NSG</td><td></td><td></td><td>0,1M buforu fosforanu sodu pH7,2, 0,1% saponiny, 5% NGS</td></tr><tr><td>N-propylowy galan</td><td>MP Biomedicals</td><td>210274780</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Ted Pella, zakupiony od Fishera</td><td>NC0381432</td><td>Do zamków uszczelniających</td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Fisher</td><td>NC0099380</td><td>Do mikrosekcji igieł. Pusta stal nierdzewna; Długość rękojeści: 4 3/4" długości</td></tr><tr><td>MiniTacy mikrowłaści Nunc</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565155</td><td>MicroWell MiniTaca do zastosowań serologicznych. Liczba studni 60</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>StatLab</td><td>PM996</td><td>StatLab ParaFilm M Samouszczelniająca się folia elastyczna</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00380-250</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td>Przygotuj 800 ml wody destylowanej w odpowiednim pojemniku.</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Dodaj do roztworu 1,37 M chlorku sodu.</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodaj do roztworu 26,8 mM chlorku potasu.</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodaj do roztworu 101 mM dwubazowego fosforanu sodu.</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodaj do roztworu 18,0 mM monozasadowego fosforanu potasu.</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dostosuj roztwór do pożądanego pH (zazwyczaj pH i asymp; 7,4).</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodawaj wodę destylowaną, aż objętość wyniesie 1 L.</td></tr><tr><td>PBT</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td>0,1M buforu fosforanu sodu pH7,2, 0,1% surowicowej albuminy bydłego oraz 0,2% Triton X-100.</td></tr><tr><td>PDT</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td>0,1M buforu fosforanu sodu (pH = 7,2), 0,3% deoksycholatu oraz 0,3% trytonu x-100</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>Corning 351007</td><td>Szalka Petriego; 60mm; Nieleczone</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>Corning 351008</td><td>Szalka Petriego; 35mm; Nieleczone</td></tr><tr><td>Szczypce</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLP</td><td>Nie ma</td><td></td><td>2% paradehydu 1,35% lizyny w buforze 0,05M fosforanu sodu pH7,2</td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-151</td><td>0,5mg Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.</td></tr><tr><td>Pokrywy slajdów</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Szkło pokrywowe VWR #1.5 22x40 (OBUDOWA)</td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Fisher</td><td>125442</td><td>Szkła Fishera 10bx/CS</td></tr><tr><td>Deoksycholatan sodu</td><td>Thermo Fisher Sci</td><td>89904</td><td>detergent z deoksycholatem sodu; 5mg</td></tr><tr><td>Periodian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71859-25G</td><td>Periodian sodu &ndash; 25 gramów</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu sodu</td><td></td><td></td><td>0,1M bufora NaPO4 pH 7,2. Wymieszaj 28 ml 0,1 mln ilości monosodu (11,998 g NaH2PO4 na 1 litr wody destylowanej) z 72 ml 0,1 mln dowolnego zapasu fosforanów dissodowych (14,196 g Na2HPO4 do 1 litra wody destylowanej), aby uzyskać 100 ml buforu 0,1 m NaPO4. Alternatywnie można użyć PBS.</td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Ted Pella</td><td>27-11</td><td>0,005" Dia.</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Fisher Sci</td><td>A16046AE</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>Preferencje użytkownika</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych drosophila melanogaster

Small Scale Dissection and Antibody Staining of Eye-Antennal and Wing Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dyski wyimaginowane Drosophila od dawna są badane jako modele rozwoju, wzorowania i regeneracji nabłonka. Znakowanie przeciwciał i obrazowanie rozciętych dysków wyobrażających jest ważne dla wizualizacji wzorców ekspresji białek jako markerów procesów rozwojowych i fizjologicznych. Ta metoda wyimaginowanego rozcinania i znakowania dysków została pierwotnie opracowana do mikroskopii immunoelektronowej dysków wyimaginowanych ocz-czuł przez Tomlinsona i Ready'ego. Stosując płytki z 60 mikrodołkami oraz poprzez przenoszenie tkanek między roztworami zamiast przenoszenia, możliwa jest indywidualna analiza próbek tkanek przy minimalnych stratach. Nawet pojedyncze dyski wyimaginowane mogą być przetwarzane. Metoda wymaga jedynie niewielkich ilości przeciwciał i innych odczynników. Jako przykład zastosowania tej metody do innych małych tkanek, artykuł pokazuje również, jak można rozciąć i oznaczać dyski skrzydłowe tą samą metodą. Podobne podejście można zastosować do dowolnej małej tkanki o podobnych rozmiarach, a także do innych procedur histochemicznych i znakowania poza barwieniem przeciwciał.

Procedura opracowana przez Tomlinson i Ready regularnie pozwala uzyskać doskonałe wyniki barwienia przeciwciałami. Tutaj przedstawiono potrójnie znakowane krążki imaginalne oka, czułka i skrzydła. Na Rysunku 5A krążek imaginalny oka i czułka trzeciego stadium larwalnego został potrójnie znakowany w celu wykrycia czynnika transkrypcyjnego Senseless (niebieski), markera progenitorów neuronalnych Elav (czerwony) oraz przeciwciałem anty-GFP w celu znakowania klonów komórkowych wykazujących RNAi ...

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Drosophila imaginal discs have long been studied as models of epithelial development, patterning, and regeneration. Antibody labeling and imaging of ...

small-scale-dissection-antibody-staining-eye-antennal-wing-imaginal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

University of California, Irvine.  Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów