Name: Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T13:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj protokół izolacji komórek pojedynczych z płuc myszy z guzem przy użyciu cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA. Metoda osiąga ponad 85% żywotności komórek i umożliwia analizę heterogeniczności mikrośrodowiska nowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez National Institute of Health, National Eye Institute (NEI), USA, granty 5R01EY026202, R01EY035333; granty National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756 oraz granty National Cancer Institute (NCI) R01CA271500 i 2R01CA211187.

Wszystkie eksperymenty związane ze zwierzętami były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Scripps Research dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt oraz zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użycia Zwierząt Scripps Research Institutional na podstawie protokołu #10-0019. KrasLSL-G12D/+; Myszy TdTomato+/- powstały przez krzyżowanie myszy KrasLSL-G12D/+ z myszami reportera TdTomato. Dziewięciotygodniowy lub dziesięciotygodniowy KrasLSL-G12D/+; Myszy TdTomato+/- zostały wykorzystane jako modele raka płuc. Są zakażone wewnątrztrachealnie lentiwirusem ekspresyjnym rekombinazą Cre, przy mianie wirusowym 5 × 10 5 jednostek tworzącychpłytki na mysz. Po 25 tygodniach pobrano tkanki płuc zawierające guz. Potencjalne problemy trawienne i rozwiązywanie problemów są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie buforów
<ol>
	<li>Medium DMEM/F12: Przygotuj 2% (v/v) inaktywowany termicznie FBS w medium DMEM/F12.</li>
	<li>Bufor do płukania komórek: Przygotuj 2% (v/v) nieaktywowany termicznie FBS w PBS wolnym od Ca+/Mg+ (pH 7,4).</li>
	<li>Bufor perfuzji: Wcześniej schłodzony PBS bez Ca+/Mg+ (pH 7,4).</li>
	<li>Roztwory enzymów zapasowych: Rozpuścić 10 mg (1600 U/mg) kolagenazy IV w medium DMEM/F12 o pojemności 1 mL w roztwor kolagenazy IV o pojemności 16000 U/mL; Rozpuścić 42 mg (1,19 U/mg) Dispase II w medium 1 mL DMEM/F12, aby uzyskać roztwór stockowy Dispase II o stężeniu 50 U/mL; Rozpuścić 5 mg DNazy I w medium DMEM/F12 o pojemności 1 mL i uzyskać roztwór zapasowy DNazy I o stężeniu 5 mg/mL.</li>
	<li>Medium trawiennicze: Wymieszaj 250 μL kolagenazy IV, 200 μL Dispaze II oraz 100 μL roztworów DNazy I w medium DMEM/F12 o pojemności 5 mL w medium DMEM/F12, aby uzyskać końcowe stężenie 800 U/mL kolagenazy IV, 2 U/mL Dispaze II oraz 0,1 mg/mL DNazy I.</li>
	<li>Bufor rezawisian: Wymieszaj 1 μL 0,5 M EDTA (10 μM), 1 mL termicznie inaktywowanego FBS (2% v/v) w 50 mL wolnego Ca+/Mg+ PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Roztwór BSA: Rozpuszcz 0,5 g BSA w 100 mL beztłuszczowego PBS Ca+/Mg+ , aby uzyskać roztwór 0,5% (w/v) BSA.</li>
	<li>FACS buffer: Wymieszaj 2,5 mL 1 M HEPES, 200 μL 0,5 M EDTA w roztworze 100 mL BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 25 mM HEPES i 1 mM EDTA.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki płucnej myszy
UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne są dezynfekowane 70% etanolem między próbkami. Próbki są przechowywane na lodzie między każdym etapem, a cała plastikowa garść jest certyfikowana jako wolna od DNazy/RNazy.
<ol>
	<li>Uśpienie myszy w komorzeCO2 (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Połóż mysz na plecach na podkładce do sekcjonowania i przypiąć stopy. Obficie spryskuj 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie środkowe o szerokości 2–3 cm przez skórę i mięśnie dolnej części brzucha. Ostrożnie otwórz tułów i unikaj przecięcia płuc lub serca.</li>
	<li>Przymocuj igłę bezpieczeństwa multifly 21 G do strzykawki 50 mL i zasysaj bufor perfuzji 30 mL.</li>
	<li>Włóż igłę do lewej komory i wytnij małe nacięcie w prawym przedsionku ostrym, prostym nożycami.</li>
	<li>Przekręć całe ciało21 z 15 ml buforu perfuzyjnego. UWAGA: Wybielanie wątroby wskazuje, że perfuzja całego ciała została zakończona.</li>
	<li>Usuń płuca z tułowia i odciąć nadmiar tkanek przyczepionych do płuc22. Umieść płuca w 10 mL wcześniej schłodzonym PBS bez Ca+/Mg+, aby wypłukać nadmiar krwi.</li>
	<li>Przełóż płuca do rurki o pojemności 1,5 mL zawierającej 500 μL lodowatego DMEM/F12.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej w płucach
<ol>
	<li>Przetnij tkankę płucną na małe kawałki (1–2 mm3) za pomocą bardzo wąskich, prostych nożyczek przez 2–3 minuty.</li>
	<li>Przenieś posiekaną tkankę płucną do naczynia o średnicy 6 cm zawierającego podłoże trawienne o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Umieść 6 cm talerz na termostatycznej shakerze przy 50 obr./min przez 25 minut w 37 °C. Mieszaj zawieszenie za pomocą pipety 1 mL co 8 minut.</li>
	<li>Włóż sitko o średnicy 100 μm w misce o średnicy 10 cm. Zwilż sitko 1 mL DMEM/F12 medium.</li>
	<li>Przelej strawioną zawiesinę do sitka. Przepchnij tkankę przez sitko gumowym końcem sterylnej tłoka strzykawki.</li>
	<li>Umieść sitko siatki o pojemności 70 μm nad rurką wirówki o pojemności 50 mL. Zwilż sitko 1 mL DMEM/F12 medium.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę ogniwa przez sitko i przepłucz je 5 mL DMEM/F12 medium.</li>
	<li>Filtruj zawiesinę komórkową w wirówce w stężeniu 400 g przez 10 minut w 4 °C i ostrożnie usuwaj supernatant. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w 1 mL buforu lizyjnego czerwonych krwinek na 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 14 mL bufora do płukania komórek i wiruj w 400 g przez 10 minut w 4 °C. UWAGA: Jeśli granulka nadal jest czerwona po praniu, powtórz kroki 8 i 9.</li>
	<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w buforze resuspension 20 mL.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μL zawiesiny jednokomórkowej z równą objętością trypanowego niebieskiego i dodaj 10 μL mieszanki do szkła komory liczącej komórki. Sprawdź żywotność komórek na żywo, numer komórek oraz status pojedynczych komórek za pomocą licznika komórek.</li>
</ol>
4. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze FACS i przenieść 100 μL zawiesiny komórkowej do probarek 1,5 mL zawierających przeciwciało blokujące Fc o pojemności 1 μL (1:100). Inkubuj próbki przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Próbki w wirówce w dawce 500 g przez 5 minut i odrzucaj supernatant. Ponownie zawiesz komórki w 200 μL przeciwciała CD326-APC (1:100) i inkubuj przez 45 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Próbki w wirówce w dawce 500 g przez 5 minut i odrzucaj supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μL buforu FACS zawierającego barwnik DAPI (1:5000).</li>
	<li>Przenieś wszystkie próbki do rurek FACS i chroń je przed światłem.</li>
	<li>Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego. Zastosowano następujące fluorofory: DAPI-V450, Tdtomato-YG585, CD326-APC. Strategia bramkowania została przedstawiona na Rysunku 1.</li>
</ol>

<ol><li>Leiter, A., Veluswamy, R. R., Wisnivesky, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+lung+cancer%3A+current+status+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The global burden of lung cancer: current status and future trends.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (9), 624-639 (2023).</li>
<li>Schabath, M. B., Cote, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+progress+and+priorities%3A+Lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Cancer progress and priorities: Lung cancer.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 28 (10), 1563-1579 (2019).</li>
<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Yu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+response+to+erlotinib+in+patients+with+tumors+containing+baseline+EGFR+T790M+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Poor response to erlotinib in patients with tumors containing baseline EGFR T790M mutations.</a> Ann Oncol. 25 (2), 423-428 (2014).</li>
<li>Cappuzzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+increased+gene+copy+number+and+primary+resistance+to+gefitinib+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer.</a> Ann Oncol. 20 (2), 298-304 (2009).</li>
<li>Maman, S., Witz, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+exploring+cancer+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">A history of exploring cancer in context.</a> Nat Rev Cancer. 18 (6), 359-376 (2018).</li>
<li>Croci, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cross-talk+between+tumor+and+immune+cells+in+orchestrating+the+immunosuppressive+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Dynamic cross-talk between tumor and immune cells in orchestrating the immunosuppressive network.</a> Cancer Immunol Immunother. 56 (11), 1687-1700 (2007).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+cancer+immunosurveillance+and+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting.</a> Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+cancer+immunoediting%3A+Elimination%2C+equilibrium+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into cancer immunoediting: Elimination, equilibrium and escape.</a> Curr Opin Immunol. 27, 16-25 (2014).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Han, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+epithelial+cell+states+and+plasticity+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 627 (8004), 656-663 (2024).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+atlas+of+TP53-associated+tissue+remodeling+defines+a+multicellular+tumor+ecosystem+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial atlas of TP53-associated tissue remodeling defines a multicellular tumor ecosystem in lung adenocarcinoma.</a> Nat Cancer. 6 (11), 1857-1879 (2025).</li>
<li>Marjanovic, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+high-plasticity+cell+state+during+lung+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emergence of a high-plasticity cell state during lung cancer evolution.</a> Cancer Cell. 38 (2), 229-246.e13 (2020).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLVAP+mediates+regulation+of+the+tumour+microenvironment+in+early-stage+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">PLVAP mediates regulation of the tumour microenvironment in early-stage lung adenocarcinoma.</a> Clin Transl Med. 15 (12), e70532(2025).</li>
<li>Fernandes, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+normal+and+KRASG12D-malformed+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of normal and KRASG12D-malformed lymphatic vessels.</a> JCI Insight. 10 (5), e185181(2025).</li>
<li>Pirrello, A., Killingsworth, M., Spring, K., Rasko, J. E. J., Yeo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+macrophage-like+cells+as+a+prognostic+biomarker+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Liquid+Biopsy%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated macrophage-like cells as a prognostic biomarker in solid tumors.</a> J Liquid Biopsy. 6, 100275(2024).</li>
<li>Rudnick, J. A., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+host+stromal+fibroblasts+supports+tumor+desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in host stromal fibroblasts supports tumor desmoplasia.</a> Autophagy. 17 (12), 4497-4498 (2021).</li>
<li>Nissen, N. I., Karsdal, M., Willumsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagens+and+cancer-associated+fibroblasts+in+reactive+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Collagens and cancer-associated fibroblasts in reactive stroma.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 115(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Morton, J., Snider, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+collection+and+processing+of+lungs+from+aged+mice+for+histological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiol+Aging+Age+Relat+Dis%22%5BJournal%5D)">Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies.</a> Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).</li>
<li>Pariollaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+enhances+HSF1+signaling+and+tumorigenesis+in+KRAS-driven+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption enhances HSF1 signaling and tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer.</a> Sci Adv. 8 (39), eabo1123(2022).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+tumor+heterogeneity+and+microenvironment+in+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of tumor heterogeneity and microenvironment in advanced NSCLC.</a> Nat Commun. 12 (1), 2540(2021).</li>
<li>McKeehan, W. L., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+magnesium+ions+regulate+multiplication+in+normal+and+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium and magnesium ions regulate multiplication in normal and transformed cells.</a> Nature. 275 (5682), 756-758 (1978).</li>
<li>Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ca2%E2%81%BA+in+mammalian+collagenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Role of Ca2⁺ in mammalian collagenase activity.</a> Arch Biochem Biophys. 173 (1), 355-361 (1976).</li>
<li>Shao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+expansion+of+type+II+alveolar+epithelial+cells+promotes+airway+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pharmacological expansion of type II alveolar epithelial cells promotes airway repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (16), e2400077121(2024).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse alveolar type II cells.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).</li>
<li>Arceneaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contamination-focused+approach+for+optimizing+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A contamination-focused approach for optimizing single-cell RNA-seq experiments.</a> iScience. 26 (7), 107242(2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają ze sobą rywalizujących interesów.

Protokół ten zawiera szczegółową, krok po kroku procedurę przygotowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych z tkanki płuc myszy. Aby osiągnąć optymalne rezultaty, potrzebnych jest kilka kluczowych kroków.
Przed trawieniem enzymatycznym należy wykonać perfuzję całego ciała, aby usunąć krew z płuc. Zapewnia to, że komórki odpornościowe wykryte przez scRNA-seq pochodzą z tkanki płucnej, a nie z krążenia krwi. Podczas perfuzji niezbędne jest wprowadzenie igły do lewej komory, aby zapobiec przedostaniu się perfuzjatu do krążenia płucnego i uszkodzeniu komórek płucnych. Aby zachować żywotność komórek, wszystkie bufory, w tym roztwory do płukania, zawiesiny i perfuzji, powinny być wcześniej schładzone na lodzie. Biorąc pod uwagę inherentną heterogeniczność tkanki płucnej24, próbki powinny być przechowywane w podłożu DMEM/F12 przed i podczas trawienia, ponieważ to medium dostarcza niezbędnych składników odżywczych utrzymujących żywotność komórek.
Wysoka żywotność komórek oraz dobrze zdefiniowane skupiska komórek obserwowane w tym protokole potwierdzają, że połączenie enzymów jest zarówno łagodne, jak i skuteczne. Jony wapnia i magnezu są znane z tego, że sprzyjają zlepianiu komórek i zwiększają aktywność enzymatyczną25,26. Dlatego do przygotowania większości buforów w celu minimalizacji zlepiania się stosuje PBS wolny od Ca+/Mg+, podczas gdy DMEM/F12 zawierające te jony służy jako podstawowe ośrodek buforu trawiennego, aby utrzymać zrównoważoną efektywność enzymatyczną.
Chociaż wcześniejsze badania opisywały dysocjację płuc myszy lub tkanek nowotworowych, często wykazują one istotną zmienność lub niepełny opis selekcji i stężenia proteazy 11,15,27. Na przykład Han i in.11 używali koktajli enzymatycznych bez zgłaszania stężenia, co utrudnia replikację. Z kolei wysoce wyspecjalizowana metoda opisana przez Chena i in.28 jest skuteczna w dysocjacji komórek pęcherzyka typu II (AT2), ale wymaga złożonego przepływu pracy, co jest niepraktyczne, jeśli trzeba zebrać wiele myszy jednocześnie.
Kluczowym wyzwaniem w badaniach onkologii płuc jest strukturalna heterogeniczność płuca noszącego guz, które składa się zarówno z delikatnych, zdrowych komórek, jak i złośliwych komórek nowotworowych. Standardowe protokoły lub zestawy komercyjne są często projektowane specjalnie dla próbek tkanek normalnych lub guzów. Skutkują one albo niepełnym trawiennością, nieuwalnianiem komórek nowotworowych z rdzenia guza, albo nadmiernym trawiennictwem, co powoduje znaczny stres i śmierć komórek w bardziej wrażliwej tkance normalnej w próbkach płuc z guzami.
Protokół ten rozwiązuje ten problem poprzez precyzyjne dostrojenie koktajlu enzymatycznego (kolagenaza IV, dyspaza II i DNaza I), aby osiągnąć zrównoważoną dysocjację. Ta optymalizacja zapewnia uwalnianie złośliwych komórek, jednocześnie zachowując żywotność komórek zdrowych. Potwierdza to analiza cytometrii przepływowej, podczas której z powodzeniem zidentyfikowaliśmy i rozstrzygliśmy dwie odrębne komórki nabłonkowe. Komórki nabłonkowe są dobrze podzielone na komórki TdTomato+ lub TdTomato-. Ten poziom rozdzielczości pokazuje, że metoda ta nadaje się do badania całego mikrośrodowiska płuc z guzem, bez utraty integralności tkanki gospodarza. Włączając wszystkie żywe pojedyncze komórki do analizy, protokół ten umożliwia badanie wszystkich istotnych typów komórek w mikrośrodowisku płuc noszących guz, w tym komórek makrofagowych związanych z rakiem (CAML) (Rysunek 3), które nie były szeroko opisywane w poprzednich badaniach 15,16,17.
Po trawieniu analizy scRNA-seq wykazały, że ta procedura skutecznie izoluje różne typy komórek. Roztwory enzymów powinny być świeżo przygotowane w dniu eksperymentu. Wszystkie parametry trawienia są zoptymalizowane dla jednego całego płuca myszy. Przy użyciu tylko jednego płata lub kilku płuc, czas trawienia powinien być dostosowany, aby zapewnić wysoką żywotność komórek i całkowitą dysocjację tkanek. Skażenie RNA otoczenia oraz formowanie multipletów to dwa główne czynniki wpływające na jakość scRNA-seq29. Chociaż zestawy do usuwania martwych komórek często są stosowane w celu zwiększenia żywotności, ten protokół konsekwentnie daje ponad 80% żywych komórek po trawieniu, co czyni ten krok opcjonalnym. Wykres rangi kodów kreskowych potwierdził minimalne zanieczyszczenie RNA otoczenia, nawet bez usunięcia martwych komórek.
Obecne badanie potwierdza tę metodologię w kontekście całego płuca myszy z guzem. To zoptymalizowane trawienie enzymatyczne stanowi wzorzec do badania różnych innych tkanek nożących nowotwory, charakteryzujących się podobnymi mikrośrodowiskami. Ponadto wysoka żywotność i zachowanie wszystkich typów komórek osiągnięte dzięki temu protokołowi sprawiają, że nadaje się on do zaawansowanych technologii sekwencjonowania, takich jak CITE-seq do mapowania powierzchni białek oraz ATAC-seq do profilowania epigenetycznego.
Chociaż protokół ten produkuje wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek przy niskich kosztach, stres komórkowy wywołany procesem może nadal występować podczas trawienia enzymatycznego. Aby zminimalizować artefakty ekspresji genów związane ze stresem, pojedynczy operator powinien przetwarzać jednocześnie nie więcej niż cztery próbki.

Rak płuc jest jedną z głównych przyczyn zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Można go ogólnie podzielić na dwa główne podtypy: raka płuc drobnokomórkowych (SCLC) oraz niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC)1. NSCLC odpowiada za około 85% wszystkich przypadków raka płuc, przy czym gruczolakot jest najczęstszym podtypem histologicznym2. Chociaż strategie terapeutyczne NSCLC znacznie się poprawiły w ciągu ostatnich dekad, wskaźnik śmiertelności z powodu raka płuc pozostaje wysoki3. Chemoterapia i immunoterapia to dwie główne metody leczenia stosowane w praktyce klinicznej; Jednak wielu pacjentów doświadcza oporności na leki lub nie reaguje na immunoterapię 4,5.
Mikrośrodowisko guza (TME) odgrywa kluczową rolę w inicjacji, progresji i oporności terapeutycznej guza6. Rosnące dowody sugerują, że skład TME zmienia się dynamicznie w czasie 7,8. Komórki odpornościowe przeciwnowotworowe są zazwyczaj wzbogacane w TME we wczesnych etapach nowotworów, podczas gdy populacje komórek immunosupresyjnych i z rakiem związane z nowotworem stają się dominujące w miarę rozwoju guza9. Dlatego zrozumienie heterogeniczności i plastyczności TME podczas postępu raka płuca jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów choroby i poprawy efektów terapeutycznych.
Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) umożliwia wysokorozdzielcze profilowanie ekspresji genów na poziomie poszczególnych komórek, umożliwiając kompleksową charakterystykę złożonych transkryptomów tkanek10. Technika ta stała się nieodłączna do badania heterogeniczności komórkowej oraz identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw progresji guza i oporności na leki w raku płuc11. Przygotowanie wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej jest kluczowym elementem skutecznego scRNA-seq, ponieważ stres lub uszkodzenie komórek podczas dysocjacji może prowadzić do niedokładnych wyników12,13.
Protokół ten umożliwia sekwencjonowanie RNA ze wszystkich pojedynczych komórek oczyszczonych z całych płuc z guzami, niezależnie od wielkości komórek i bez odrzucania żywych podpopulacji komórek. Wiele wcześniejszych badań odnosiło się do sekwencjonowania pojedynczych komórek płuc z nowotworami, które koncentrowały się na komórkach nowotworowych i odrzuconych komórkach CD45+ 14, 15, 16 lub koncentrowały się na komórkach odpornościowych lub innych specyficznych typach komórek17 oraz odrzuconych komórkach nowotworowych. Protokół ten ma na celu efektywne rozdzielenie wszystkich typów komórek z całych tkanek płuc zawierających guz myszy, przy jednoczesnym zapewnieniu uwalniania komórek złośliwych i zachowaniu żywotności komórek normalnych. Dzięki uwzględnieniu wszystkich żywych pojedynczych komórek protokół umożliwia badanie wszystkich istotnych typów komórek w mikrośrodowisku płuc z nowotworem, w tym makrofagowych komórek podobnych z nowotworem (CAMLs)18. Opcjonalne kroki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) są opcjonalne dla kontroli jakości i wzbogacania określonych populacji komórek. Dodatkowe wytyczne dotyczą barwienia przeciwciał, znakowania 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) oraz procedur krótkotrwałej fiksacji, gdy natychmiastowe sortowanie nie jest możliwe.
Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że został zoptymalizowany i zweryfikowany dla tkanek płuc zawierających wczesne guzy i z obciążeniem guzów poniżej 40%. W przypadku płuc zawierających guzy o wyższym stopniu lub w których obciążenie guzów przekracza 50%, skuteczność dysocjacji może być osłabiona przez obecność gęstych elementów stromalnych oraz rozległe włóknienie19,20, które mogą blokować całkowite uwalnianie komórek złośliwych.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Sigma Aldich</td><td>C5138</td><td>Enzymy trawienne</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldich</td><td>D4693</td><td>Enzymy trawienne</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche</td><td>11284931001</td><td>Usuń DNA</td></tr><tr><td>Sto Falcon 70 Cell</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Usuń niestrawioną tkankę</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td>Cięcie tkanek</td></tr><tr><td>Bufor lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma Aldich</td><td>R7757</td><td>Usuń krwinki</td></tr><tr><td>Nieaktywny na ciepło FBS</td><td>Phoenix Scientific</td><td>PS100</td><td>Chroń komórki</td></tr><tr><td>PBS wolny od Ca+/Mg+</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>Enzymy rozpuszczalne/komórki płukania</td></tr><tr><td>Igła safety-multifly 21G&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>3051524</td><td>Perfuzja całego ciała</td></tr><tr><td>50 mL strzykawki i nbsp;</td><td>BD</td><td>300866</td><td>Perfuzja całego ciała</td></tr><tr><td>Miska o średnicy 6 cm</td><td>Corning</td><td>430116</td><td>Tkanki trawienne</td></tr><tr><td>Talerz 10 cm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Tkanki trawienne</td></tr><tr><td>Przeciwciało blokujące Fc</td><td>BD</td><td>553141; RRID:AB_394655</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BD</td><td>564907; RRID:AB_2869624</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>CD326</td><td>BD</td><td>563478; RRID:AB_2738234</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>HIVmPGKCre VSVG</td><td>Rdzeń UI Viral Vectore</td><td>VVC-U of Iowa-7556</td><td>Lentivirous</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy ZE5 (Yeti)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Mysz KrasLSL-G12D/+</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>008179; RRID:IMSR_JAX:008179</td><td></td></tr><tr><td>Mysz reporterka TdTomato</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>007909; RRID:IMSR_JAX:007909&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania rna pojedynczego komórkowego

Optimized Preparation of Whole Murine Tumor-Bearing Lung Tissue for Flow Cytometry and Single-Cell RNA-Sequencing

NSCLC odpowiada za około 85% nowotworów płuc, a mięsak szczura Kirsten (KRAS) jest najczęściej mutowanym genem w NSCLC. Chociaż zarządzanie NSCLC znacznie się rozwinęło w ostatnich latach, jego heterogeniczność i plastyczność pozostają niedo do końca poznane. Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) stało się niezbędnym narzędziem do rozkładania heterogeniczności komórkowej w złożonych tkankach, takich jak płuco. Jednak generowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płucnej z guzem jest trudne, szczególnie podczas powstawania guza, gdy tkanka staje się włóknista i heterogenna. Kluczowym wymogiem skutecznego scRNA-seq jest przygotowanie żywotnych pojedynczych komórek przy minimalnym stresie lub uszkodzeniu wywołanym przez przetwarzanie. Przedstawiono szczegółowy, krok po kroku protokół izolowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy w KrasG12D; model myszy reportera tdTomato Procedura obejmuje perfuzję tkanek, kontrolowane trawienie enzymatyczne, delikatną dysocjację mechaniczną, lizę czerwonych krwinek, filtrację oraz ocenę żywotności, a także pozwala na >85% żywotnych komórek przed scRNA-seq. Wreszcie, komórki nowotworowe tdTomato+ są efektywnie izolowane przez FACS i mogą być wykrywane jako odrębne skupiska za pomocą scRNA-seq za pomocą tego protokołu.

Wysoka żywotność komórek osiągnięto w zawiesinie jednokomórkowej przygotowanej przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu. Zmiany poprawiające żywotność komórek płuc z guzem obejmowały optymalizację stężenia enzymów (Tabela Uzupełniająca 2), potrząsanie i mieszanie próbek podczas inkubacji w temperaturze 37 °C. Ponadto w kroku 6 wyeliminowano dodatkowe sitko siatki o średnicy 40 μm, aby zmniejszyć mechaniczne naprężenia ścinające, które zwiększają prawdopodobieństwo uszkodzenia komórek; dodanie dodatkowego sitnika może zmniejszyć powstawanie multipletów. Średnio żywotność komórek przekraczała 85%, w porównaniu do poniżej 80% przed optymalizacją (Tabela 1). Zmiany stężenia komórek przypisywano głównie różnicom w rozmiarze płuc i zastosowanym nośniku zawiesin w replikacjach.
W tym modelu grzyba gruczolakoraka płuc sterowanego przez KrasG12D obecne są guzki, a obciążenie guzem waha się od 10% do 40% po23 tygodniach od inicjacji guza. Dwa zawiesiny jednokomórkowe całego płuca zostały poddane scRNA-seq na platformie 10x Genomics. Ocena jakości Cell Ranger wykazała odpowiednio 23 488 i 21 436 szacowanych komórek w obu próbach (Tabela 2). Wykres kodów kreskowych wskazywał na minimalne zanieczyszczenie RNA otoczenia, co prawdopodobnie odzwierciedla wysoką żywotność komórek (Rysunek 2A,B).
Analiza głównych składowych (PCA) oraz jednorodna aproksymacja i projekcja rozmaitości (UMAP) ujawniły dobrze zdefiniowane klastry, z uwzględnieniem wszystkich głównych typów komórek płucnych (Rysunek 3A). Wykresy punktowe reprezentatywnych genów markerów potwierdziły, że kanoniczne biomarkery były wysoko ekspresyjne w odpowiadających im typach komórek (Rysunek 3B). Ponadto komórki TdTomato+ zostały wzbogacone w skupiska nabłonkowe, a komórki TdTomato+/EpCAM+ zostały skutecznie wyizolowane za pomocą FACS (Rysunek 1).
Podsumowując, ten zoptymalizowany protokół umożliwia efektywną dysocjację tkanki płucnej z guzem myszy, co zapewnia wysoką żywotność komórek, niskie zanieczyszczenie RNA oraz kompleksową reprezentację komórkową.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70452/70452fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Izolacja komórek TdTomato+/CD326 (EpCAM+) za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia blokowania cytometrii przepływowej dla zawiesiny jednokomórkowej płuc myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70452/70452fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70452/70452fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Wykres rangi kodów kreskowych ScRNA-seq płuc noszących guz u myszy. KrasLSL-G12D/+; Płuca myszy TdTomato+/- zostały pobrane 25 tygodni po zakażeniu lentiwirusem-Cre. (A,B) Wykres rangi kodu kreskowego płuc z guzem z analizy Cellranger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70452/70452fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70452/70452fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Analiza transkryptomiki pojedynczej komórki płuc z guzem myszy. (A) Projekcja UMAP dla całych zbiorów danych płuc z guzami. (B) Wykres krorkowy genów klasycznych używanych do adnotacji klastrowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70452/70452fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">Przed optymalizacją</td>
			<td colspan="2">Po optymalizacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Powtórz 1</td>
			<td>Powtórz 2</td>
			<td>Powtórz 1</td>
			<td>Powtórz 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba komórek</td>
			<td>1.3E+06</td>
			<td>6.4E+05</td>
			<td>1.8E+06</td>
			<td>6.4E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki żywe</td>
			<td>9.8E+05</td>
			<td>5.0E+05</td>
			<td>1.5E+06</td>
			<td>5.7E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent żywych komórek</td>
			<td>76%</td>
			<td>77%</td>
			<td>83%</td>
			<td>89%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Żywotność komórek zawiesiny płuc z guzem jednokomórkowym przed i po optymalizacji. Stężenie i procent żywych komórek ustalane przed i po użyciu tego protokołu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Przykład 1</td>
			<td>Przykład 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szacowana liczba komórek</td>
			<td>23,488</td>
			<td>21,436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnie odczyty na komórkę</td>
			<td>18,354</td>
			<td>20,542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mediana genów na komórkę</td>
			<td>2,565</td>
			<td>2,513</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łączna liczba wykrytych genów</td>
			<td>30,893</td>
			<td>30,556</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mediana liczby UMI na komórki</td>
			<td>6,864</td>
			<td>6,583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ważne kody kreskowe</td>
			<td>95.90%</td>
			<td>95.80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nasycenie sekwencjonowania</td>
			<td>26.10%</td>
			<td>28.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczyty ułamków w komórkach</td>
			<td>94.10%</td>
			<td>95.40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Analiza kontroli jakości ScRNA-seq przeprowadzona przez Cell Ranger. Kluczowe szacunki danych pojedynczych komórek uzyskanych z Cell Ranger
Tabela uzupełniająca 1: Rozwiązania rozwiązywania problemów. Sugeruje się rozwiązania mające na celu rozwiązanie problemów, które mogą wystąpić podczas procesu trawienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70452/Supplementary table s1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Składniki koktajlu enzymów przed optymalizacją i po optymalizacji. Końcowe stężenia koktajlu enzymów użytych przed i po optymalizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70452/Supplementary table s2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

NSCLC accounts for approximately 85% of lung cancers, and Kirsten rat sarcoma (KRAS) is the most commonly mutated gene in NSCLC. Although management of ...

Nasze badania analizują, jak zegary okołodobowe kontrolują procesy biologiczne oraz jak ich zaburzenia sprzyjają powstaniu nowotworów. Aby przezwyciężyć ograniczoną analizę subpopulacji, opracowujemy protokół sekwencjonowania wszystkich typów komórek w płucach z nowotworami razem. Na początek zbierz wymagane odczynniki, przygotuj medium DMEM/F-12, dodając do medium 2% objętości na objętość inaktywowanego termicznie FBS.Przygotuj bufor do płukania komórek, dodając nieaktywowany przez ciepło FBS do PBS bez wapnia i magnezu. Wstępnie schłodzić PBS bez wapnia i magnezu, aby użyć go jako buforu perfuzyjnego. Następnie przygotuj odpowiednie roztwory enzymów.Następnie połącz je, jak pokazano, aby przygotować podłoże trawienne. Przygotuj bufor resuspendacyjny, dodając jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA i jeden mililitr termicznie inaktywowanego FBS do 50 mililitrów PBS bez wapnia i magnezu. Po położeniu uśpionej myszy na plecach na podkładce do sekcji, przypięć stopy i obficie spryskaj mysz 70% etanolem.Za pomocą zdezynfekowanych narzędzi chirurgicznych wykonaj nacięcie środkowe o szerokości dwóch do trzech centymetrów przez skórę i mięśnie dolnej części brzucha. Ostrożnie otwórz tułów, nie przecinając płuc ani serca. Przymocuj igłę bezpieczeństwa multifly 21 gauge do strzykawki 50 milimetrów.Do strzykawki wciągnij 30 mililitrów buforu perfuzyjnego. Włóż igłę do lewej komory za pomocą ostrych, prostych nożyczek. Zrób małe nacięcie w prawym przedsionku.Przeprowadź całe ciało 15 mililitrami buforu perfuzyjnego, aż wątroba zostanie wybielona. Usuń płuca z tułowia nożyczkami. Odetnij nadmiar tkanek przyczepionych do płuc.Umieść płuca w 10 mililitrach przedchłodzonego PBS bez wapnia i magnezu, aby usunąć nadmiar krwi i utrzymać próbkę w lodzie między każdym etapem eksperymentu. Przełóż płuca do rurki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 500 mikrolitrów lodowatego medium DMEM/F-12. Używając bardzo wąskich, prostych nożyczek, tnij tkankę płucną na małe kawałki o długości od jednego do dwóch milimetrów sześciennych przez dwie do trzech minut.Przenieś posiekaną tkankę płucną do sześciocentymetrowego naczynia zawierającego pięć mililitrów podłoża trawiennego. Umieść sześciocentymetrową miskę na termostatycznej shakerze ustawionej na 50 obrotów na minutę przez 25 minut przy 37 stopniach Celsjusza. Używając pipety o jednym mililitrze, mieszaj zawiesinę co osiem minut.Zwilż sitko siatki o średnicy 100 mikrometrów jednym mililitrem DMEM/F-12 medium i umieść je w naczyniu o średnicy 10 centymetrów. Przelej strawioną zawiesinę do sitka. Używając gumowego końca sterylnej tłoka strzykawki, przepchnij tkankę przez sito.Umieść sitko siatki o średnicy 70 mikrometrów nad rurką wirówki 50 milimetrów i zwilż go jednym mililitrem medium DMEM/F-12. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko. Przepłucz sitko pięcioma mililitrami DMEM/F-12 medium.Wiruj przefiltrowaną zawiesinę ogniwową w 400 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij osad komórkowy w jednym mililitrze buforu lizyjującego czerwone krwinki na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Dodaj 14 mililitrów buforu do płukania komórek do zawiesiny.Po wirowaniu, jak już wcześniej wykazano, odrzuć supernatant. Gdy granulat będzie przezroczysty, ponownie zawiesij komórki w 20 mililitrach buforu resuspesyjnego. Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny jednokomórkowej z równą objętością trypanowego niebieskiego.Dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka komory liczenia komórek. Sprawdź żywotność aktywnych komórek, liczbę komórek i status pojedynczych komórek za pomocą licznika komórek. Żywotność komórek była poniżej 80% przed optymalizacją, a wzrosła powyżej 85% po optymalizacji.Ocena jakości Cell Ranger zidentyfikowała 23 488 oszacowanych komórek w próbie pierwszej oraz 21 436 w próbie drugiej. Wykres rangi kodów kreskowych wskazywał na minimalne zanieczyszczenie kwasem rybonukleinowym. Analiza głównych składowych oraz jednorodna aproksymacja i projekcja rozmaitości ujawniły dobrze zdefiniowane skupiska z reprezentacją wszystkich głównych typów komórek płuc.Wykresy punktowe reprezentatywnych genów markerów wykazały, że kanoniczne biomarkery były wysoko eksprimowane w odpowiadających im typach komórek. Komórki z tdtomato-dodatnim wzbogacono w skupiska nabłonkowe. Komórki z adhezją tdtomato i komórek nabłonkowych, pozytywne o cząsteczkach pozytywnych, zostały pomyślnie wyizolowane za pomocą cytometrii przepływowej.Protokół ten pozwala badaczom badać heterogeniczność różnych modeli płuc myszych, w tym całych płuc z guzami. Protokół umożliwia również analizę dalszą, taką jak mapowanie komunikacji między komórkami, aby dalej charakteryzować mikrośrodowisko guza. Przyszłe badania mogłyby zbadać, jak zakłócenia okołodobowego CV sprzyjają nowotworowi poprzez komunikację międzykomórkową oraz remodelowanie mikrośrodowiska.

optimized-preparation-whole-murine-tumor-bearing-lung-tissue-for-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Ten film opisuje przygotowanie zawiesiny komórek płuc myszy do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania ekspresji PD-L1 komórek gruczolakoraka płuc.

Przygotowanie płuc myszy do cytometrii przepływowej: generowanie zawiesiny komórkowej z tkanki płucnej do analizy cytometrii przepływowej

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Ten film opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia okresową ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Protokół opisuje metodologię generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych wycinków guza...

Hodowla eksplantatów tkanki guza płuc: procedura generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.

Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Opracowaliśmy technikę przetwarzania tkanek wykorzystującą wibratomę i tkankę płucną zatopioną agarozą do generowania skrawków płuc, co pozwala na uzyskanie obrazów architektury płuc w wysokiej rozdzielczości. Zastosowaliśmy barwienie immunofluorescencyjne, aby obserwować przestrzenną ekspresję białek przy użyciu specyficznych markerów strukturalnych płuc.

Zautomatyzowane cięcie wibratomiczne tkanki płucnej zatopionej w agarozie do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Poznaj protokół izolacji komórek pojedynczych z płuc myszy z guzem przy użyciu cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA. Metoda osiąga ponad 85% żywotności komórek i umożliwia analizę heterogeniczności mikrośrodowiska nowotworowego.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Przeglądaj więcej filmów