Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Elektroporacja pojedynczych komórek to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczanie DNA lub innych makromolekuł do poszczególnych komórek w nienaruszonej tkance, w tym w preparatach in vivo, gdy jest łączona z zaawansowanymi technikami obrazowania in vivo. Elektroporacja pojedynczych komórek markerami fluorescencyjnymi pozwala na bezpośrednią wizualizację morfologii komórkowej, wzrostu komórek oraz zdarzeń międzykomórkowych w skalach czasowych od sekund do dni. W tym filmie szczegółowo opisujemy procedurę elektroporacji pojedynczych komórek z użyciem barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki XUS oraz prezentujemy przykłady obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych neuronów.

Dzień dobry. Nazywam się Eth Haa i pracuję w laboratorium dr. Kurta Haassa w Centrum Badań nad Mózgiem na University of British Columbia. Dzisiaj zaprezentuję, jak przeprowadzić celową elektroporację pojedynczych komórek neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki albino XUS Lavis.

Wyraźną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzania manipulacji eksperymentalnych na pojedynczych komórkach przy jednoczesnym pozostawieniu otaczającej tkanki w niezmienionym stanie, co pozwala odróżnić efekty autonomiczne komórkowe od tych wynikających z zabiegów ogólnoustrojowych. Pierwszym krokiem jest wykonanie mikropipet o odpowiedniej średnicy końcówki i kącie zwężenia, a następnie napełnienie mikropipety materiałem transferowym. Następnie należy znieczulić pulle TA i przenieść je do komory aplikacyjnej, po czym wprowadzić mikropipetę do mózgu i zastosować serię impulsów napięcia.

Na koniec obrazowanie oznakowanych neuronów wykonuje się za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Technika ta zostanie zaprezentowana na przykładzie kijanek. Oznakowanie pojedynczych komórek może być stosowane w innych systemach modelowych, a także w preparatach ex vivo.

Mając to na uwadze, przejdźmy do części praktycznej. Elektroporacja pojedynczej komórki polega na celowaniu w pojedynczą komórkę przy użyciu mikroelektrody z dociąganej szklanej pipety, która ogranicza pole elektryczne do jednej komórki znajdującej się w kontakcie z końcówką pipety. Geometria fizyczna końcówki pipety jest kluczowym parametrem, który bezpośrednio wpływa na powodzenie tej techniki.

Do wytwarzania mikropipet z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i średnicy wewnętrznej 0,75 mm, zawierającego wewnętrzny filament ułatwiający napełnianie końcówki bez pęcherzyków powietrza, wykorzystuje się wyciągacz do szkła model P 97. Za najskuteczniejsze w elektroporacji pojedynczych komórek uznano końcówki pipet o średnicy od 0,5 do 1 µm i kątach zwężenia przekraczających 10 stopni. Po wyciągnięciu szklanej mikropipety materiał w roztworze można wprowadzić do pipety poprzez napełnianie wsteczne lub za pomocą strzykawki do ładowania.

W ramach niniejszego pokazu przeprowadzimy fluorescencyjne znakowanie pojedynczych neuronów za pomocą barwnika fluorescencyjnego (widocznego tutaj) lub plazmidu kodującego GFP (zielone białko fluorescencyjne). Roztwory należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń cząsteczkowych przed pobraniem do pipety. Ponieważ zwiększa to ryzyko zapchania końcówki, osobom rozpoczynającym pracę zaleca się zacząć od barwników fluorescencyjnych, gdyż są one łatwo widoczne w mikroskopie epifluorescencyjnym.

Umożliwia to wizualizację końcówki wewnątrz próbki i daje bezpośrednią informację zwrotną dotyczącą tego, czy sprzęt został prawidłowo przygotowany oraz czy końcówka pipety jest odpowiednia. Dobrze. Po przygotowaniu mikropipety możemy przejść do przeprowadzenia procedury elektroporacji pojedynczych komórek.

Sprzęt elektryczny wymagany do tej techniki to stymulator, oscyloskop oraz uchwyt do pipety wyposażony w srebrny drut, który należy wprowadzić do pipety. W tym przypadku wykorzystujemy urządzenie Ax Separator 800 A firmy Axon Instruments, jednak można również użyć powszechnych stymulatorów, takich jak Grass SD-9.

Zewnętrzna masa kijanki to po prostu srebrny drut, który utrzymuje kontakt elektroniczny z kijanką. Podczas elektroporacji głowica, przewód uziemiający oraz zewnętrzna masa kijanki są podłączone do wejścia oscyloskopu. Po przygotowaniu sprzętu elektrycznego można umieścić pipetę w uchwycie do pipet.

Uchwyt pipety powinien być zamontowany na trójosiowym mikromanipulatorze umożliwiającym precyzyjne przemieszczanie. Elektroporacja pojedynczych komórek wymaga mikroskopu z odpowiednią odległością roboczą, co zapewnia większą swobodę manewrowania i pozwala na wprowadzenie pipety pod kątem około 30 do 45 stopni.

Po prawidłowym podłączeniu aparatury można przystąpić do procedury elektroporacji pojedynczej komórki. Najpierw kijanki są znieczulane poprzez zanurzenie w 0,02% MS 2, 2 2, zazwyczaj osiągając pełne znieczulenie. Po około pięciu minutach pojedynczą kijankę przenosi się do komory elektroporacyjnej.

Używając plastikowej pipety transferowej, komorę można łatwo wykonać we własnym zakresie, wycinając w niewielkim bloku silikonowym otwór w kształcie kijanki i wprowadzając srebrny przewód uziemiający w taki sposób, aby stykał się on ze skórą kijanki podczas przebywania w komorze. Następnie, użycie pędzla do pozycjonowania kijanki zapewni, że zwierzę będzie znajdować się grzbietem do góry. Następnie mikropipetę opuszcza się, aż znajdzie się ona w bezpośrednim kontakcie ze skórą sąsiadującą z obszarem zainteresowania.

Dalsze obniżanie pipety spowoduje początkowo wgłobienie skóry, a następnie przebicie się do tkanki podległej. W tym przypadku celuję w prążek optyczny mózgu kijanki. Dążę konkretnie do obszaru warstwy ciał komórkowych.

W przypadku korzystania z amplifikatora xi można monitorować oporność pipety w tkance. Zazwyczaj oporność w zakresie od 10 do około 40 MΩ jest odpowiednia.

Opór pipety jest dobrym wskaźnikiem tego, czy średnica końcówki jest zbyt mała lub czy końcówka jest zatkana, w obu tych przypadkach opór będzie wysoki. Z kolei, jeśli średnica końcówki jest zbyt duża lub końcówka jest uszkodzona, opór pipety będzie niski. Bezwzględnego oporu pipety nie można zmierzyć przy użyciu konwencjonalnego stymulatora.

Odczyt z oscyloskopu jest pośrednim pomiarem oporu pipety dla fluorescencyjnych barwników dekstranowych. Stymulacja składa się z 10 milisekundowej serii dodatnich impulsów prostokątnych przy częstotliwości 300 herców. Pojedyncze impulsy trwają 300 mikrosekund i są podawane pod napięciem 50 woltów.

Przy zastosowaniu tych ustawień barwnik fluorescencyjny zostaje wyrzucony z końcówki, co można zaobserwować po podaniu bodźca po sondowaniu elektrycznym. Po zakończeniu w jednym miejscu pipetę wycofuje się i powtarza proces w różnych obszarach tkanki, aby zwiększyć wydajność. Podczas podawania serii impulsów napięcia należy monitorować amplitudę powstałych impulsów na oscyloskopie i w razie potrzeby dostosować amplitudę do wartości od 1 do 1,5 µA.

Jeśli amplituda impulsu pozostaje niska po znacznym zwiększeniu napięcia lub spada w trakcie procedury, sugeruje to, że końcówka jest zapchana lub jej średnica jest zbyt mała. Może to być dość frustrujące w momencie wystąpienia takiej sytuacji. Z drugiej strony, jeśli amplituda nadal jest wysoka po znacznym obniżeniu przyłożonego napięcia lub rośnie w trakcie procedury, wskazuje to na zbyt szeroką końcówkę, jej uszkodzenie lub pęknięcie końcówek.

Często staję się bardzo emocjonalny i smutny. Jak wspomniano wcześniej, zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest możliwość natychmiastowego sprawdzenia, czy pojedyncze komórki zostały poddane elektroporacji przy użyciu podanych parametrów stymulacji. Jeśli komórki wydają się bardzo słabo fluorescencyjne lub żadne z nich nie zostały zabarwione, należy zacząć od stopniowego zwiększania każdego parametru stymulacji niezależnie, aż do momentu, gdy zabarwione komórki będą świecić intensywnie w ten sposób; widok ładnie zabarwionych komórek poprawia mi humor na cały dzień.

Z drugiej strony, jeśli wydawało się, że oznakowano liczne komórki, należałoby stopniowo zmniejszać parametry stymulacji, aż do momentu, gdy tylko jedna komórka zostałaby jasno oznakowana, tak jak w tym przypadku. Obserwacja jasno oznakowanych komórek daje ogromną satysfakcję. W przypadku plazmidowego DNA stosowane pociągi impulsów to impulsy ujemne o czasie trwania 1 ms, dostarczane z częstotliwością 300 Hz, przy czym czas trwania pociągu wynosi 500 ms.

Po elektroporacji kijanki TA zostają umieszczone w świeżym roztworze hodowlanym, w którym szybko budzą się z narkozy. Zazwyczaj, po poddaniu elektroporacji od 50 do 100 kijanek TA, można przystąpić do ich przesiewania, co pokażę w następnej części. Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowania warto szybko przeprowadzić przesiewanie poddanych elektroporacji kijanek przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego epi.

Aby ustalić, które kijanki posiadają neurony odpowiednie do obrazowania, kijanki zostają poddane anestezji, a następnie umieszczone w komorze typu „cigar” i przykryte szkiełkiem cover slip. Następnie mózgi poszczególnych kijanek są szybko oglądane w świetle epifluorescencyjnym w celu sprawdzenia, czy obecne są pojedyncze, znakowane fluorescencyjnie neurony. Należy pamiętać, że nadmierna ekspozycja na światło epifluorescencyjne spowoduje fototoksyczność, która może doprowadzić do śmierci znakowanej komórki. Dlatego należy dążyć do zminimalizowania czasu ekspozycji komórek na światło fluorescencyjne.

W przypadku barwników na bazie dekstranu badanie przesiewowe może zostać przeprowadzone już 30 minut po elektroporacji. Stwierdziliśmy jednak, że dłuższe odstępy czasu wiążą się z niższym poziomem fluorescencji tła. W przypadku plazmidów badanie przesiewowe DNA jest zazwyczaj przeprowadzane co najmniej 12 godzin po elektroporacji.

Rutynowo stosujemy elektroporację pojedynczych komórek w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów w tekcie optycznym kijanki. Nasz mikroskop dwufotonowy jest zbudowany na zamówienie, na bazie mikroskopu konfokalnego Olympus FV 300 oraz źródła światła laserowego Chameleon XP. Do obrazowania zielonej fluorescencji zazwyczaj używamy długości fali 910 nanometrów.

Po znalezieniu kijanki z pojedynczym znakowanym neuronem AL i umieszczeniu jej w układzie do obrazowania dwufotonowego, przystępujemy do obrazowania neuronów dotykowych w odstępach czasowych. Pozwala to na obserwację dynamicznych wzorców wzrostu drzew dendrytycznych komórek AL. Przedstawiono tutaj przykład neuronu wykazującego ekspresję GFP, który został znakowany za pomocą elektroporacji pojedynczej komórki.

Obraz ten uzyskano za pomocą dwufotonowej mikroskopii in vivo w celu ilościowego określenia wzrostu neuronów. Zazwyczaj generowane są szkieletowe rekonstrukcje trójwymiarowe każdego obrazu neuronu. Obrazowanie poklatkowe z wydłużonymi odstępami czasowymi pozwala na wgląd w długofalowe skutki manipulacji eksperymentalnej.

Tutaj widzimy niedojrzały neuron wykazujący ekspresję GFP, który był obrazowany codziennie przez cztery dni, obejmując okres rozwoju jego drzewa dendrytycznego. Obrazy te zostały wykonane za pomocą mikroskopii dwufotonowej i są przedstawione jako projekcje Z. Szybkie obrazowanie poklatkowe pozwala obserwować naturę bardziej dynamicznych procesów wzrostu neuronalnego, w tym powstawanie i retrakcję filopodiów dendrytycznych.

Ten film przedstawia stosunkowo dojrzały neuron wykazujący ekspresję GFP, który był obrazowany w trzech wymiarach co dwie minuty przez godzinę. Jest to przykład niedojrzałego neuronu wykazującego ekspresję GFP, który był obrazowany co pięć minut w ciągu godziny. Młodsze neurony są wysoce dynamiczne, wykazując intensywny wzrost oraz retrakcję odgałęzień.

Powiększony widok tego neuronu wykazującego ekspresję GFP pokazuje ciągłe powstawanie i cofanie się filopodiów dendrytycznych, co jest typowe dla rozwijających się neuronów w tym systemie. Przezroczystość kijanki albinotycznej oraz dostępność jej mózgu sprawiają, że ten model jest idealnie przystosowany do wizualizacji wzrostu neuronów oraz zdarzeń wewnątrzkomórkowych w żywym organizmie. Elektroporacja pojedynczej komórki pozwala na wizualizację wzrostu pojedynczego neuronu oraz przeprowadzenie manipulacji autonomicznych komórkowo w obrębie w pozostałym zakresie niezmienionego mózgu.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania elektroporacji pojedynczych komórek w polach zaplavis tat, choć w tym przypadku skupiliśmy się na elektroporacji w polach TA. Technika ta była stosowana u innych organizmów, a także w plastrach hipokampa oraz w kulturach rozproszonych komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby stale modyfikować końcówki pipet oraz parametry stymulacji w celu utrzymania wysokiej wydajności.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.