Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Elektroporacja pojedynczych komórek to specjalistyczna technika pozwalająca na dostarczanie DNA lub innych makrocząsteczek do pojedynczych komórek z nienaruszoną tkanką, w tym preparaty in vivo w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania in vivo. Elektroporacja markerów fluorescencyjnych w pojedynczych komórkach umożliwia bezpośrednią wizualizację morfologii komórek, wzrostu komórek i zdarzeń międzykomórkowych w skalach czasowych od sekund do dni. W tym filmie szczegółowo opisaliśmy procedurę elektroporacji pojedynczych komórek barwnika fluorescencyjnego lub plazmowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki XUS i pokazaliśmy przykłady obrazowania na żywo neuronów znakowanych fluorescencyjnie.

Och, cześć. Nazywam się Eth Haa i pracuję w laboratorium dr Kurta Haassa w Centrum Badań nad Mózgiem na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj pokażę, jak przeprowadzić celowaną elektroporację pojedynczych komórek neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki albinosa XUS Lavisa.

Wyraźną zaletą tej techniki jest to, że eksperymentalne manipulacje mogą być przeprowadzane na pojedynczych komórkach, pozostawiając otaczającą tkankę niezmienioną, odróżniając w ten sposób efekty autonomiczne komórek od tych wynikających z globalnego leczenia. Pierwszym krokiem jest wyprodukowanie mikropipet o odpowiedniej średnicy końcówki i kącie zbieżności, a następnie załadowanie materiału transferowego do mikropipety. Następnie kałuże TA muszą zostać znieczulone i przeniesione do komory wiacyjnej, a następnie włożone mikropipety do mózgu i zastosowane ciąg impulsów napięciowych.

Na koniec neurony są obrazowane za pomocą mikroskopii fotonowej. Pokażą ci tę technikę w kijankach. Pojedyncza komórka może być stosowana w innych systemach modelowych, a także w preparatach ex vivo.

Mając to na uwadze, zacznijmy. Elektroporacja pojedynczej komórki jest ukierunkowana na pojedynczą komórkę za pomocą ciągnionej szklanej elektrody do mikropipet, która ogranicza pole elektryczne do pojedynczego ogniwa stykającego się z końcówką pipety. Fizyczna geometria końcówki pipety jest krytyczną cechą bezpośrednio wpływającą na powodzenie tej techniki.

Ściągacz do model P 97 służy do generowania mikropipet ze szkła krzemianowego bo o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra i średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra zawierającej wewnętrzny filament ułatwiający napełnianie końcówki bez pęcherzyków powietrza. Końcówki do pipet, które okazały się najbardziej skuteczne w elektroporacji pojedynczych ogniw, to te o średnicy końcówki od 0,5 do jednego mikrona i kątach zbieżności większych niż 10 stopni. Po wyciągnięciu szklanej mikropipety, materiał przenoszony w roztworze można załadować do pipety przez ponowne napełnienie lub za pomocą strzykawki ładującej.

W tej demonstracji będziemy znakować fluorescencyjnie pojedyncze neurony za pomocą widocznego tutaj barwnika fluorescencyjnego lub kodowania plazmidowego. Roztwory białek zielonej fluorescencji GFP należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby zmniejszyć ilość cząstek stałych, które dostają się do pipety. Ponieważ zwiększy to ryzyko zatkania końcówki dla nowych użytkowników, zaleca się rozpoczęcie od barwników fluorescencyjnych, ponieważ można je łatwo zobaczyć pod wpływem epifluorescencji.

Umożliwia to wizualizację końcówki w próbce i daje bezpośrednią informację zwrotną na temat tego, czy sprzęt został prawidłowo skonfigurowany i czy końcówka pipety jest odpowiednia. Dobra robota. Teraz, gdy mamy już przygotowaną mikropipetę, możemy przejść do wykonania procedury elektroporacji pojedynczej komórki.

Sprzęt elektryczny wymagany do tej techniki to stymulator i oscyloskop oraz uchwyt pipety wyposażony w srebrny drut, który należy włożyć do pipety. Tutaj używamy separatora siekier 800 A w instrumencie aksonowym, jednak można również użyć popularnych stymulatorów, takich jak trawa SD nine. Separator osi jest połączony ze stopniem głowicy, który łączy się między separatorem siekiery a elektrodą z drutu srebrnego.

Zewnętrzne uziemienie kijanki to po prostu srebrny przewód, który pozostaje elektronicznym kontaktem z kijanką. Podczas elektroporacji stopień główny, przewód uziemiający i zewnętrzne uziemienie kijanki są podłączone do wejścia oscyloskopu. Po skonfigurowaniu sprzętu elektrycznego pipetę można umieścić w uchwycie na pipety.

Uchwyt na pipety powinien być zamontowany na trzyosiowym mikromanipulatorze, który umożliwia precyzyjny ruch. Elektroporacja pojedynczych ogniw wymaga mikroskopu o dobrej odległości roboczej. Daje to większe pole manewru i umożliwia wprowadzenie pipety pod kątem około 30 do 45 stopni.

Po prawidłowym podłączeniu sprzętu możemy przystąpić do zabiegu elektroporacji pojedynczej komórki. Najpierw kijanki są znieczulane przez zanurzenie w 0,02% MS 2, 2 2, kijanki są zwykle w pełni znieczulone. Po około pięciu minutach pojedynczą kijankę przenosi się do komory elektroporacyjnej.

Za pomocą plastikowej pipety transferowej komorę można łatwo wykonać we własnym zakresie, wycinając wnękę w kształcie kijanki w małym silikonowym bloku i wkładając srebrny przewód uziemiający tak, aby stykał się ze skórą kijanki w komorze. Następnie za pomocą pędzla do ustawienia kijanki upewnisz się, że jest ona grzbietem do góry. Mikropipeta jest następnie opuszczana, aż znajdzie się w kontakcie ze skórą bezpośrednio przylegającą do obszaru zainteresowania.

Dalsze opuszczanie pipety początkowo spowoduje wgłębienie w skórze, a następnie przejście do leżącej poniżej tkanki. Tutaj celuję w guz wzrokowy mózgu bieguna pływów. W szczególności celuję w obszar warstwy ciała komórki.

Jeśli używasz xi, można monitorować opór pipety w tkance. Ogólnie rzecz biorąc, rezystancja wynosi od 10 do około 40. Mega omy działają dobrze.

Rezystancja pipety jest dobrym wskaźnikiem tego, czy średnica końcówki jest zbyt mała lub czy końcówka jest zatkana, w którym to przypadku opór będzie wysoki. Z drugiej strony, jeśli średnica końcówki jest zbyt duża lub jeśli końcówka jest uszkodzona, opór pipety będzie niski. Chociaż opór bezwzględny, pipety nie można zmierzyć przy użyciu konwencjonalnego stymulatora.

Odczyt oscyloskopu jest pośrednią miarą rezystancji pipet dla fluorescencyjnych matryc dekstranowych. Bodziec składa się z 10-milisekundowego ciągu dodatnich impulsów fali prostokątnej przyłożonych z częstotliwością 300 Hz. Pojedyncze impulsy trwają 300 mikrosekund i są dostarczane pod napięciem 50 woltów.

Korzystając z tych ustawień, barwnik fluorescencyjny jest wyrzucany z końcówki, co można zobaczyć po zastosowaniu bodźca po elektrosondowaniu. W jednym miejscu pipeta jest cofana, a proces jest powtarzany w różnych miejscach w tkance w celu poprawy wydajności. Podczas dostarczania ciągu impulsów napięciowych należy monitorować amplitudę powstających impulsów na oscyloskopie i w razie potrzeby dostosować amplitudę do zakresu od jednego do 1,5 mikroampera.

Jeśli amplituda impulsu pozostaje niska po znacznym wzroście napięcia lub spadkach w trakcie zabiegu, zdecydowanie sugeruje to, że końcówka jest zatkana lub że średnica końcówki jest zbyt mała. Może to być dość frustrujące, gdy tak się stanie. Z drugiej strony, jeśli amplituda jest nadal wysoka po znacznym zmniejszeniu przyłożonego napięcia lub wzroście w trakcie zabiegu, zdecydowanie wskazuje to, że końcówka jest albo zbyt szeroka, albo jest złamana, albo końcówki pękają.

Często staję się bardzo emocjonalny i smutny. Jak wspomniano wcześniej, zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest to, że można od razu sprawdzić, czy pojedyncze ogniwa zostały wyelektroporowane przy użyciu podanych parametrów bodźca. Jeśli komórki wydają się bardzo ciemne lub żadne komórki nie są oznaczone, można zacząć od stopniowego zwiększania każdego parametru bodźca niezależnie, aż oznaczone komórki wydają się być jasno oznaczone w ten sposób, widząc ładnie oznaczone komórki, co sprawia, że mój dzień.

Z drugiej strony, gdyby wiele komórek wydawało się być oznaczonych, stopniowo zmniejszano by parametry bodźca, aż okazałoby się, że pojedyncza komórka jest jasno oznaczona, tak jak ta. Widzenie jaskrawo oznaczonych komórek jest naprawdę satysfakcjonujące. W przypadku plazmidowego DNA stosowane ciągi impulsów to impulsy ujemne o czasie trwania jednej milisekundy dostarczane z częstotliwością 300 Hz, a czas trwania pociągu wynosi 500 milisekund.

Po elektroporacji słupy TA są umieszczane w świeżym roztworze hodowlanym, gdzie szybko dochodzą do siebie po znieczuleniu. Zazwyczaj po elektro 50 do stu słupów TA możemy przystąpić do ich przesiewania, które pokażę Wam dalej. Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowych warto szybko przebadać kijanki elektryczne za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego.

W celu określenia, które kijanki zawierają neurony, które nadają się do obrazowania, kijanki są znieczulane, a następnie umieszczane w komorze na cygara i przykrywają wsunięte pojedyncze kijanki, mózgi są następnie szybko oglądane w świetle fluorescencyjnym epi, aby określić, czy obecne są pojedyncze neurony znakowane fluorescencyjnie. Należy pamiętać, że nadmierna ekspozycja na światło fluorescencyjne epi spowoduje fototoksyczność, która może zabić znakowaną komórkę. Dlatego staraj się zminimalizować czas, w którym komórki są wystawione na działanie światła fluorescencyjnego.

W przypadku barwników dekstranowych badanie przesiewowe może odbyć się już po 30 minutach od elektroporacji. Okazuje się jednak, że dłuższe interwały wiążą się z niższymi poziomami fluorescencji tła. W przypadku plazmidu badanie przesiewowe DNA jest zwykle wykonywane co najmniej 12 godzin po elektroporacji.

Rutynowo używamy elektroporacji pojedynczej komórki do fluorescencyjnego znakowania neuronów w tektum wzrokowym kijanki. Nasz mikroskop dwufotonowy jest zbudowany na zamówienie, zbudowany z mikroskopu konfokalnego Olympus FV 300 i laserowego źródła światła Chameleon XP. Zazwyczaj używamy długości fali 910 nanometrów do obrazowania siły zielonej podłogi.

Po znalezieniu kijanki z pojedynczym oznaczonym neuronem AL i umieszczeniu jej na naszym zestawie z dwoma fotonami, przystępujemy do obrazowania poklatkowego do fotonów neuronów dotykowych w różnych odstępach czasu. Dzięki temu możemy obserwować dynamiczne wzorce wzrostu trzpieni dendrytycznych komórek AL. Tutaj widzimy przykład neuronu wyrażającego GFP, który został oznaczony za pomocą elektroporacji pojedynczej komórki.

Obraz ten został wykonany za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w celu ilościowego określenia wzrostu neuronów. Zazwyczaj generowane są szkieletowane trójwymiarowe rekonstrukcje każdego obrazu neuronalnego. Obrazowanie poklatkowe z wydłużonymi odstępami czasu zapewnia wgląd w długoterminowe konsekwencje eksperymentalnej manipulacji.

Tutaj widzimy niedojrzały neuron wyrażający GFP, który był obrazowany codziennie w ciągu czterech dni, obejmując opracowanie jego dendrytycznej altany. Obrazy te zostały wykonane za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych i są prezentowane jako projekcje Z. Szybkie obrazowanie poklatkowe pozwala zaobserwować naturę bardziej dynamicznych procesów wzrostu neuronów, w tym powstawania i retrakcji filopodiów dendrytycznych.

Ten film pokazuje stosunkowo dojrzały neuron wyrażający GFP, który był obrazowany w trzech wymiarach co dwie minuty przez jedną godzinę. Jest to przykład niedojrzałego neuronu wykazującego ekspresję GFP, który był obrazowany co pięć minut w ciągu godziny. Młodsze neurony są bardzo dynamiczne, wykazując rozległy wzrost gałęzi i retrakcję gałęzi.

Powiększenie tego neuronu wyrażającego GFP pokazuje ciągłe dodawanie i wycofywanie filopodiów dendrytycznych, co jest typowe dla rozwijających się neuronów w tym układzie. Przezroczystość kijanki albinosa i dostępność jej mózgu sprawiają, że ten model systemu idealnie nadaje się do wizualizacji wzrostu neuronów i zdarzeń wewnątrzkomórkowych w żywym organizmie. Elektroporacja pojedynczej komórki pozwala nam wizualizować wzrost pojedynczego neuronu i wykonywać autonomiczne manipulacje komórkowe w niezmienionym mózgu.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić elektroporację pojedynczych ogniw w słupach zap lavis tat, chociaż tutaj skupiamy się na elektroporacji w słupach TA. Technika ta została zastosowana w innych organizmach, a także w wycinkach hipokampa i zdysocjowanych kulturach komórkowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że stale modyfikujesz końcówki pipet i parametry stymulacji, aby utrzymać wysoką wydajność.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.