Name: Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-11T18:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Poznaj elektroporację pojedynczych komórek w neuronach mózgu kijanki Xenopus laevis. Ta metoda umożliwia dostarczanie barwników fluorescencyjnych i DNA do żywych tkanek oraz obserwację morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sharmin Hossain za film poklatkowy przedstawiający wzrost niedojrzałego neuronu oraz Derekowi Dunfieldowi za obrazy z mikroskopii elektronowej końcówek mikropipet SCE.

Przygotowanie sprzętu:
<ol>
<li>Sprzęt elektryczny wymagany do wykonania tej techniki to stymulator, oscyloskop oraz uchwyt do mikropipety wyposażony w srebrny drut, który należy wprowadzić do mikropipety. Zazwyczaj używamy stymulatora Axoporator 800A firmy Axon Instruments, jednak inne popularne stymulatory, takie jak SD9 firmy Grass Instruments, są również odpowiednie do elektroporacji pojedynczych komórek. Stymulator jest połączony z przedwzmacniaczem (headstage), który łączy się z elektrodą z srebrnego drutu umieszczoną wewnątrz szklanej mikropipety zawierającej wewnętrzny roztwór przewodzący. Drugi przewód ze stymulatora jest podłączony do wejścia oscyloskopu, do którego doprowadzony jest również sygnał z zewnętrznej uziemionej elektrody w kijance. Zewnętrzne uziemienie kijanki to po prostu srebrny drut, który pozostaje w kontakcie elektrotonicznym z kijanką podczas elektroporacji. Obwód zostaje zamknięty w momencie zetknięcia mikropipety z kijanką. </li>
<li>Elektroporacja pojedynczych komórek wymaga mikroskopu o dobrej odległości roboczej (co najmniej 5 cm), ponieważ zapewnia to przestrzeń do manewrowania i pozwala na wprowadzenie mikropipety pod kątem około 30-45 stopni.</li>
</ol>
Wytwarzanie mikropipet:
Przygotowanie odpowiednich mikropipet jest krytycznym krokiem w tym protokole. Trudność polega na znalezieniu równowagi między wąską końcówką (o średnicy mniejszej niż 1μm) a taką, która nie złamie się łatwo podczas nakłuwania tkanki. Stwierdziliśmy również, że preferowane są końcówki o kącie zwężenia większym niż 10 stopni.
<ol>
<li>Przygotować szklaną mikropipetę wyciąganą o średnicy końcówki mniejszej niż 1μm i kącie zwężenia końcówki większym niż 10 stopni. <ol>
<li>Do tego celu odpowiednie jest szkło borokrzemianowe z wewnętrznym włóknem o średnicy zewnętrznej 1,5mm i średnicy wewnętrznej 0,75mm. <ol>
<li>Stosunkowo grube szkło zapewnia odpowiednią sztywność końcówki.</li>
<li>Wewnętrzne włókno jest istotne dla wciągania fluidu wypełnionego od tyłu w kierunku końcówki mikropipety.</li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>Wytwarzanie odpowiednich końcówek często wymaga kilku modyfikacji w zależności od zaobserwowanych wyników. Różne tkanki mogą wymagać końcówki o nieco innym kształcie lub średnicy.</li>
</ol>
Protokół elektroporacji pojedynczych komórek:
Nowym użytkownikom zaleca się rozpoczęcie pracy z fluorescencyjnymi barwnikami dekstranowymi, ponieważ w przeciwieństwie do genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, są one natychmiast widoczne w mikroskopii epifluorescencyjnej. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych pozwala użytkownikowi bezpośrednio dostrzec położenie końcówki mikropipety w tkance, a po przeprowadzeniu elektroporacji daje natychmiastową informację zwrotną dotyczącą prawidłowej konfiguracji sprzętu oraz odpowiedniości końcówki mikropipety.
<ol>
<li>Napełnij mikropipetę roztworem związku do elektroporacji, używając strzykawki ładującej lub metodą wypełniania wstecznego. <ol>
<li>W przypadku użycia plazmidowego DNA należy upewnić się, że próbki są wolne od endotoksyn i mają stężenie od 1-2µg/ml, przygotowane w wodzie.</li>
<li>Stężenie fluorescencyjnych barwników dekstranowych należy określić empirycznie. Często stosujemy barwniki fluorescencyjne rozcieńczone w wodzie do stężenia około 300µM.</li>
<li>Zazwyczaj wystarczające są objętości 0.5-1µl.</li>
<li>Przed napełnieniem roztwory należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń cząsteczkowych zasysanych do mikropipety, co mogłoby prowadzić do jej zapchania.</li>
<li>Pęcherzyki powietrza w końcówce często wpływają na przepływ prądu i powinny zostać usunięte poprzez energiczne potrząśnięcie mikropipetą przed zamontowaniem jej na głowicy.</li>
</ol></li>
<li>Wsuń mikropipetę do uchwytu lub głowicy zamontowanej na 3-osiowym mikromanipulatorze. Upewnij się, że srebrna elektroda drutowa jest włożona do mikropipety i znajduje się w kontakcie elektrotonicznym z roztworem wewnętrznym.</li>
<li>Zanurz kijanki w 0.02% roztworze MS-222 (estru etylowego kwasu 3-aminobenzoenowego) przygotowanym w pożywce do hodowli kijanek (roztwór Steinberga, pH 7.4), aby je znieczulić. <ol>
<li>W naszych eksperymentach zazwyczaj używamy kijanek albinos Xenopus laevis w stadium 44-48.</li>
<li>Kijanki są zazwyczaj całkowicie znieczulone po około 5 minutach.</li>
<li>Aby skrócić czas oczekiwania, można znieczulić kilka kijanek jednocześnie, jednak należy unikać ekspozycji na MS-222 przez okres przekraczający 1 godzinę.</li>
</ol></li>
<li>Przenieś pojedynczą znieczuloną kijankę do komory elektroporacyjnej za pomocą plastikowej mikropipety transferowej. <ol>
<li>Komorę elektroporacyjną można łatwo wykonać we własnym zakresie, wycinając otwór w kształcie kijanki w małym bloku silikonowym Sylgard® i wkładając do niego srebrny drut uziemiający w taki sposób, aby znajdował się on w kontakcie elektrotonicznym z kijanką w komorze.</li>
</ol></li>
<li>Ustaw kijankę grzbietem do góry, używając zwilżonego pędzla.</li>
<li>Obniżaj mikropipetę, aż znajdzie się ona w kontakcie ze skórą, bezpośrednio przy obszarze zainteresowania. <ol>
<li>Celowanie w obszary o gęstym upakowaniu ciał komórkowych znacznie zwiększy szanse na udaną elektroporację. Zazwyczaj celujemy w tectum opticum kijanki.</li>
<li>Wprowadzaj mikropipetę pod kątem od 30 do 45 stopni. Płytsze trajektorie utrudniają przebicie skóry, natomiast zbyt strome kąty często ograniczają widoczność.</li>
</ol></li>
<li>Dalsze obniżanie mikropipety spowoduje początkowo wgłębienie skóry, a następnie przebicie do leżącej poniżej tkanki. <ol>
<li>Do obrazowania in vivo preferowane są komórki powierzchowne; można je wycelować, obniżając końcówkę mikropipety powoli w momencie wgłębienia skóry.</li>
</ol></li>
<li>Należy stale monitorować oporność mikropipety po wprowadzeniu jej do tkanki. Przy użyciu Axoporatora 800A (Axon Instruments) optymalna oporność wynosi około 10-40MΩ. Oporność jest dobrym wskaźnikiem tego, czy średnica końcówki jest odpowiednia do elektroporacji pojedynczych komórek. <ol>
<li>Wysoka oporność mikropipety (&gt;100MΩ) wskazuje na zapchanie końcówek lub mikropipety z końcówkami, które są zbyt wąskie.</li>
<li>Niska oporność mikropipety (&lt;10MΩ) wskazuje na zbyt dużą średnicę końcówki, co często jest wynikiem jej pęknięcia.</li>
<li>W przypadku użycia stymulatora, który nie zapewnia bezpośredniego pomiaru oporności, można ją zmierzyć pośrednio, obserwując amplitudę impulsów napięcia na oscyloskopie (omówiono poniżej).</li>
</ol></li>
<li>Zastosuj serię impulsów napięcia. <ol>
<li>W przypadku plazmidowego DNA najskuteczniejsze okazały się serie impulsów w postaci ujemnych fal prostokątnych o czasie trwania 1ms, dostarczanych z częstotliwością 300Hz przy całkowitym czasie trwania serii 500ms. <ol>
<li>Napięcie impulsu określa się empirycznie tak, aby amplituda impulsów mierzona na oscyloskopie wynosiła od 0.75 do 1.5μA.</li>
</ol></li>
<li>W przypadku fluorescencyjnych barwników dekstranowych stosuje się dodatnie impulsy fal prostokątnych o czasie trwania 300μs z częstotliwością 300Hz i całkowitym czasem trwania serii 10ms. <ol>
<li>Podobnie jak w protokole dla DNA, napięcie impulsu określa się empirycznie tak, aby amplituda impulsów mierzona na oscyloskopie wynosiła od 0.75 do 1.5μA.</li>
<li>Dodatkowe korekty parametrów stymulacji można wprowadzić na podstawie obserwacji wyników elektroporacji w mikroskopie epifluorescencyjnym. <ol>
<li>Jeśli elektroporowane komórki wydają się ciemne, parametry impulsów należy stopniowo zwiększać, aż komórki staną się jaśniejsze.</li>
<li>Z kolei jeśli znakowane są skupiska komórek, parametry impulsów należy zmniejszyć, aż do uzyskania znakowania pojedynczych komórek.</li>
</ol></li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>Wycofaj mikropipetę, wprowadź ją ponownie w inne miejsce w tkance i zastosuj serię impulsów napięcia. <ol>
<li>Aby zwiększyć wydajność, zazwyczaj przeprowadzamy elektroporację w wielu miejscach w każdej półkuli tectum opticum kijanki, zachowując odpowiednie odstępy, aby znakowane komórki na siebie nie nachodziły.</li>
</ol></li>
<li>Przenieś elektroporowaną kijankę do pojemnika z roztworem hodowlanym Steinberga. <ol>
<li>Kijanki szybko wybudzą się z narkozy w ciągu kilku minut.</li>
</ol></li>
<li>Tę samą mikropipetę można wykorzystać dla wielu kijanek. Ważne jest stałe monitorowanie amplitudy impulsów na oscyloskopie. <ol>
<li>Jeśli amplituda impulsu pozostaje niska po znacznym zwiększeniu intensywności impulsu, prawdopodobnie jest to wynik zapchania końcówki, co często zdarza się przy elektroporacji wielu kijanek w jednej sesji. <ol>
<li>Metodą udrażniania niewielkich zatorów w końcówce jest przyłożenie pojedynczego dodatniego impulsu po wprowadzeniu mikropipety do tkanki.</li>
<li>Jeśli zatoru nie można usunąć lub zapchania powtarza się często, należy wymienić mikropipetę.</li>
</ol></li>
<li>Jeśli amplituda impulsu pozostaje bardzo wysoka po znacznym zmniejszeniu parametrów impulsu, jest to znak, że końcówka pękła i musi zostać wymieniona.</li>
</ol></li>
</ol>
Przesiewanie komórek poddanych skutecznej elektroporacji:
<ol>
<li>Po elektroporacji kijanki są poddawane przesiewowi w celu wykrycia znakowanych komórek przy użyciu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
<li>W przypadku zastosowania barwników fluorescencyjnych, przesiew kijanek może być przeprowadzony już 30 minut po elektroporacji. <ol>
<li>Stwierdziliśmy jednak, że dłuższe odstępy czasowe wiążą się z niższym poziomem fluorescencji tła.</li>
</ol></li>
<li>W przypadku genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, przesiew jest zazwyczaj przeprowadzany co najmniej 12 godzin po elektroporacji. <ol>
<li>Komórki ekspresjonujące białka fluorescencyjne będą z czasem stawać się jaśniejsze, dlatego komórki o słabej fluorescencji mogą zostać ponownie sprawdzone po dodatkowym odstępie 12-24 godzin.</li>
</ol></li>
<li>Kijanki są znieczulane zgodnie z powyższym opisem, umieszczane w komorze Sylgard® i przykrywane szkiełkiem nakrywnym. Następnie poszczególne kijanki są badane pod kątem epifluorescencji. <ol>
<li>Należy pamiętać, że nadmierna ekspozycja na światło epifluorescencyjne spowoduje fototoksyczność, która może doprowadzić do śmierci znakowanej komórki. Należy zatem zminimalizować czas ekspozycji komórek na światło fluorescencyjne.</li>
</ol></li>
<li>Kijanki należy przenieść z powrotem do naczynia z roztworem hodowlanym Steinberga.</li>
</ol>

<ol><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li>
<li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience+%284th+Ed.%29%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
</ol>

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) jest potężnym narzędziem służącym do określania funkcji genów oraz przeprowadzania celowanych manipulacji genetycznych. Przezroczystość kijanek albinotycznych oraz dostępność mózgu sprawiają, że ten model badawczy jest idealny do wizualizacji wzrostu neuronów i zdarzeń wewnątrzkomórkowych w żywym organizmie. SCE umożliwia wizualizację wzrostu pojedynczego neuronu oraz przeprowadzanie manipulacji autonomicznych komórkowo w mózgu, który w pozostałym zakresie pozostaje niezmieniony....

elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. Wyraźną zaletą tej metody jest możliwość przeprowadzania manipulacji eksperymentalnych na pojedynczych komórkach przy jednoczesnym pozostawieniu otaczającej tkanki niezmienionej, co pozwala odróżnić efekty autonomiczne komórkowo od tych wynikających z zabiegów ogólnoustrojowych. W połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania in vivo, SCE markerów fluorescencyjnych pozwala na bezpośrednią wizualizację morfologii komórkowej, wzrostu komórek oraz zdarzeń wewnątrzkomórkowych w skalach czasowych od sekund do dni. Chociaż technika ta jest stosowana w różnych preparatach in vivo i ex vivo, zoptymalizowaliśmy ją pod kątem zastosowania u kijank *Xenopus laevis*. W tym artykule wideo szczegółowo opisujemy procedurę SCE barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki *Xenopus* albino. Omawiamy również metody optymalizacji wydajności oraz przedstawiamy przykłady obrazowania dwufotonowego fluorescencji żywych neuronów znakowanych fluorescencyjnie metodą SCE.

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę SCE w celu wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki Xenopus laevis.

Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) jest specjalistyczną techniką umożliwiającą wprowadzanie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonych...

Elektroporacja pojedynczych komórek to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczanie DNA lub innych makromolekuł do poszczególnych komórek w nienaruszonej tkance, w tym w preparatach in vivo, gdy jest łączona z zaawansowanymi technikami obrazowania in vivo. Elektroporacja pojedynczych komórek markerami fluorescencyjnymi pozwala na bezpośrednią wizualizację morfologii komórkowej, wzrostu komórek oraz zdarzeń międzykomórkowych w skalach czasowych od sekund do dni. W tym filmie szczegółowo opisujemy procedurę elektroporacji pojedynczych komórek z użyciem barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki XUS oraz prezentujemy przykłady obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych neuronów.Dzień dobry. Nazywam się Eth Haa i pracuję w laboratorium dr. Kurta Haassa w Centrum Badań nad Mózgiem na University of British Columbia. Dzisiaj zaprezentuję, jak przeprowadzić celową elektroporację pojedynczych komórek neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki albino XUS Lavis.Wyraźną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzania manipulacji eksperymentalnych na pojedynczych komórkach przy jednoczesnym pozostawieniu otaczającej tkanki w niezmienionym stanie, co pozwala odróżnić efekty autonomiczne komórkowe od tych wynikających z zabiegów ogólnoustrojowych. Pierwszym krokiem jest wykonanie mikropipet o odpowiedniej średnicy końcówki i kącie zwężenia, a następnie napełnienie mikropipety materiałem transferowym. Następnie należy znieczulić pulle TA i przenieść je do komory aplikacyjnej, po czym wprowadzić mikropipetę do mózgu i zastosować serię impulsów napięcia.Na koniec obrazowanie oznakowanych neuronów wykonuje się za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Technika ta zostanie zaprezentowana na przykładzie kijanek. Oznakowanie pojedynczych komórek może być stosowane w innych systemach modelowych, a także w preparatach ex vivo.Mając to na uwadze, przejdźmy do części praktycznej. Elektroporacja pojedynczej komórki polega na celowaniu w pojedynczą komórkę przy użyciu mikroelektrody z dociąganej szklanej pipety, która ogranicza pole elektryczne do jednej komórki znajdującej się w kontakcie z końcówką pipety. Geometria fizyczna końcówki pipety jest kluczowym parametrem, który bezpośrednio wpływa na powodzenie tej techniki.Do wytwarzania mikropipet z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i średnicy wewnętrznej 0,75 mm, zawierającego wewnętrzny filament ułatwiający napełnianie końcówki bez pęcherzyków powietrza, wykorzystuje się wyciągacz do szkła model P 97. Za najskuteczniejsze w elektroporacji pojedynczych komórek uznano końcówki pipet o średnicy od 0,5 do 1 µm i kątach zwężenia przekraczających 10 stopni. Po wyciągnięciu szklanej mikropipety materiał w roztworze można wprowadzić do pipety poprzez napełnianie wsteczne lub za pomocą strzykawki do ładowania.W ramach niniejszego pokazu przeprowadzimy fluorescencyjne znakowanie pojedynczych neuronów za pomocą barwnika fluorescencyjnego (widocznego tutaj) lub plazmidu kodującego GFP (zielone białko fluorescencyjne). Roztwory należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń cząsteczkowych przed pobraniem do pipety. Ponieważ zwiększa to ryzyko zapchania końcówki, osobom rozpoczynającym pracę zaleca się zacząć od barwników fluorescencyjnych, gdyż są one łatwo widoczne w mikroskopie epifluorescencyjnym.Umożliwia to wizualizację końcówki wewnątrz próbki i daje bezpośrednią informację zwrotną dotyczącą tego, czy sprzęt został prawidłowo przygotowany oraz czy końcówka pipety jest odpowiednia. Dobrze. Po przygotowaniu mikropipety możemy przejść do przeprowadzenia procedury elektroporacji pojedynczych komórek.Sprzęt elektryczny wymagany do tej techniki to stymulator, oscyloskop oraz uchwyt do pipety wyposażony w srebrny drut, który należy wprowadzić do pipety. W tym przypadku wykorzystujemy urządzenie Ax Separator 800 A firmy Axon Instruments, jednak można również użyć powszechnych stymulatorów, takich jak Grass SD-9.Zewnętrzna masa kijanki to po prostu srebrny drut, który utrzymuje kontakt elektroniczny z kijanką. Podczas elektroporacji głowica, przewód uziemiający oraz zewnętrzna masa kijanki są podłączone do wejścia oscyloskopu. Po przygotowaniu sprzętu elektrycznego można umieścić pipetę w uchwycie do pipet.Uchwyt pipety powinien być zamontowany na trójosiowym mikromanipulatorze umożliwiającym precyzyjne przemieszczanie. Elektroporacja pojedynczych komórek wymaga mikroskopu z odpowiednią odległością roboczą, co zapewnia większą swobodę manewrowania i pozwala na wprowadzenie pipety pod kątem około 30 do 45 stopni.Po prawidłowym podłączeniu aparatury można przystąpić do procedury elektroporacji pojedynczej komórki. Najpierw kijanki są znieczulane poprzez zanurzenie w 0,02% MS 2, 2 2, zazwyczaj osiągając pełne znieczulenie. Po około pięciu minutach pojedynczą kijankę przenosi się do komory elektroporacyjnej.Używając plastikowej pipety transferowej, komorę można łatwo wykonać we własnym zakresie, wycinając w niewielkim bloku silikonowym otwór w kształcie kijanki i wprowadzając srebrny przewód uziemiający w taki sposób, aby stykał się on ze skórą kijanki podczas przebywania w komorze. Następnie, użycie pędzla do pozycjonowania kijanki zapewni, że zwierzę będzie znajdować się grzbietem do góry. Następnie mikropipetę opuszcza się, aż znajdzie się ona w bezpośrednim kontakcie ze skórą sąsiadującą z obszarem zainteresowania.Dalsze obniżanie pipety spowoduje początkowo wgłobienie skóry, a następnie przebicie się do tkanki podległej. W tym przypadku celuję w prążek optyczny mózgu kijanki. Dążę konkretnie do obszaru warstwy ciał komórkowych.W przypadku korzystania z amplifikatora xi można monitorować oporność pipety w tkance. Zazwyczaj oporność w zakresie od 10 do około 40 MΩ jest odpowiednia.Opór pipety jest dobrym wskaźnikiem tego, czy średnica końcówki jest zbyt mała lub czy końcówka jest zatkana, w obu tych przypadkach opór będzie wysoki. Z kolei, jeśli średnica końcówki jest zbyt duża lub końcówka jest uszkodzona, opór pipety będzie niski. Bezwzględnego oporu pipety nie można zmierzyć przy użyciu konwencjonalnego stymulatora.Odczyt z oscyloskopu jest pośrednim pomiarem oporu pipety dla fluorescencyjnych barwników dekstranowych. Stymulacja składa się z 10 milisekundowej serii dodatnich impulsów prostokątnych przy częstotliwości 300 herców. Pojedyncze impulsy trwają 300 mikrosekund i są podawane pod napięciem 50 woltów.Przy zastosowaniu tych ustawień barwnik fluorescencyjny zostaje wyrzucony z końcówki, co można zaobserwować po podaniu bodźca po sondowaniu elektrycznym. Po zakończeniu w jednym miejscu pipetę wycofuje się i powtarza proces w różnych obszarach tkanki, aby zwiększyć wydajność. Podczas podawania serii impulsów napięcia należy monitorować amplitudę powstałych impulsów na oscyloskopie i w razie potrzeby dostosować amplitudę do wartości od 1 do 1,5 µA.Jeśli amplituda impulsu pozostaje niska po znacznym zwiększeniu napięcia lub spada w trakcie procedury, sugeruje to, że końcówka jest zapchana lub jej średnica jest zbyt mała. Może to być dość frustrujące w momencie wystąpienia takiej sytuacji. Z drugiej strony, jeśli amplituda nadal jest wysoka po znacznym obniżeniu przyłożonego napięcia lub rośnie w trakcie procedury, wskazuje to na zbyt szeroką końcówkę, jej uszkodzenie lub pęknięcie końcówek.Często staję się bardzo emocjonalny i smutny. Jak wspomniano wcześniej, zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest możliwość natychmiastowego sprawdzenia, czy pojedyncze komórki zostały poddane elektroporacji przy użyciu podanych parametrów stymulacji. Jeśli komórki wydają się bardzo słabo fluorescencyjne lub żadne z nich nie zostały zabarwione, należy zacząć od stopniowego zwiększania każdego parametru stymulacji niezależnie, aż do momentu, gdy zabarwione komórki będą świecić intensywnie w ten sposób; widok ładnie zabarwionych komórek poprawia mi humor na cały dzień.Z drugiej strony, jeśli wydawało się, że oznakowano liczne komórki, należałoby stopniowo zmniejszać parametry stymulacji, aż do momentu, gdy tylko jedna komórka zostałaby jasno oznakowana, tak jak w tym przypadku. Obserwacja jasno oznakowanych komórek daje ogromną satysfakcję. W przypadku plazmidowego DNA stosowane pociągi impulsów to impulsy ujemne o czasie trwania 1 ms, dostarczane z częstotliwością 300 Hz, przy czym czas trwania pociągu wynosi 500 ms.Po elektroporacji kijanki TA zostają umieszczone w świeżym roztworze hodowlanym, w którym szybko budzą się z narkozy. Zazwyczaj, po poddaniu elektroporacji od 50 do 100 kijanek TA, można przystąpić do ich przesiewania, co pokażę w następnej części. Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowania warto szybko przeprowadzić przesiewanie poddanych elektroporacji kijanek przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego epi.Aby ustalić, które kijanki posiadają neurony odpowiednie do obrazowania, kijanki zostają poddane anestezji, a następnie umieszczone w komorze typu „cigar” i przykryte szkiełkiem cover slip. Następnie mózgi poszczególnych kijanek są szybko oglądane w świetle epifluorescencyjnym w celu sprawdzenia, czy obecne są pojedyncze, znakowane fluorescencyjnie neurony. Należy pamiętać, że nadmierna ekspozycja na światło epifluorescencyjne spowoduje fototoksyczność, która może doprowadzić do śmierci znakowanej komórki. Dlatego należy dążyć do zminimalizowania czasu ekspozycji komórek na światło fluorescencyjne.W przypadku barwników na bazie dekstranu badanie przesiewowe może zostać przeprowadzone już 30 minut po elektroporacji. Stwierdziliśmy jednak, że dłuższe odstępy czasu wiążą się z niższym poziomem fluorescencji tła. W przypadku plazmidów badanie przesiewowe DNA jest zazwyczaj przeprowadzane co najmniej 12 godzin po elektroporacji.Rutynowo stosujemy elektroporację pojedynczych komórek w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów w tekcie optycznym kijanki. Nasz mikroskop dwufotonowy jest zbudowany na zamówienie, na bazie mikroskopu konfokalnego Olympus FV 300 oraz źródła światła laserowego Chameleon XP. Do obrazowania zielonej fluorescencji zazwyczaj używamy długości fali 910 nanometrów.Po znalezieniu kijanki z pojedynczym znakowanym neuronem AL i umieszczeniu jej w układzie do obrazowania dwufotonowego, przystępujemy do obrazowania neuronów dotykowych w odstępach czasowych. Pozwala to na obserwację dynamicznych wzorców wzrostu drzew dendrytycznych komórek AL. Przedstawiono tutaj przykład neuronu wykazującego ekspresję GFP, który został znakowany za pomocą elektroporacji pojedynczej komórki.Obraz ten uzyskano za pomocą dwufotonowej mikroskopii in vivo w celu ilościowego określenia wzrostu neuronów. Zazwyczaj generowane są szkieletowe rekonstrukcje trójwymiarowe każdego obrazu neuronu. Obrazowanie poklatkowe z wydłużonymi odstępami czasowymi pozwala na wgląd w długofalowe skutki manipulacji eksperymentalnej.Tutaj widzimy niedojrzały neuron wykazujący ekspresję GFP, który był obrazowany codziennie przez cztery dni, obejmując okres rozwoju jego drzewa dendrytycznego. Obrazy te zostały wykonane za pomocą mikroskopii dwufotonowej i są przedstawione jako projekcje Z. Szybkie obrazowanie poklatkowe pozwala obserwować naturę bardziej dynamicznych procesów wzrostu neuronalnego, w tym powstawanie i retrakcję filopodiów dendrytycznych.Ten film przedstawia stosunkowo dojrzały neuron wykazujący ekspresję GFP, który był obrazowany w trzech wymiarach co dwie minuty przez godzinę. Jest to przykład niedojrzałego neuronu wykazującego ekspresję GFP, który był obrazowany co pięć minut w ciągu godziny. Młodsze neurony są wysoce dynamiczne, wykazując intensywny wzrost oraz retrakcję odgałęzień.Powiększony widok tego neuronu wykazującego ekspresję GFP pokazuje ciągłe powstawanie i cofanie się filopodiów dendrytycznych, co jest typowe dla rozwijających się neuronów w tym systemie. Przezroczystość kijanki albinotycznej oraz dostępność jej mózgu sprawiają, że ten model jest idealnie przystosowany do wizualizacji wzrostu neuronów oraz zdarzeń wewnątrzkomórkowych w żywym organizmie. Elektroporacja pojedynczej komórki pozwala na wizualizację wzrostu pojedynczego neuronu oraz przeprowadzenie manipulacji autonomicznych komórkowo w obrębie w pozostałym zakresie niezmienionego mózgu.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania elektroporacji pojedynczych komórek w polach zaplavis tat, choć w tym przypadku skupiliśmy się na elektroporacji w polach TA. Technika ta była stosowana u innych organizmów, a także w plastrach hipokampa oraz w kulturach rozproszonych komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby stale modyfikować końcówki pipet oraz parametry stymulacji w celu utrzymania wysokiej wydajności.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

single-cell-electroporation-in-vivo-within-the-intact-developing-brain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Poznaj elektroporację pojedynczych komórek w neuronach mózgu kijanki Xenopus laevis. Ta metoda umożliwia dostarczanie barwników fluorescencyjnych i DNA do żywych tkanek oraz obserwację morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Przeglądaj więcej filmów