Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Moje badania koncentrują się na infekcjach Candida albicans oraz na tym, jak reakcje gospodarza wpływają na to, czy wynik to wyczyszczenie, czy postęp choroby. Kluczowym wyzwaniem jest brak modeli wczesnej infekcji grzybiczej. Protokół ten wykorzystuje planarię jako rozwiązanie o wysokiej przepustowości.

System planariański umożliwia badanie inicjacji, postępu, oczyszczania i śmiertelności choroby, z wysokorozdzielczym pomiarem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Na początek wybierz planarie Schmidtea Mediterranean o długości około pięciu milimetrów pod stereomikroskopem i upewnij się, że zwierzęta są całkowicie wyprostowane przed pomiarem. Unikaj stosowania planarii mniejszych niż pięć milimetrów, ponieważ mogą one dotyczyć osób z blastemami lub niepełnym rozwojem, co może prowadzić do niespójnych rezultatów.

Ponadto należy wykluczyć planarie większe niż pięć milimetrów, ponieważ większe zwierzęta są mniej odpowiednie do fluorescencyjnego immunobarwienia. Wyklucz zwierzęta z blastematami, tkankami pozbawionymi pigmentacji lub niepełnym rozwojem pigmentacji. Przenieś zdrowe planarie spełniające wszystkie kryteria włączenia do dwóch mililitrów świeżej wody planariańskiej na odwierć w sześciodołkowej płycie polistyrenowej nieobejmującej hodowlami tkankowymi.

Przydziel dołki dla kontroli negatywnych składających się z niezakażonych lub poddawanych zabiegom zwierzętom oraz kontroli pozytywnej obejmującej zwierzęta zakażone dzikim typem Candida albicans. Usuń całą wodę z każdej studni i zastąp ją dwoma mililitrami świeżej wody planariańskiej, aby zapewnić jednolitość studni. Pozwól zwierzętom wyrównać się w nowym środowisku przez jeden dzień przed infekcją.

Przechyl płytę z sześcioma dołkami i delikatnie usuwaj całą wodę z jednego dołka na raz, stosując technikę aseptyczną. Natychmiast dodaj obliczoną objętość wody planariańskiej i kultury Candida albicans do studni, zanim przejdziesz do kolejnej studni. Zanotuj datę i godzinę szczepienia.

Umieść zaszczepioną płytkę z sześcioma dołkami w ciemnym, statycznym miejscu w temperaturze pokojowej. Wysiwnij planarię Candida albicans przez maksymalnie 72 godziny, w zależności od pożądanego punktu końcowego. Za pierwszym razem, 24 godziny po infekcji, lekko przechyl płytkę.

Następnie, używając sterylnej pipety transferowej, aspiruj płyn zawierający kulturę Candida albicans i delikatnie wlej go do obszaru studni wolnego od zwierząt, aby wymieszać osiadłą warstwę grzybów. Powtarzaj ten krok pięć do dziesięciu razy w dołku, aby rozbić osiadłą warstwę grzybów, unikając bezpośredniego kontaktu z planariami. Obserwuj osadzanie grzybów na ciemnym tle przed i po etapach ponownego zawieszenia, aby uzyskać najlepszą widoczność.

Ponownie zawiesij niezakażone studnie kontrolne w identycznych warunkach. Powtórz ten zabieg po 48 godzinach od zakażenia. Po 72 godzinach od zakażenia przenieś planarie do świeżych studni z dwoma mililitrami czystej wody, minimalizując przenoszenie grzybów poprzez minimalne zużycie płynów.

Po przeniesieniu zwierząt usuń całą wodę i zamień ją świeżą, planarialną wodą. Rozpocznij ocenę wyników gospodarza od jednego dnia po zakażeniu i kontynuuj codziennie aż do pożądanego eksperymentalnego punktu końcowego. Ilościowo określ obrażenia gospodarza za pomocą standaryzowanego systemu punktacji od zera do trzech.

Trzy dni po zakażeniu delikatnie przenieś planarny na nową płytkę z sześcioma dołkami zawierającą dwa mililitry świeżej wody planariańskiej na odwiert, unikając przy tym przeniesienia pozostałej kultury grzybowej. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopii świetlnej z minimalnym 10-krotnym celem. Zapisuj wyniki gospodarzy za pomocą standaryzowanej tabeli punktacyjnej.

Dodatkowo można przeprowadzić immunodymatyczne barwienia przeciw Candida, aby obserwować kolonizację nabłonka gospodarza przez grzyby podczas infekcji i oczyszczania. Kolonizacja nabłonka grzybowego została znacząco zmniejszona o cztery dni po infekcji, a do siedmiu dni po infekcji niemal wszystkie grzyby związane z powierzchnią zostały usunięte w warunkach ID50. Niezakażone grupy kontrolne pozostały całkowicie bezobjawowe.

Przy wartości około 7,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, około 30% było bezobjawowych, 50% objawowych, a 20% zmarło. Przy około 8,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, około 30% było bezobjawowych, 20% objawowych, a 50% zmarło. Mediana przeżycia spadła z około 90% (7,0 razy 10) do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, do około 50% (8,0 razy 10), do mocy siedmiu komórek na mililitr oraz do mniej niż 25% (8,5 razy 10), do mocy siedmiu komórek na mililitr.

Całkowite przeżywalność wynosiła około 50% u planarian zakażonych dzikim typem Candida albicans przy wynioście około 8,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr, w porównaniu do 100% przeżycia u niezakażonych kontroli. Protokół ten umożliwia badania in vivo dynamiki gospodarz-patogen poprzez integrację obrazowania i metod molekularnych w genetycznie rozpracowywalnym gospodarzu. Przyszłe zastosowania obejmują wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutacji, badania porównawcze gatunków mikroorganizmów oraz adaptację do testów toksykologii i skuteczności leków.