Name: Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Metoda umożliwia analizę in vivo z wysoką przepustowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratoriów Nobile, Oviedo i Hernday za wnikliwe dyskusje na temat modelu infekcji S. mediterranea-C. albicans oraz są wdzięczni Edelweiss Pfister za zarządzanie laboratoriami i pielęgnację planariów. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), które przyznawały R35GM156045 i R35GM124594 C.J.N., a także R35GM158501 i R01GM132753 dla N.J.O. Prace te były również wspierane przez rodzinę Kamangarów w formie fundowanego stanowiska dla C.J.N.S. N.M.S. zostało wsparte przez stypendia Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) National Science Foundation (NSF) Center of Research Excellence in Science and Technology (CREST) w ramach nagród NSF-HRD-1547848 oraz NSF-EES-2112675.
Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu i analizie danych, interpretacji danych, pisaniu manuskryptu ani decyzji o publikacji wyników. N.M.S. potwierdza użycie ChatGPT do pomocy przy edycji manuskryptu (sprawdzanie pisowni, gramatyki, formatowania i struktury zdań).

C.J.N. jest współzałożycielem BioSynesis, Inc., firmy rozwijającej diagnostykę i terapię w przypadku infekcji biofilmem. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Zmiana dawki zakaźnej dzikiego typu C. albicans powoduje powtarzalne, zależne od dawki różnice w zachorowalności u S. mediterranea, podkreślając wrażliwość modelu na ilościową ocenę zjadliwości grzybów. Protokół ten określa strategie ustalania podstawowych dawek zakaźnych i śmiertelnych w koloniach planaricznych utrzymywanych laboratoryjnie oraz przedstawia kryteria potwierdzania skutecznego zakażenia ogólnoustrojowego poprzez moczenie, integrując ocenę zdrowia gospodarza z pomiarami obciążenia grzybami...

Candida albicans to powszechny oportunistyczny patogen grzybowy, który bezobjawowo kolonizuje 50-70% ludzi 1,2,3. Zazwyczaj jako nieszkodliwy kommensal, C. albicans może się rozrastać w takich warunkach jak zaburzenia równowagi mikrobioty, stosowanie antybiotyków, immunosupresja, zaburzenia bariery nabłonkowej lub obecność urządzeń medycznych, prowadząc do chorób od powierzchownych infekcji śluzówki po zagrażającą życiu kandydozą ogólnoustrojową 4,5. U osób z obniżoną odpornością – w tym z HIV/AIDS, pacjentów poddawanych chemioterapii lub terapiom immunosupresyjnym, osobom z chorobami przewlekłymi lub przebywającym na oddziałach intensywnej terapii – śmiertelność może przekraczać 70%, co podkreśla znaczące obciążenie zdrowotne inwazyjne kandydozy 6,7,8. Na całym świecie inwazyjne infekcje grzybicze dotykają ponad 6,5 miliona osób rocznie, a bezpośrednie koszty opieki zdrowotnej w samych Stanach Zjednoczonych przekraczają 8 miliardów dolarów rocznie dla zakażeń związanych z Candida. Pomimo dostępnych środków przeciwgrzybiczych, wskaźniki zachorowalności i śmiertelności związane z zakażeniami C. albicans pozostają w dużej mierze niezmienione przez dziesięciolecia, co podkreśla pilną potrzebę lepszego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen w chorobach grzybowych.
C. albicans wykorzystuje różnorodny repertuar czynników zjadliwości, które wspierają kolonizację, trwałość i patogenezę w różnych środowiskach gospodarza. Należą do nich adhezja do tkanek gospodarza, unikanie odporności, przebudowa ściany komórkowej, wydzielanie enzymów hydrolitycznych, plastyczność morfologiczna oraz tworzenie biofilmu 11,12,13,14,15,16. Łącznie te cechy pozwalają C. albicans adaptować się do różnorodnych nisz gospodarzy, modulować odpowiedzi immunologiczne oraz opierać się terapiom przeciwgrzybiczym 16,17,18,19,20,21. Wyjaśnienie, jak te procesy wpływają na wyniki zakażeń – w tym zachorowalność gospodarzy, śmiertelność oraz usuwanie patogenów – jest niezbędne do opracowania skuteczniejszych strategii profilaktycznych i terapeutycznych.
Aby zbadać tę dynamikę gospodarz-patogen, stworzyliśmy system modelowy, wykorzystujący planarialną Schmidtea Mediterranean jako gospodarza 22,23,24. Model ten służy jako wszechstronna platforma do badania wielosystemowej odpowiedzi gospodarzy na infekcje grzybiczne, wykorzystując metodę zakażenia opartą na moczeniu, która umożliwia synchroniczne narażenie zwierząt na C. albicans. Poniższa sekcja przedstawia zaktualizowane, krok po kroku procedury, które udoskonalają ten protokół, poprawiają powtarzalność i ułatwiają spójną implementację w laboratoriach.
Planarii to wolnożyjące bezkręgowce o wyjątkowej zdolności regeneracyjnej, zdolne do szybkiego uzupełniania tkanek utraconych w wyniku urazu lub infekcji25. Nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego i polegają całkowicie na zachowanych wrodzonych mechanizmach obronnych – w tym receptorach rozpoznawania wzorców, peptydach przeciwdrobnoustrojowych, wydzielaniu śluzu oraz komórkach fagocytowych – aby oczyścić patogeny bakteryjne i grzybowe w ciągudni 26, 27, 28, 29. Ponieważ odporność wrodzona stanowi pierwszą linię obrony wśród eukariontów i pozostaje niedostatecznie zbadana poza systemami ssaków27, planarie dają możliwość badania tych procesów in vivo z rozdzielczością komórkową i molekularną. Ich zdolność regeneracyjna jest napędzana przez dorosłe pluripotentne komórki macierzyste, zwane neoblastami, które stanowią około 30% komórek dorosłych i przyczyniają się do regeneracji po infekcji23,30. Te cechy czynią S. mediterranea potężnym modelem do rozkładania zjadliwości patogenów i obrony gospodarza na skali genetycznej, komórkowej, tkankowej i organizmowej, umożliwiając rozwiązywanie pytań często trudnych do badania przy użyciu tradycyjnych systemów ssaków.
Dodatkowo, niewielki rozmiar planarii (zazwyczaj kilka milimetrów długości), niskie koszty i łatwośćutrzymania umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę, unikając jednocześnie ograniczeń finansowych, etycznych i regulacyjnych charakterystycznych dla modeli kręgowców. Podobnie jak C. albicans, S. mediterranea jest genomowo łatwa do przejścia, posiada w pełni zsekwencjonowany i adnotowany genom, a także wspiera zaawansowane techniki molekularne i komórkowe – w tym profilowanie transkrypcyjne, wysokorozdzielczą immunohistochemię i histologię oraz odporną interferencję RNA (RNAi)32,33,34,35,36,37,38 . Narzędzia te umożliwiają równoległą analizę odpowiedzi gospodarza i patogenu podczas infekcji.
Do badania infekcji grzybiczych zastosowano kilka alternatywnych modeli przedklinicznych. Bezkręgowcy żywiciele, tacy jak Galleria mellonella (ćma woska), Caenorhabditis elegans (gąsta) i Drosophila melanogaster (muszka owocowa), a także kręgowiec Danio rerio (danio danio), każdy z nich oferuje unikalne korzyści eksperymentalne, ale ma też istotne ograniczenia. Systemy te często polegają na przeżyciu jako głównym celu, ponieważ infekcje szybko wywołują śmierć gospodarza, uniemożliwiając szczegółową ocenę zachorowalności, regeneracji i odpowiedzi wielosystemowych – cechy, które model planariański łatwo uwzględnia.
Modele ssaków, takie jak Mus musculus (mysz), Rattus norvegicus (szczur), Oryctolagus cuniculus (królik) oraz Cavia porcellus (świnka morska), lepiej oddają fizjologię człowieka, ale są ograniczone wysokimi kosztami, małymi grupami, wymogami etycznymi i regulacyjnymi oraz wyzwaniem odróżnienia wrodzonej od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Co więcej, dekady badań nad patogenezą grzybów u myszy koncentrowały się głównie na zaawansowanych stadiach infekcji ogólnoustrojowych 39,40,41,42,43, często pomijając wczesne zdarzenia, takie jak zakłócenia bariery nabłonkowej i przerost błony śluzowej – najczęstsze drogi inicjacji choroby grzybowej u ludzi 44,45,46.
Badanie interakcji gospodarz z patogenem jest zatem niezbędne dla zrozumienia procesów biologicznych leżących u podstaw zjadliwości grzybów, obrony gospodarza i postępu choroby. Inwazyjne infekcje grzybicze stanowią narastające globalne zagrożenie, ponieważ wiele gatunków wykazuje obecnie odporność na wszystkie główne klasy leków przeciwgrzybiczych. Szacuje się, że ponad miliard osób jest dotknięty infekcjami grzybiczymi, a czynniki takie jak zmiany klimatu, powszechne stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych oraz rosnąca liczba osób immunokompromitowanych przyspieszają pojawianie się patogenów opornych na środki przeciwgrzybicze 47,48,49,50 . Zrozumienie, jak patogenne grzyby kolonizują i oddziałują ze swoimi gospodarzami, jest kluczowe dla opracowania nowych strategii profilaktycznych i terapeutycznych.
Poniżej opisano zrewidowany i ustandaryzowany protokół infekcji systemowej dla interakcji S. mediterranea-C. albicans, zaprojektowany w celu promowania powtarzalności oraz umożliwienia systematycznych badań patogenezy grzybów i mechanizmów obronnych gospodarza. Oryginalny protokół był stosowany w wcześniejszych publikacjach22, 23, 24. Tabela 1 podsumowuje kluczowe aktualizacje zawarte w tej zrewidowanej wersji, w tym ulepszenia procedur szczepienia grzybów, zmniejszenie objętości studni, określone kryteria włączenia zwierząt, określenie dawek zakaźnych i śmiertelnych oraz zaktualizowane zalecenia dotyczące hodowli zwierząt. Ten proces zawiera szczegółowe wskazówki dotyczące hodowli C. albicans, zakażania planarii poprzez ekspozycję na moczenie oraz oceny zjadliwości grzybów i odpowiedzi gospodarza na podstawie jakościowych i ilościowych odczytów w warunkach objawowych i śmiertelnych (Rysunek 1). Zoptymalizowane procedury przedstawione tutaj uwzględniają zmienne empirycznie zidentyfikowane jako kluczowe determinanty dynamiki infekcji i wyników gospodarza, co poprawia powtarzalność i umożliwia systematyczną ocenę interakcji gospodarz–patogen.

<table><tbody><tr><td>1,7 mL rurki mikrowirówkowe&nbsp;</td><td>VWR/Genemate</td><td>490004-436-BOXOF500</td><td>Przezroczyste, pudełko z 500 elementami</td></tr><tr><td>20 mL fiolki scyntillonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-100-006</td><td>Przezroczyste butelki szklane do immunobarwienia</td></tr><tr><td>Płytki polistyrenowe bez obróbki 24-dołków</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td>Immunobarwienie</td></tr><tr><td>Mikrowirówki o pojemności 5,0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf/Sigma Aldrich</td><td>EP0030119487-200EA</td><td>Przezroczyste, pudełko z 200 elementami</td></tr><tr><td>Płytki polistyrenowe nieobrobione z 6 dołków</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Testy infekcji</td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>89405-066</td><td>Poziom bakteriologiczny dla medium YPD</td></tr><tr><td>Aplikatory patyczki</td><td>Thermo Fisher/Puritan</td><td>22-029-491</td><td>C. albicans hodownictwo</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender Inc.</td><td>Nie ma</td><td>Oprogramowanie do projektowania figurek używane do generowania ilustracji schematycznych</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Woda planarialna/1x Montju&iuml; Sole C</td></tr><tr><td>Candida albicans przeciwciała poliklonalne przeciw królikom, IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>PA1-27158</td><td>Immunobarwienie</td></tr><tr><td>Rurki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>C. albicans zbiory</td></tr><tr><td>Rurki hodowlane szkło borokrzemowe 18x150mm</td><td>VWR</td><td>47729-583</td><td>C. albicans hodownictwo</td></tr><tr><td>Kuwetty</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td>Do pomiaru gęstości optycznej hodowli</td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Medium YPD</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>Klasa biologii molekularnej jako uzupełnienie kriogenicznego magazynowania C. albicans&nbsp; </td></tr><tr><td>Narzędzie do tworzenia wykresów i wizualizacji danych</td><td>GraphPad/Prism</td><td></td><td>Oprogramowanie statystyczne i narzędzie do wizualizacji. Verison 10.6.1.</td></tr><tr><td>Narzędzie do tworzenia wykresów</td><td>R</td><td></td><td>Oprogramowanie statystyczne. Verison 4.4.3.</td></tr><tr><td>Shaker inkubatorowy</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1282-0004-1EA</td><td>New Brunswick Innova 44/44R C. albicans</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>Jeśli chodzi o wodę planarialną&nbsp; (1x Montju&iuml; sole C)</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>Jeśli chodzi o wodę planarialną&nbsp; (1x Montju&iuml; sole C)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop multizoom</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon AZ100&nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7250-50G</td><td>Odczynnik mukolityczny i ofiarny&nbsp; Fiksacja</td></tr><tr><td>Paramaldehyd, roztwór 16%, stopień biologii molekularnej</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td>Odczynnik utrwalający</td></tr><tr><td>Bezprzewodowy silnik Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-361</td><td>Homogenizacja planarialna</td></tr><tr><td>Peptone, stopień bakteriologiczny</td><td>HIMEDIA/VWR</td><td>89129-480</td><td>Medium YPD</td></tr><tr><td>Tłuczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td>Jednorazowy pellet wolny od RNazy do homogenizacji planarialnej</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Poliuretan (alkohol winylowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8136&nbsp;</td><td>Dla Gelvatol</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541-500G</td><td>Medium planarialne/woda&nbsp; (1x Montju&iuml; sole C)</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwciało dla kóz przeciwkrólikow, IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Immunobarwienie</td></tr><tr><td>SN250</td><td>Centrum Zasobów Genetyki Grzybów</td><td></td><td>Dziki typ C. albicans szczep (https://www.fgsc.net/)</td></tr><tr><td>Azidek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td>Dla Gelvatol</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td>Medium planarialne/woda&nbsp; (1x Montju&iuml; sole C)</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014-500G</td><td>Medium planarialne/woda&nbsp; (1x Montju&iuml; sole C)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Agilent</td><td>26354</td><td>BioTek Epoch 2 Microplate do pomiaru gęstości optycznej</td></tr><tr><td>Statyczny inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2634</td><td>C. albicans kulturowanie</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9CM</td><td>Sterylne, jednorazowe stopniowane pipety do transferu planariów</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Dla Gelvatol</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>212750</td><td>Medium YPD</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół dla zakażenia candida albicans w schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

An Optimized Protocol for Candida albicans Infection in Schmidtea mediterranea to Study Fungal Pathogenesis and Host Defense

Candida albicans to powszechny oportunistyczny patogen grzybowy, który bezobjawowo kolonizuje większość ludzi. Chociaż dysbioza wywołana stosowaniem antybiotyków, zaburzenia odporności lub uszkodzenia bariery nabłonkowej zazwyczaj są łagodne, mogą wywołać nadmierny wzrost i infekcje grzybiczne, od powierzchownych chorób błony śluzowej po zagrażającą życiu kandydozę ogólnoustrojową. Potrzebne są nowe przedkliniczne modele infekcji, aby rozłożyć patogenezę C. albicans in vivo na różnych stadiach infekcji i z różnymi mierzalnymi wynikami gospodarza. Planarialna Schmidtea Mediterranean została wcześniej ustanowiona jako gospodarz bezkręgowców do badania interakcji gospodarz z patogenem podczas infekcji C. albicans . S. mediterranea opiera się całkowicie na zachowanych mechanizmach odporności wrodzonej, zdolnych do zwalczania infekcji patogennymi mikroorganizmami, w tym bakteriami i grzybami. Niezwykła zdolność regeneracyjna planarian oraz dostępne populacje komórek macierzystych czynią ten organizm łatwym modelem do analizy wczesnych odpowiedzi immunologicznych, naprawy tkanek oraz oczyszczania patogenów in vivo. Model ten wspiera jednoczesną analizę zjadliwości grzybów oraz odpowiedzi transkrypcyjnej gospodarzy, dostarczając cennych informacji o dynamice infekcji. Przedstawiono tutaj zaktualizowany protokół z szczegółowymi modyfikacjami, ustandaryzowanymi procedurami i zoptymalizowanymi krokami infekowania S. mediterranea C. albicans, zaprojektowany w celu zwiększenia powtarzalności i umożliwienia systematycznych badań patogenezy grzybów i obrony gospodarza.

Przedstawiono zaktualizowany protokół zakażania planarii C. albicans (rysunek 1) oraz systematycznego ilościowego określania wyników gospodarzy (rysunek 2). Ten udoskonalony sposób pracy wspiera solidną ocenę wielu parametrów infekcji, w tym zachorowalności (objawowe nasilenie choroby), przeżycia (śmiertelność), obciążenia grzybami (CFU) oraz dynamiki przestrzenno-czasowej kolonizacji patogenów (fluorescencyjne immunobarwienie). W przeciwieństwie do wię...

Protokół ten stanowi zoptymalizowany, szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu planarialnej Schmidtea mediterranea jako modelu do badania interakcji gospodarz-patogen podczas infekcji grzybiczej. Metoda opiera się na wcześniejszej procedurze infekowania planarii ludzkim patogenem grzybowym Candida albicans, dostarczając szczegółowych wskazówek mających na celu zwiększenie powtarzalności i spójności eksperymentów.

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Candida albicans is a common opportunistic fungal pathogen that asymptomatically colonizes most humans. Although typically a benign commensal, dysbiosis ...

Moje badania koncentrują się na infekcjach Candida albicans oraz na tym, jak reakcje gospodarza wpływają na to, czy wynik to wyczyszczenie, czy postęp choroby. Kluczowym wyzwaniem jest brak modeli wczesnej infekcji grzybiczej. Protokół ten wykorzystuje planarię jako rozwiązanie o wysokiej przepustowości.System planariański umożliwia badanie inicjacji, postępu, oczyszczania i śmiertelności choroby, z wysokorozdzielczym pomiarem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Na początek wybierz planarie Schmidtea Mediterranean o długości około pięciu milimetrów pod stereomikroskopem i upewnij się, że zwierzęta są całkowicie wyprostowane przed pomiarem. Unikaj stosowania planarii mniejszych niż pięć milimetrów, ponieważ mogą one dotyczyć osób z blastemami lub niepełnym rozwojem, co może prowadzić do niespójnych rezultatów.Ponadto należy wykluczyć planarie większe niż pięć milimetrów, ponieważ większe zwierzęta są mniej odpowiednie do fluorescencyjnego immunobarwienia. Wyklucz zwierzęta z blastematami, tkankami pozbawionymi pigmentacji lub niepełnym rozwojem pigmentacji. Przenieś zdrowe planarie spełniające wszystkie kryteria włączenia do dwóch mililitrów świeżej wody planariańskiej na odwierć w sześciodołkowej płycie polistyrenowej nieobejmującej hodowlami tkankowymi.Przydziel dołki dla kontroli negatywnych składających się z niezakażonych lub poddawanych zabiegom zwierzętom oraz kontroli pozytywnej obejmującej zwierzęta zakażone dzikim typem Candida albicans. Usuń całą wodę z każdej studni i zastąp ją dwoma mililitrami świeżej wody planariańskiej, aby zapewnić jednolitość studni. Pozwól zwierzętom wyrównać się w nowym środowisku przez jeden dzień przed infekcją.Przechyl płytę z sześcioma dołkami i delikatnie usuwaj całą wodę z jednego dołka na raz, stosując technikę aseptyczną. Natychmiast dodaj obliczoną objętość wody planariańskiej i kultury Candida albicans do studni, zanim przejdziesz do kolejnej studni. Zanotuj datę i godzinę szczepienia.Umieść zaszczepioną płytkę z sześcioma dołkami w ciemnym, statycznym miejscu w temperaturze pokojowej. Wysiwnij planarię Candida albicans przez maksymalnie 72 godziny, w zależności od pożądanego punktu końcowego. Za pierwszym razem, 24 godziny po infekcji, lekko przechyl płytkę.Następnie, używając sterylnej pipety transferowej, aspiruj płyn zawierający kulturę Candida albicans i delikatnie wlej go do obszaru studni wolnego od zwierząt, aby wymieszać osiadłą warstwę grzybów. Powtarzaj ten krok pięć do dziesięciu razy w dołku, aby rozbić osiadłą warstwę grzybów, unikając bezpośredniego kontaktu z planariami. Obserwuj osadzanie grzybów na ciemnym tle przed i po etapach ponownego zawieszenia, aby uzyskać najlepszą widoczność.Ponownie zawiesij niezakażone studnie kontrolne w identycznych warunkach. Powtórz ten zabieg po 48 godzinach od zakażenia. Po 72 godzinach od zakażenia przenieś planarie do świeżych studni z dwoma mililitrami czystej wody, minimalizując przenoszenie grzybów poprzez minimalne zużycie płynów.Po przeniesieniu zwierząt usuń całą wodę i zamień ją świeżą, planarialną wodą. Rozpocznij ocenę wyników gospodarza od jednego dnia po zakażeniu i kontynuuj codziennie aż do pożądanego eksperymentalnego punktu końcowego. Ilościowo określ obrażenia gospodarza za pomocą standaryzowanego systemu punktacji od zera do trzech.Trzy dni po zakażeniu delikatnie przenieś planarny na nową płytkę z sześcioma dołkami zawierającą dwa mililitry świeżej wody planariańskiej na odwiert, unikając przy tym przeniesienia pozostałej kultury grzybowej. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopii świetlnej z minimalnym 10-krotnym celem. Zapisuj wyniki gospodarzy za pomocą standaryzowanej tabeli punktacyjnej.Dodatkowo można przeprowadzić immunodymatyczne barwienia przeciw Candida, aby obserwować kolonizację nabłonka gospodarza przez grzyby podczas infekcji i oczyszczania. Kolonizacja nabłonka grzybowego została znacząco zmniejszona o cztery dni po infekcji, a do siedmiu dni po infekcji niemal wszystkie grzyby związane z powierzchnią zostały usunięte w warunkach ID50. Niezakażone grupy kontrolne pozostały całkowicie bezobjawowe.Przy wartości około 7,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, około 30% było bezobjawowych, 50% objawowych, a 20% zmarło. Przy około 8,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, około 30% było bezobjawowych, 20% objawowych, a 50% zmarło. Mediana przeżycia spadła z około 90% (7,0 razy 10) do mocy siedmiu komórek Candida albicans na mililitr, do około 50% (8,0 razy 10), do mocy siedmiu komórek na mililitr oraz do mniej niż 25% (8,5 razy 10), do mocy siedmiu komórek na mililitr.Całkowite przeżywalność wynosiła około 50% u planarian zakażonych dzikim typem Candida albicans przy wynioście około 8,0 razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr, w porównaniu do 100% przeżycia u niezakażonych kontroli. Protokół ten umożliwia badania in vivo dynamiki gospodarz-patogen poprzez integrację obrazowania i metod molekularnych w genetycznie rozpracowywalnym gospodarzu. Przyszłe zastosowania obejmują wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutacji, badania porównawcze gatunków mikroorganizmów oraz adaptację do testów toksykologii i skuteczności leków.

an-optimized-protocol-for-candida-albicans-infection-schmidtea

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano kluczowe techniki stosowane w ocenie zapalenia pochwy spowodowanego przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwalają na szybkie pobranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą posłużyć do stworzenia modeli mysich innych chorób dolnych dróg rodnych u samic.

Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Test ex vivo opisany w tym badaniu z wykorzystaniem ekstraktów homogenatu jelitowego i barwienia immunofluorescencyjnego stanowi nowatorską metodę badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Metoda ta może być wykorzystana do badania sygnałów środowiskowych regulujących przemianę morfogenetyczną w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Poznaj zoptymalizowany protokół zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Metoda umożliwia analizę in vivo z wysoką przepustowością.

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Przeglądaj więcej filmów