Skuteczną i szybką metodę HPLC-QQQ-MS do ilościowego oznaczania alkaloidów tropanowych w roślinach leczniczych
12 czerwca 2026
Niniejsze badanie opracowało metodę chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości połączoną ze spektrometrią mas z potrójnym kwarcykiem (HPLC-QQQ-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określania alkaloidów tropanowych (hioscyjamina, anizodamina, skopolamina) w Anisodus tanguticus. Metoda ta okazała się szybką, dokładną i niezawodną dla analizy wysokowydajnej roślin leczniczych.
Opracowałeś metodę HPLC-QQQ-MS do szybkiej ilościowej analizy trzech głównych alkaloidów tropanowych w Anisodus tanguticus. Konwencjonalne HPLC nie ma wystarczającej czułości na alkaloidy tropanowe. Ta metoda wykorzystuje wysoce czułą spektrometrię masową, aby rozwiązać ten problem.
Na początek dokładnie odważyć 10,0 miligramów standardów odniesienia hioscyaminy, anizodaminy hydrobromku i skopolaminy hydrobromku. Umieść je w osobnej 10-mililitrowej kolbie miareczkowej. Dodaj metanolu klasy chromatograficznej do oznakowanej linii w każdej kolbie miareczkowej.
Rozpuść standardy dokładnie za pomocą leczenia ultradźwiękowym, aby przygotować pojedyncze roztwory macierzyste standardów o stężeniu 1,0 miligrama na mililitr. Następnie przenieś roztwory macierzyste do brązowych butelek reaktywów i przechowuj je w czterech stopniach Celsjusza w ciemności. Aby przygotować mieszany roztwór standardowy o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr, pipetą przenieś 100 mikrolitrów każdego wcześniej przygotowanego roztworu macierzystego do 10-mililitrowej kolby miareczkowej.
Następnie dodaj metanolu klasy chromatograficznej do oznakowanej linii, aby rozcieńczyć roztwór. Następnie wykonaj liofilizację świeżego materiału Sophora flavescens. Następnie za pomocą szybkotłoczni rozdrobni wysuszony materiał do uzyskania jednorodnej mazi.
Przesiej proszek przez standardową sitę próbkową o średnicy 0,25 milimetra. Dokładnie odważyć 20 miligramów przesiewanego proszku. Przenieś go do 100-mililitrowej kolby miareczkowej i dodaj metanolu klasy chromatograficznej tuż poniżej oznakowanej linii.
Następnie wykonaj ekstrakcję ultradźwiękową w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usuń kolbę miarecznikową i pozwól, aby ostygła do 25 stopni Celsjusza w temperaturze pokojowej. Dodaj metanolu klasy chromatograficznej do oznakowanej linii 100 mililitrów i wiruj, aby wymieszać przez dwie minuty.
Następnie pipetą przenieś jeden mililitr przygotowanego ekstraktu do 100-mililitrowej kolby miareczkowej. Dodaj metanolu do oznakowanej linii. Dobrze wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać i uzyskać roztwór macierzysty do wstrzyknięcia HPLC.
Do filtracji próbki przygotuj jednomililitrową igłę bez igły do pojedynczego użytku i 0,22 mikrometrową mikroporowatą membranę fazy organicznej. Zasysaj 1,2 mililitra roztworu macierzystego do wstrzyknięcia do strzykawki i przefiltruj roztwór, powoli przesuwając go przez membranę. Zbierz filtratem do dwumilitrowego pojemniczka próbki z wewnętrznym wkładem i szczelnie zamknij pojemnik korkową zamknięciem.
Przygotuj fazę ruchomą A, mierząc 1000 mililitrów ultraczystej wody. Dodaj 1,0 mililitra chromatograficznego kwasu mrówkowego i mieszaj jednolicie za pomocą miksera magnetycznego przez 10 minut. Następnie przygotuj fazę ruchomą B, używając bezpośrednio metanolu klasy chromatograficznej bez dodatkowego traktowania.
Odgazuj fazy ruchome A i B na 40 kilohercach przez 15 minut za pomocą oddzielnych urządzeń do degazacji ultradźwiękowej. Podłącz odgazowaną fazę ruchomą w oddzielnych butelkach rozpuszczalników do odpowiednich linii A i B systemu HPLC. Do separacji chromatograficznej użyj kolumny C18.
Równoważ kolumnę metanolu i wodą w proporcji 80 do 20 przez 30 minut przy przepływie 0,3 mililitra na minutę. Ustaw temperaturę pieca kolumny na 30 stopni Celsjusza i nagrzewaj wstępnie przez 10 minut. Następnie ustaw prędkość przepływu na 0,60 mililitra na minutę, objętość wstrzyknięcia na dwa mikrolitrów, a długość fali detekcji na 210 nanometrów.
Następnie ustaw program elucji gradientowej z prezentowanymi warunkami. Wykonaj wykrywanie spektrometryczne mas za pomocą potrójnego spektrometru mas wyposażonego w elektrorozpylacz pracujący w trybie dodatniego jonizowania. Ustaw ciśnienie rozpylacza na 15 funtów na cal kwadratowy, napięcie kapilarkowe na 4 000 woltów, temperaturę gazu na 300 stopni Celsjusza i przepływ gazu na 11 litrów na minutę.
Następnie ustaw parametry dla wielu par izotopów reakcji wielokrotnych. Aby zidentyfikować jony prekursorowe, bezpośrednio wtryskuj pojedyncze roztwory standardowe w trybie skanowania MS2. Po walidacji metody wykonaj nabywanie danych w trybie wielokrotnego monitorowania reakcji.
Użyj zoptymalizowanych parametrów, w tym jonów prekursorowych, przejść jonów produktu, napięcia fragmentora i energii zderzeniowej dla każdego analitu, jak przedstawiono tutaj. Uruchom oprogramowanie do analizy jakościowej. Wybierz plik i wybierz import danych, aby zaimportować wszystkie zebrane pliki danych.
Sprawdź symetrię szczytu i spójność czasu retencji docelowych szczytów w każdym wyciągniętym chromatogramie jonów. W module ilościowym wybierz przejście MRM. Wprowadź pary jonów prekursorowych i produktowych dla każdego składnika i wyciągnij odpowiednie chromatogramy jonów wyciągniętych.
Oblicz powierzchnię szczytu do analizy ilościowej. Wszystkie trzy docelowe alkaloidy tropanowe zostały pomyślnie oddzielone w ciągu 20 minut w zoptymalizowanych warunkach HPLC. Rozdzielczość między skopolaminą i anizodaminą wynosiła 8,67
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia rzetelny protokół analityczny do szybkiego i dokładnego oznaczania ilości trzech głównych alkaloidów tropanowych — hioscyjaminy, anisodaminy i skopolaminy — w Anisodus tanguticus, kluczowej tybetańskiej roślinie leczniczej. Dzięki zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z potrójną spektrometrią mas (HPLC-QQQ-MS), metoda ta pozwala pokonać ograniczenia czułości konwencjonalnej HPLC i umożliwia precyzyjną identyfikację oraz oznaczanie ilości tych farmakologicznie istotnych związków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia analityczna
- Fitochemia
- Badania nad roślinami leczniczymi
Wstęp
- Anisodus tanguticus jest ceniony ze względu na zawarte w nim alkaloidy tropanowe, które wykazują znaczące działanie przeciwbólowe i uspokajające.
- Skład chemiczny tej rośliny jest złożony, a wiele jej składników nie zostało jeszcze poddanych analizie strukturalnej.
- Tradycyjne metody HPLC charakteryzują się niewystarczającą czułością i specyficznością w odniesieniu do alkaloidów tropanowych.
- Precyzyjna identyfikacja i oznaczanie ilościowe tych związków są niezbędne do ich zastosowania leczniczego oraz w celu kontroli jakości.
Cel badania
- Opracowanie czułej i niezawodnej metody HPLC-QQQ-MS do oznaczania ilościowego hyoscyjaminy, anisodaminy i skopolaminy w A. tanguticus.
- Walidacja precyzji, dokładności i przydatności metody do analiz wysokoprzepustowych.
- Zapewnienie zestandaryzowanego schematu przygotowania próbek i analizy instrumentalnej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie standardów odniesienia i ekstraktów roślinnych przy użyciu metanolu i obróbki ultradźwiękowej.
- Filtracja próbek przez membrany 0,22 μm i rozdział chromatograficzny na kolumnie C18.
- Elucja gradientowa z wykorzystaniem metanolu i wody z dodatkiem kwasu mrówkowego jako faz ruchomych.
- Detekcja i kwantyfikacja przy użyciu potrójnej spektrometrii mas z detektorem quadrupole w trybie dodatkowej jonizacji przez rozpylanie elektrospray i monitorowaniu wielu reakcji (MRM).
- Analiza danych w celu identyfikacji piku, weryfikacji spójności czasu retencji oraz ilościowego obliczenia zawartości alkaloidów.
Główne wyniki
- Wszystkie trzy docelowe alkaloidy zostały rozdzielone do linii bazowej w czasie 20 minut w zoptymalizowanych warunkach HPLC.
- Wartości rozdzielczości między analitykami znacznie przekroczyły kryterium linii bazowej (np. 8,67 i 11,58).
- Dla wszystkich analityków zaobserwowano doskonałą liniowość (współczynniki korelacji >0,99) w badanym zakresie stężeń.
- Średnie odzyski wyniosły 99,56%–101,44% przy niskich względnych odchyleniach standardowych (1,85%–2,35%).
- Analiza ilościowa 10 próbek roślin wykazała zmienną zawartość alkaloidów, przy czym hioscyjamina i skopolamina osiągnęły najwyższe stężenia w określonych próbkach.
Wnioski
- Metoda HPLC-QQQ-MS jest szybka, czuła i dokładna w oznaczaniu ilości alkaloidów tropanowych w A. tanguticus.
- Protokół ten zapewnia wysoką powtarzalność i nadaje się do zastosowań wysokoprzepustowych.
- Podejście to można rozszerzyć na analizę innych metabolitów w A. tanguticus oraz podobnych roślinach leczniczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza bioaktywnych alkaloidów w złożonych matrycach roślin leczniczych ma kluczowe znaczenie dla wczesnych etapów odkrywania leków oraz kontroli jakości. Metoda HPLC-QQQ-MS umożliwia szybkie, czułe i powtarzalne oznaczanie ilościowe alkaloidów tropanowych, co bezpośrednio wspiera walidację celu oraz selekcję związków w procesach badawczo-rozwojowych w dziedzinie fitochemii. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną i usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio terapeutyków pochodzenia naturalnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną kwantyfikację alkaloidów istotnych farmakologicznie w celu walidacji celu opartej na hipotezach.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie obecności i zawartości związku w materiale źródłowym.
- Ułatwia selekcję portfolio poprzez dostarczenie danych ilościowych do priorytetyzacji związków.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne przygotowanie próbek oraz przepływy analityczne dla dalszych badań przesiewowych.
- Dostarcza wysokorozdzielcze, ilościowe wyniki niezbędne do kalibracji i walidacji testów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę zmienności związków w próbkach roślin w celu przygotowania do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica ilościowe profilowanie alkaloidów ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów podczas opracowywania związków wiodących pochodzenia roślinnego.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie spójnego pomiaru związków.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach przedklinicznych poprzez potwierdzenie tożsamości i stężenia analitytu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół HPLC-QQQ-MS integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając solidne podstawy analityczne dla identyfikacji i walidacji związków wiodących pochodzenia naturalnego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez ilościowe oznaczanie kluczowych alkaloidów w złożonych matrycach.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia pomiary o wysokiej czułości oraz uzyskanie wyników statystycznych do porównań międzypróbkowych.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie danych analitycznych do wymagań dotyczących biomarkerów i badań przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, skalowalny schemat postępowania, który można zaadaptować do innych roślin leczniczych i metabolitów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad produktami naturalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i procedury analityczne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie rzetelnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój związków wiodących pochodzenia roślinnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektrometrii mas oraz opracowywania metod chromatograficznych.
- Wymaga dostępu do aparatury HPLC-QQQ-MS oraz zwalidowanej infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów przygotowania próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych matryc roślinnych przy odpowiedniej optymalizacji.
- Dokładność zależy od ścisłego przestrzegania zwalidowanych procedur i kalibracji instrumentów.
