Name: Ocena sferoidów 3D w badaniach nad transdukcją AAV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj platformę sferoidów 3D do oceny potencjału wirusa AAV i kinetyki ekspresji transgenu. Ta metoda umożliwia ilościową analizę wektorów genowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Mortenowi Seirupowi i Trish Hoang za dostarczenie plazmidu do produkcji nanolucyferazy AAV oraz odczynników do substratu żywego. Projekt ten został wsparty poprzez udział w Programie Udziału w Badaniach ORISE w CBER, U.S. Food and Drug Administration, zarządzanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej pomiędzy Departamentem Energii USA a FDA.

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy usprawnioną platformę 3D in vitro&#160;do rozwoju AAV oraz testowania ich aktywności. Platforma ta wykorzystuje zwiększoną transdukcję, wysoką czułość i lepszą przewidywalność translacyjną dzięki zastosowaniu trójwymiarowej hodowli komórkowej, która bardziej przypomina architekturę ludzkich tkanek. System ten pozwala skutecznie zróżnicować wydajność transdukcji dla poszczególnych serotypów AAV i elementów regulacyjnych, w tym wektorów jednoniciowych i samouzupełniających, w wielu liniach komórkowych. Zauważamy, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych testów 2D, w których wydajność transdukcji jest często definiowana jako procent komórek wykazujących obecność transgenu, system sferoidów 3D nie umożliwia łatwego ilościowego określenia wyników z rozdzielczością pojedynczych komórek. W związku z tym wydajność transdukcji w niniejszej pracy zdefiniowano jako całkowitą intensywność sygnału reporterowego (fluorescencyjnego lub luminescencyjnego), która odzwierciedla połączony wkład proporcji komórek transdukowanych oraz poziomu ekspresji transgenu w każdej komórce. Wysoka czułość sferoidów znacznie ogranicza zapotrzebowanie na duże ilości produktu, co czyni tę metodę kosztowo efektywną, wszechstronną i fizjologicznie istotną w badaniach oraz rozwoju AAV.
Podejście to rozwiązuje kluczowe problemy związane z tradycyjnymi testami hodowli komórkowych 2D, które opierają się na adhezji do sztucznych powierzchni i charakteryzują się brakiem organizacji komórkowej, co może&#160;prowadzić do błędnych przewidywań dotyczących wydajności wektora w warunkach klinicznych. System sferoid 3D lepiej naśladuje strukturę tkanki i wzorce dystrybucji leków, dostarczając danych o zachowaniu wektora, które w większym stopniu odpowiadają rzeczywistym warunkom biologicznym22,23. Protokół wykorzystuje proste płytki o ultra-niskim stopniu adhezji, co sprawia, że jest on łatwo powtarzalny w standardowych warunkach laboratoryjnych.
Ten wszechstronny system może być wykorzystany w testach neutralizacji AAV, do badania penetracji AAV oraz do opracowywania bardziej złożonych eksperymentów z kokulturą w celu zbadania wpływu różnych środowisk komórkowych na transdukcję AAV. Ponadto platformy do wysokoprzepustowego przesiewania leków i wektorów mogą być łatwo zintegrowane z platformą sferoidową, co umożliwia automatyzację i redukcję kosztów w procesach odkrywania wektorów na potrzeby opracowywania bardziej ukierunkowanych produktów.
Główną praktyczną zaletą sferoidów jest ich zdolność do ciągłego wzrostu przez wiele tygodni bez konieczności pasażowania komórek, co umożliwia prowadzenie długoterminowych badań nad aktywnością AAV. Ten stabilny system hodowli utrzymuje istotne oddziaływania międzykomórkowe oraz komponenty macierzy, unikając przerw spowodowanych koniecznością wielokrotnego zbierania komórek, co jest wymagane w hodowlach 2D24. Zachowane środowisko komórkowe wspiera naturalną organizację białek oraz struktury błonowe, które są niezbędne do oceny wiązania AAV i ich wnikania do komórek25.
Choć sferoidy 3D wykazują duży potencjał w ocenie transdukcji AAV, wykazują one również pewne braki translacyjne w porównaniu z modelami in vivo&#160;, co wynika przede wszystkim z ich uproszczonej struktury w stosunku do tkanek natywnych. Sferoidom brakuje kluczowych komponentów fizjologicznych, takich jak układ naczyniowy umożliwiający dostarczanie wektorów, komórki odpornościowe do oceny immunogenności oraz bariery specyficzne dla tkanek, np. bariera krew-mózg, które mogą znacząco wpływać na skuteczność AAV26. Ograniczenia te wskazują, że sferoidy, mimo zapewnienia pośredniego poziomu złożoności między konwencjonalnymi kulturami 2D a modelami zwierzęcymi in vivo, pozostają niewystarczające do pełnego odtworzenia mikrośrodowiska fizjologicznego niezbędnego do kompleksowej oceny AAV.
Przedstawiony tutaj protokół tworzenia sferoidów opisuje pojedynczy typ komórek. Protokół ten można rozwinąć tak, aby obejmował 2–3 dodatkowe typy komórek, które agregują w podstawową strukturę trójwymiarową. Bardziej złożone modele 3D, takie jak organoidy lub układy mikroprzepływowe, są systemami wielokomórkowymi, które odtwarzają różnorodność komórkową i organizację konkretnych narządów, zawierając 10 lub więcej różnych typów komórek ułożonych w wzory przypominające tkankę. Tak zaawansowane organoidy 3D mogą obejmować wiele komórek27, kultury osadzone w hydrożelu, techniki wiszącej kropli oraz platformy mikroprzepływowe11,27,28. Chociaż metody te zapewniają bardziej złożoną architekturę tkanki, co mogłoby pomóc w pogłębieniu zrozumienia biologii AAV, zazwyczaj wymagają one bardziej specjalistycznych odczynników, sprzętu oraz znacznej wiedzy technicznej. Z drugiej strony sferoidy 3D tworzone na płytkach o ultra-niskim przywieraniu są znacznie prostsze i odpowiednie dla wielu laboratoriów ze względu na ich opłacalność i powtarzalność.
Kluczowe kroki dla skutecznej realizacji tego protokołu obejmują utrzymanie wysokiej żywotności komórek, ponieważ uszkodzone komórki mogą upośledzić tworzenie sferoidów i wydajność transdukcji. Stosowanie płytek o ultra-niskiej adhezji oraz optymalizacja wirowania są również krytyczne dla uzyskania zwartości sferoidów. Optymalizacja MOI dla każdego typu komórek i serotypu AAV jest niezbędna, aby uniknąć słabych sygnałów lub nasycenia. Wybór odpowiedniej metody detekcji jest również kluczowy, szczególnie w przypadku analiz kinetycznych, gdzie wymagana jest kompatybilność z systemami do ciągłego obrazowania żywych komórek. Istotne dla dokładnej interpretacji transdukcji AAV w sferoidach 3D są również następujące kwestie techniczne.
Słaby lub brak sygnału transdukcji może wynikać z niskiego miana wirusa, nieoptymalnego MOI lub niewystarczającego czasu inkubacji; można temu zaradzić poprzez weryfikację mian wirusa, optymalizację MOI oraz wydłużenie czasu inkubacji (zazwyczaj 3–5 dni). Słabe sygnały fluorescencyjne lub luminescencyjne mogą odzwierciedlać niską ekspresję transgenu lub ograniczoną penetrację odczynników wewnątrz struktury 3D, co można poprawić poprzez optymalizację ustawień ekspozycji lub zapewnienie dodatkowego czasu na dyfuzję substratu. Poważnym wyzwaniem w niektórych liniach komórkowych, takich jak komórki HeLa, jest autofluorescencja, która może prowadzić do wysokiego sygnału tła i zmniejszonej czułości w testach opartych na fluorescencji. Aby wyeliminować to ograniczenie, zastosowaliśmy system reporterowy nanolucyferazy oparty na luminescencji, który zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu i umożliwia dokładniejszą detekcję transdukcji w tle autofluorescencyjnym. Ponadto sygnał tła może wynikać z niewłaściwego progu odcięcia lub fluorescencji związanej z medium i powinien być kontrolowany przy użyciu studzienek niepoddanych działaniu wirusa (MOI = 0) w celu określenia poziomów bazowych. Wreszcie, przy wysokich wartościach MOI może wystąpić nasycenie sygnału z powodu nadmiernej ilości wprowadzonego wirusa lub ograniczeń detektora; można to zniwelować poprzez zmniejszenie zakresu MOI i optymalizację ustawień ekspozycji detektora, aby utrzymać pomiary w liniowym zakresie dynamicznym.
Podsumowując, ta metodologia sferoidów 3D stanowi usprawniony i powtarzalny system oceny transdukcji, potencji i kinetyki AAV. Dzięki wypełnieniu luki między konwencjonalnymi analizami 2D a badaniami in vivo, metoda ta umożliwia bardziej świadome opracowywanie wektorów i wspiera rozwój istotnych klinicznie strategii terapii genowej.

Wektory AAV stały się jednym z preferowanych systemów dostarczania genów do zastosowań in vivo ze względu na ich profil bezpieczeństwa oraz zdolność do zapewnienia trwałej ekspresji genów1. Terapia genowa z użyciem AAV odnosi sukcesy w leczeniu wielu rzadkich schorzeń, a w procesie rozwoju znajduje się setki produktów2. Ponadto nowe zastosowania obejmują dostarczanie in vivo komponentów do edycji genomu, takich jak Cas9, co daje ogromny potencjał w leczeniu wskazań trudnych do terapeutycznego opanowania3. Kluczowe wyzwania rozwojowe obejmują wysokie koszty produkcji oraz ograniczoną zdolność prognostyczną obecnych testów in vitro w określaniu jakości produktu i skuteczności klinicznej4.
Postęp w terapii z wykorzystaniem AAV jest zasadniczo ograniczony przez brak predykcyjnych, zestandaryzowanych testów aktywności, które mogłyby dokładnie przewidzieć wyniki kliniczne4,5. Testy te stanowią krytyczny element procesu rozwoju, ponieważ są wykorzystywane w wielu celach, w tym do przesiewania bibliotek zmodyfikowanych wektorów, optymalizacji modyfikacji kapsydów w celu poprawy celowania oraz oceny tropizmu specyficznego dla tkanek. Służą one również do charakterystyki wpływu sekwencji regulacyjnych na ekspresję transgenu6. Poza wyborem kandydatów, testy transdukcji AAV wspierają również kluczową kontrolę jakości produkcji poprzez testy potencji stosowane podczas uwalniania partii, badań porównawczych partii oraz ocen stabilności6,7.
Wyzwanie naukowe polega na opracowaniu testów, które oddają złożoność interakcji między wektorem a gospodarzem, zachowując jednocześnie praktyczną wykonalność w rutynowym zastosowaniu7,8. Obecne podejścia obejmują wykorzystanie unieśmiertelnionych linii komórkowych reprezentujących organ docelowy w tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kulturach monowarstwowych. Warunki hodowlane te nie posiadają odpowiedniej istotności fizjologicznej i wymagają stosowania wysokich dawek leków. Tworzy to znaczną lukę między przewidywaniami laboratoryjnymi a możliwością przełożenia wyników na praktykę kliniczną. Nowoczesne, modyfikowane linie komórkowe, takie jak systemy z nadekspresją AAVR lub aktywowane za pomocą CRISPR, stanowią istotny postęp, lecz nie odtwarzają trójwymiarowej architektury oraz interakcji z macierzą pozakomórkową charakterystycznych dla tkanek natywnych9,10,11. Modele następnej generacji, które lepiej symulują mikrośrodowiska in vivo, mogłyby zniwelować tę lukę translacyjną12,13,14.
Opracowaliśmy niedawno system sferoid 3D zoptymalizowany pod kątem transdukcji AAV, aby poprawić translacyjność testów transdukcji AAV. System ten znacząco zwiększa wydajność transdukcji AAV w wielu liniach komórkowych i serotypach AAV w porównaniu do standardowych testów 2D. Oprócz poprawionej czułości i mniejszego zużycia produktu wykorzystywanego w analizie, modele te stanowią udoskonalenie względem monowarstw 2D, zapewniając realistyczne oddziaływania międzykomórkowe, które zmieniają się w zależności od lokalizacji komórki w obrębie sferoidy. Umożliwiają one również rzetelne badanie przenikania leków, które symuluje rzeczywiste warunki w organach11,15,16. Co więcej, podejście wykorzystujące sferoidy oferuje praktyczne zalety w stosunku do bardziej złożonych systemów organoidów lub kokultur, ponieważ wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i nie wymaga specjalistycznych pożywek ani rusztowań. Ta prostota zapewnia powtarzalność i skalowalność, dzięki czemu system jest odpowiedni do rutynowych testów terapii genowej i procesów opracowywania wektorów17.
Ta platforma sferoidów 3D jest szczególnie odpowiednia do zastosowań wymagających czułej detekcji transdukcji AAV przy niskich dawkach oraz porównawczej oceny projektów genomów wektorowych. Wspiera ona również ocenę tropizmu zależnego od serotypu. Jest ona szczególnie korzystna dla linii komórkowych o stosunkowo niskiej wydajności transdukcji, które wymagają wysokich dawek AAV w konwencjonalnych kulturach 2D. W takich kontekstach zwiększona czułość i lepsza relewancja fizjologiczna platformy 3D mają krytyczne znaczenie. Jednak system ten może być mniej odpowiedni dla badań wymagających komponentów odpornościowych, dostarczania naczyniowego lub pełnej złożoności tkankowej. Wynika to z faktu, że sferoidy nie odtwarzają w pełni środowiska in vivo&#160;.
Przedstawiamy zatem prosty protokół tworzenia sferoid 3D zoptymalizowany pod kątem testów transdukcji AAV, z dwoma krytycznymi i komplementarnymi parametrami pomiarowymi: wydajnością transdukcji (zdefiniowaną tutaj jako całkowity sygnał reportera na sferoidę) oraz kinetyką transdukcji. Metoda ta stanowi efektywną kosztowo, fizjologicznie istotną i informacyjną platformę do oceny potencjału AAV, projektowania wektorów oraz testów neutralizacji.

<table><tbody><tr><td>Inkubator 37°C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Standardowe warunki hodowli</td></tr><tr><td>Komórki A375</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Plazmid AAV1</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>Plazmid AAV2</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>Plazmid AAV5</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>Plazmid AAV8</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>Plazmid AAV9</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>Czytnik płytek BioTek GEN5</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Pomiar końcowy fluorescencji lub luminescencji</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Utrzymanie zawiesiny sferoidów</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym do hodowli komórkowych (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS do płukania komórek</td></tr><tr><td>DMEM z wysoką zawartością glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Kompletna pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Zewnątrzkomórkowy inhibitor NanoLuc&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Wygasza sygnał Nanoluc&amp;reg; pochodzący ze środowiska zewnątrzkomórkowego&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Dostarczanie czynników wzrostu</td></tr><tr><td>Komórki HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Komórki HEP3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Komórki HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Komórki Huh7</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Monitorowanie tworzenia i wzrostu sferoidów</td></tr><tr><td>Obrazownik IVIS Spectrum</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Pomiar końcowy luminescencji</td></tr><tr><td>Test Nano-Glo&amp;reg; Live Cell Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Luminiscencyjny odczynnik podłoża do detekcji żywych komórek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Zapobieganie kontaminacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowej T75 z wentylacją</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Kolby do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Enzymatyczne odrywanie komórek</td></tr><tr><td>Płytki o ultra-niskiej adhezji</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Zapobieganie adhezji komórek w celu wspomagania tworzenia sferoidów</td></tr></tbody></table>

ocena sferoidów 3d w badaniach nad transdukcją aav

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) są silnymi wektorami stosowanymi do dostarczania genów w produktach terapii genowej. Ich opracowanie wymaga systemów in vitro&#160;, które potrafią wiarygodnie wykrywać różnice w konstrukcji wektora, wydajności serotypów, sile elementów regulacyjnych oraz kinetyce ekspresji. Systemy te muszą również wspierać takie zastosowania, jak ocena potencji i optymalizacja wektorów. W niniejszej pracy opisujemy usprawnioną trójwymiarową platformę sferoidalną, zoptymalizowaną pod kątem oceny potencji AAV, kinetyki ekspresji transgenu oraz wydajności transdukcji specyficznej dla serotypu w różnych liniach komórkowych. Jednorodne sferoidy są generowane z wykorzystaniem płytek o ultra-niskiej adhezji i utrzymywane w warunkach zapewniających stabilną architekturę oraz długoterminowe obrazowanie. Po transdukcji AAV odczyty fluorescencyjne lub luminescencyjne są monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek. Umożliwia to ilościową ocenę sygnału raportującego, odpowiedzi na dawkę, aktywności elementów regulacyjnych oraz czasu wystąpienia efektu poprzez ciągłe obrazowanie kinetyczne. Platforma ta skutecznie rozróżnia silne i słabe konstrukcje genomu wektora, a także poszczególne serotypy AAV. Metoda ta wykazuje wysoką wydajność zarówno w liniach komórkowych wolno, jak i szybko dzielących się. Wyniki te potwierdzają jej przydatność jako skalowalnego i fizjologicznie istotnego systemu do przedklinicznej oceny i rozwoju terapii genowych.

Trójwymiarowe systemy hodowli sferoidów stanowią udoskonalenie konwencjonalnych modeli 2D w rozwoju terapii genowej z wykorzystaniem AAV. Metodologia ta umożliwia czułą detekcję transdukcji AAV przy niskich dawkach, zwiększoną istotność fizjologiczną oraz stabilne monitorowanie długoterminowe. Platforma ta wspiera ocenę potencji, wysokoprzepustowy screening oraz optymalizację wektorów w różnych liniach komórkowych i serotypach AAV.

Ocena sferoidów 3D w badaniach nad transdukcją AAV

Wirusy adeno-zależne (AAV) są potężnymi wektorami wykorzystywanymi do dostarczania genów w produktach terapii genowej. Ich opracowanie wymaga systemów in vitro, które...

Opracowaliśmy czułą, fizjologicznie istotną platformę sferoidów 3D do oceny aktywności transdukcji AAV oraz poprawy przewidywania wydajności wektora w terapii genowej. Protokół ten ma zastosowanie w ocenie aktywności AAV podczas testów potencji wektora, przesiewu serotypów, optymalizacji transgenu, badań neutralizacji oraz w przedklinicznej terapii genowej in vitro.W pierwszej kolejności hoduj komórki w kolbie T75 do momentu osiągnięcia 70% konfluencji w standardowych warunkach. Po trypsynizacji komórek przygotuj rozcieńczenie 1:10 do rutynowego pasażowania. Inkubuj komórki ponownie, aż osiągną 70% konfluencji, a następnie je zbierz. Po ocenie żywotności komórek dokładnie pipetuj zawiesinę komórkową, aby zapewnić jej dobre wymieszanie. Wykonaj dwukrotne rozcieńczenia seryjne komórek na 96-dołkowej płytce o ultra-niskim wiązaniu (ultra-low attachment), zaczynając od 1 × 10⁴ komórek na dołek w 200 µL. Zgodnie z przedstawionym schematem eksperymentalnym, dodaj 1 objętość pożywki kompletnej do wszystkich rzędów z wyjątkiem rzędu górnego. Następnie w rzędzie górnym dodaj dwie objętości zawiesiny o stężeniu 1 × 10⁴ komórek na dołek. Wykonaj rozcieńczenie seryjne rzędu 1A, dodając jedną objętość z rzędu 1A do rzędu 1B i kontynuuj w ten sam sposób. Wirowarkuj płytkę ultra-low attachment z prędkością 350 ×g przez pięć minut, aby ściągnąć komórki do centrum i wspomóc kontakt międzykomórkowy. Inkubuj w temperaturze 37 °C bez zakłóceń przez 24 do 48 godzin w celu formowania sferoidów. Odczekaj trzy dni, aż średnica osiągnie około 400 µm. Sprawdź jednorodność rozmiaru sferoidów, upewniając się, że komórki zostały równomiernie resuspendowane, a płytki są ustawione płasko. Monitoruj morfologię sferoidów. Wybierz dojrzałe sferoidy wykazujące silną adhezję międzykomórkową, a nie luźne agregaty komórkowe.Po odwirowaniu zawiesin komórkowych przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C wyposażonego w urządzenie do obrazowania żywych komórek. Zaloguj się do oprogramowania akwizycyjnego. Wybierz opcję Schedule to acquire (Harmonogram akwizycji) oraz Scan on schedule (Skanuj według harmonogramu), a następnie wybierz Create vessel (Utwórz naczynie) i New (Nowy). Następnie wybierz typ skanowania (scan type) i zaznacz spheroid (sferoid). Wybierz interesujące kanały. Zaznacz phase (fazowy) z bright field (jasnym polem). Następnie wybierz zielony lub czerwony. Ustaw pożągane powiększenie na 10x. Wybierz model płytki oraz jej pozycję w szufladzie. Zaznacz studzienki do obrazowania i wprowadź nazwę eksperymentu. W ustawieniach analizy wybierz Differ analysis until later (Odrocz analizę do późniejszego czasu). Ustaw dodawanie skanów co sześć godzin i zaznacz skanowanie w trybie ciągłym. Codziennie sprawdzaj wzrost sferoidów, logując się do oprogramowania do obrazowania. Wybierz View recent scans (Wyświetl ostatnie skany) i dwukrotnie kliknij pożądany eksperyment. Po wybraniu Brightfield (Jasne pole) w panelu kanałów obrazowania, użyj funkcji Measure image (Pomiar obrazu), aby zmierzyć średnice sferoidów. Wyjmij płytkę w dniu optymalnego uformowania sferoidów i wykorzystaj ją do transdukcji wirusem towarzyszącym adenowirusom (AAV).Przygotować płytkę 96-dołkową z okrągłym dnem zawierającą 297 µL DMEM uzupełnionego o 2% FBS, bez antybiotyków. Do medium dodać 33 µL zapasu AAV, aby uzyskać początkową wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 1 × 10⁶. Następnie przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 33 µL każdego rozcieńczenia do 297 µL medium. Odessać całe medium z wcześniej przygotowanej płytki ze sferoidami za pomocą pipety wielokanałowej. Przenieść 100 µL AAV o pożądanym MOI z płytki z rozcieńczeniami na płytkę z próbkami za pomocą pipety wielokanałowej. Umieścić płytki z powrotem w urządzeniu do obrazowania. Rozpocząć monitorowanie transdukcji poprzez śledzenie intensywności zielonej fluorescencji przez 72 godziny. Co trzy dni dodawać 100 µL kompletnego DMEM do każdego dołka w celu uzupełnienia składników odżywczych. Umieścić płytkę z powrotem w urządzeniu do obrazowania i rozpocząć rejestrowanie wydajności transdukcji co sześć godzin. Przeanalizować dane, tworząc definicję analizy specyficzną dla badanych komórek i genów reporterowych. Przeprowadzić analizę końcową w oparciu o odczyty fluorescencji. W podobny sposób przeprowadzić transdukcję AAV w sferoidach 3D z reporterami luminescencyjnymi, a następnie wykonać analizę transdukcji przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego.Każda linia komórkowa wykazywała odmienne cechy morfologiczne i różny stopień zagęszczenia po trzech dniach od wysiewu. Linie komórek wątroby tworzyły bardziej zwarte i gęstsze sferoidy niż pozostałe linie komórkowe. Komórki HEK293T tworzyły bardzo okrągłe struktury sferyczne z wyraźnym rdzeniem nekrotycznym. Komórki A375 tworzyły nieregularne agregaty komórkowe. Sferoidy były wysoce podatne na transdukcję AAV, przy czym silną transdukcję w odniesieniu do samouzupełniającego GFP wykryto przy bardzo niskich mianach AAV w różnych liniach komórkowych. Transdukcja sferoidów jednoniciowym GFP była obserwowana na niższym poziomie niż w przypadku GFP samouzupełniającego. W komórkach HEK293T przy MOI rzędu 10⁶ zaobserwowano 100-krotną różnicę w względnej fluorescencji między transgenami samouzupełniającymi a jednoniciowymi. W komórkach HEP3B zaobserwowano trzykrotną różnicę w względnej fluorescencji między transgenami samouzupełniającymi a jednoniciowymi. Wszystkie cztery serotypy AAV zostały z sukcesem wykryte zarówno za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek, jak i systemu obrazowania żywych komórek. Najwyższą wydajność transdukcji wykazał AAV2, a następnie AAV1 w obu liniach komórkowych. Wszystkie serotypy AAV wykazały wydajną transdukcję w systemie luminescencyjnym, co umożliwiło precyzyjne rozróżnienie wydajności transdukcji. AAV2 był najskuteczniejszym serotypem w sferoidach HeLa, natomiast AAV9 wykazywał najniższą wydajność transdukcji. Transdukcja samouzupełniającego GFP przez AAV2 była wykrywalna przy poziomach infekcji tak niskich jak 10¹, z wyraźnym wzrostem sygnału po około 34 godzinach w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Sygnał jednoniciowego GFP AAV2 był słabszy i pojawiał się wolniej niż sygnał GFP samouzupełniającego.Kluczowym wyzwaniem podczas realizacji tego protokołu jest utrzymanie wysokiej żywotności komórek, otrzymanie jednolitych i zwartych sferoidów oraz optymalizacja dawkowania AAV dla każdego typu komórek i serotypu. Protokół ten umożliwia ocenę ekspresji i funkcjonalności transgenu za pomocą RT-qPCR, Western blottingu, testów ELISA i testów aktywności somatycznej, a także analizę kinetyki czasu wystąpienia efektu. W przyszłych badaniach można zastosować współhodowle, organoidy, mikrofluidykę, komórki odpornościowe lub układ naczyniowy, aby lepiej odwzorować mikrośrodowisko in vivo.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.<br...

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Poznaj platformę sferoidów 3D do oceny potencjału wirusa AAV i kinetyki ekspresji transgenu. Ta metoda umożliwia ilościową analizę wektorów genowych w czasie rzeczywistym.

Ocena sferoidów 3D w badaniach nad transdukcją AAV

Przeglądaj więcej filmów