Name: Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę dwukolorowej fotometrii światłowodowej do równoczesnej rejestracji aktywności astrocytów i neuronów w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pani Jia Lou jest wymieniana za wsparcie techniczne, a Sai Te Xin Si (narzędzie AI) jest wymieniana za pomoc w redagowaniu językowym. Ta praca otrzymała wsparcie od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82371485, 82588301, 32400932) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing w Chinach (grant nr CSTB2024NSCQ-JQX0024, 2024NSCQ-MSX1104).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania Uniwersytetu Trzeciej Akademii Medycznej Wojskowej (Numer zgody etycznej na eksperymenty na zwierzętach: AMUWEC20230126) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Uniwersytetu Trzeciej Akademii Medycznej Wojskowej ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, aby zapewnić etyczne traktowanie zwierząt. Stosowany sprzęt i reagenty są wymienione w Tabeli Materiałów.
Aby zapewnić bezpieczeństwo eksperymentatora, wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem żywych zwierząt i wektorów wirusowych były wykonywane przy użyciu odzieży ochronnej, sterylnych rękawic i maseczki. Wszystkie instrumenty były dokładnie sterylizowane przed użyciem, a powierzchnie eksperymentalne były czyszczone 70% etanolem przed i po każdym eksperymencie. Pozostałe materiały były usuwane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów. Wszystkie reagenty i sprzęt były obsługiwane tak, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą lub oczami.
1. Przygotowanie zwierząt i manipulacja wirusami
<ol>
	<li>Hodowla 4-miesięcznych myszy C57BL/6 (obu płci) w cyklu 12 h światło/ciemność z ad libitum dostępem do pokarmu i wody.</li>
	<li>Roztapianie alikwotów AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f lub AAV9-hSyn-jRGECO1a na lodzie w temperaturze 0–4 °C bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Podłączenie ściągniętej szklanej mikropipety (średnica końcówki 15–25 μm) do strzykawki i zamontowanie jej na pompie mikroiniekcyjnej.</li>
	<li>Umieszczenie myszy na sterylnej platformie chirurgicznej i dezynfekcja wszystkich instrumentów 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Sterylotaktyczne wstrzyknięcie wirusa
UWAGA: W tym badaniu zastosowano dwuetapową strategię wstrzyknięcia wirusa. W obecnych warunkach eksperymentalnych strategia ta może być niezawodnie i stabilnie wdrożona, a wynikający wzorzec ekspresji jest zgodny z oczekiwanym profilem promotora specyficznego dla typu komórek.
<ol>
	<li>Pierwsze zabieganie chirurgiczne: Wstrzyknięcie AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f (Tytuł: 7 × 1012 vg/mL) dla astrocytów
	<ol>
		<li>Wprowadzenie znieczulenia za pomocą 3% izofluranu w komorze, a następnie utrzymanie znieczulenia za pomocą 0,8–1,2% izofluranu przez nos (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).</li>
		<li>Utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37–38 °C za pomocą podgrzewanego podkładu i zastosowanie maści okulistycznej w celu zapobiegnięcia wysychaniu rogówki.</li>
		<li>Usunięcie włosów ze skóry głowy i dokładne zdezynfekowanie skóry. Wykonanie nacięcia środkowego, aby odsłonić powierzchnię czaszki.</li>
		<li>Umieszczenie głowy w sterylotaktycznym instrumencie, dostosowanie szwu bregma i lambda do tej samej płaszczyzny poziomej, a następnie dalsze dostosowanie ramy, aby upewnić się, że punkty 2 mm bocznie od bregma po obu stronach są na jednej wysokości.</li>
		<li>Identyfikacja współrzędnych stereotaktycznych za pomocą atlasu mózgu myszy, przy czym bregma jest punktem odniesienia. 
		mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV –3,0 mm 
		CA1: AP –2,1 mm, ML +1,6 mm, DV –1,2 mm 
		MEC: AP –4,5 mm, ML –2,9 mm, DV –2,0 mm</li>
		<li>Wykonanie otworu w czaszce o średnicy 0,6 mm powyżej każdego miejsca, utrzymanie otoczenia rdzeniowego wilgotne i nienaruszone po otwarciu czaszki.</li>
		<li>Wypełnienie wirusa GCaMP6f do strzykawki z prędkością 5 nL/s i zainstalowanie strzykawki w ramieniu stereotaktycznym.</li>
		<li>Powolne obniżanie pipety, wstrzyknięcie 150 nL z prędkością 0,6 nL/s, utrzymanie przez 8 min, a następnie wycofanie z prędkością 0,1 mm/s. Powtórzenie tej procedury dla wszystkich regionów.</li>
		<li>Zamknięcie nacięcia klejem tkankowym i pozostawienie na 2 tygodnie w celu wystąpienia ekspresji wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugie zabieganie chirurgiczne: Wstrzyknięcie AAV9-hSyn-jRGECO1a (Tytuł: 1 × 1013 vg/mL) dla neuronów. 
	​UWAGA: Zabieg przeprowadzono 14 dni po pierwszym wstrzyknięciu wirusa.
	<ol>
		<li>Wprowadzenie i utrzymanie znieczulenia zgodnie z opisem powyżej (Krok 2.1.1).</li>
		<li>Utrzymanie temperatury ciała i ochrona oczu.</li>
		<li>Ponowne otwarcie skóry głowy wzdłuż linii środkowej i wyrównanie czaszki. 
		UWAGA: Czaszka została wyrówniana przez wyrównanie bregma i lambda na tej samej płaszczyźnie poziomej.</li>
		<li>Oczyszczenie gruzu tkankowego w tych samych miejscach, w których znajdowały się otwory w czaszce z pierwszego zabiegu, aby odsłonić otoczony rdzeniowym otoczeniami.</li>
		<

<ol><li>Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory%3A+Organization+and+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Psychol%22%5BJournal%5D)">Memory: Organization and Control.</a> Annu Rev Psychol. 68, 19-45 (2017).</li>
<li>Kamatham, P. T., Shukla, R., Khatri, D. K., Vora, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+diagnostics%2C+and+therapeutics+for+Alzheimer%E2%80%99s+disease%3A+Breaking+the+memory+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics for Alzheimer’s disease: Breaking the memory barrier.</a> Ageing Res Rev. 101, 102481(2024).</li>
<li>Graff-Radford, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+atypical+Alzheimer%E2%80%99s+disease+in+the+era+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">New insights into atypical Alzheimer’s disease in the era of biomarkers.</a> Lancet Neurol. 20 (3), 222-234 (2021).</li>
<li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitters+travel+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li>
<li>Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+astrocyte+functions+and+phenotypes+in+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits.</a> Nat Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1276-1284 (2011).</li>
<li>Savtchouk, I., Volterra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmission%3A+Beyond+Black-and-White%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gliotransmission: Beyond Black-and-White.</a> J Neurosci. 38 (1), 14-25 (2018).</li>
<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends Neurosci. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+multi-regional+functional+connectivity+of+astrocyte-neuronal+networks+during+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Mapping multi-regional functional connectivity of astrocyte-neuronal networks during behaviors.</a> Neurophotonics. 11 (4), 045010(2024).</li>
<li>Lines, J., Martin, E. D., Kofuji, P., Aguilar, J., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+modulate+sensory-evoked+neuronal+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Astrocytes modulate sensory-evoked neuronal network activity.</a> Nat Commun. 11 (1), 3689(2020).</li>
<li>Lines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-neuronal+network+interplay+is+disrupted+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-neuronal network interplay is disrupted in Alzheimer’s disease mice.</a> Glia. 70 (2), 368-378 (2022).</li>
<li>Brincat, S. L., Miller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-specific+hippocampal-prefrontal+interactions+during+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frequency-specific hippocampal-prefrontal interactions during associative learning.</a> Nat Neurosci. 18 (4), 576-581 (2015).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nat Neurosci. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrams+and+circuits+crucial+for+systems+consolidation+of+a+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engrams and circuits crucial for systems consolidation of a memory.</a> Science. 356 (6333), 73-78 (2017).</li>
<li>Gonzalo Cogno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minute-scale+oscillatory+sequences+in+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Minute-scale oscillatory sequences in medial entorhinal cortex.</a> Nature. 625 (7994), 338-344 (2024).</li>
<li>Roudi, Y., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid+cells+in+an+inhibitory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grid cells in an inhibitory network.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 639-641 (2014).</li>
<li>Williamson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-associated+astrocyte+ensembles+regulate+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-associated astrocyte ensembles regulate memory recall.</a> Nature. 637 (8045), 478-486 (2025).</li>
<li>Curreli, S., Bonato, J., Romanzi, S., Panzeri, S., Fellin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+encoding+of+spatial+information+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary encoding of spatial information in hippocampal astrocytes.</a> PLoS Biol. 20 (3), e3001530(2022).</li>
<li>Oheim, M., Michael, D. J., Geisbauer, M., Madsen, D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+fluorescence+microscopy+and+other+nonlinear+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation fluorescence microscopy and other nonlinear imaging approaches.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (7), 788-808 (2006).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zhang, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+response+in+host+and+engrafted+astrocytes+of+adult+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sensory response in host and engrafted astrocytes of adult brain in vivo.</a> Glia. 65 (12), 1867-1884 (2017).</li>
<li>Qin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual-cue-dependent+memory+circuit+for+place+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual-cue-dependent memory circuit for place navigation.</a> Neuron. 99 (1), 47-55.e44 (2018).</li>
<li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+corticopontine+circuit+for+initiation+of+urination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A corticopontine circuit for initiation of urination.</a> Nat Neurosci. 21 (11), 1541-1550 (2018).</li>
<li>Mirzayi, P., Shobeiri, P., Kalantari, A., Perry, G., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+Implications+for+Alzheimer%E2%80%99s+disease+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: Implications for Alzheimer’s disease research and therapy.</a> Mol Brain. 15 (1), 20(2022).</li>
<li>Simpson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+fiber%2C+action%21+A+primer+on+in+vivo+fiber+photometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lights, fiber, action! A primer on in vivo fiber photometry.</a> Neuron. 112 (5), 718-739 (2024).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> Elife. 5, 12727(2016).</li>
<li>Serikov, A., Martsishevska, I., Shin, W., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+in+vivo+dual-color+fiber+photometry+in+the+mouse+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for in vivo dual-color fiber photometry in the mouse thalamus.</a> STAR Protoc. 5 (2), 102931(2024).</li>
<li>Gilbert, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+integration+and+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Horizontal integration and cortical dynamics.</a> Neuron. 9 (1), 1-13 (1992).</li>
<li>de Pasquale, F., Corbetta, M., Betti, V., Della Penna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+cores+in+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Cortical cores in network dynamics.</a> Neuroimage. 180 (Pt B), 370-382 (2018).</li>
<li>Suthard, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engram+reactivation+mimics+cellular+signatures+of+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Engram reactivation mimics cellular signatures of fear.</a> Cell Rep. 44 (10), 116409(2025).</li>
<li>Sandoval, K. C., Rychlik, J., Choe, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+hypothalamic+paraventricular+oxytocin+neurons+and+astrocytes+associated+with+social+and+stress+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in hypothalamic paraventricular oxytocin neurons and astrocytes associated with social and stress stimuli.</a> eNeuro. 12 (5), (2025).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Spellman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal-prefrontal+input+supports+spatial+encoding+in+working+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal-prefrontal input supports spatial encoding in working memory.</a> Nature. 522 (7556), 309-314 (2015).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+sheds+new+light+on+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Optogenetics sheds new light on tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomaterials. 227, 119546(2020).</li>
<li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+calcium+dysfunction+causes+early+network+hyperactivity+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Astrocyte calcium dysfunction causes early network hyperactivity in Alzheimer’s disease.</a> Cell Rep. 40 (8), 111280(2022).</li>
<li>Jiménez-Balado, J., Eich, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+dysfunction%2C+neural+network+hyperactivity+and+memory+impairments+in+human+aging+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GABAergic dysfunction, neural network hyperactivity and memory impairments in human aging and Alzheimer’s disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 116, 146-159 (2021).</li>
<li>Lin, R., Guo, Y., Jiang, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+the+study+of+neuronal+cross-organ+regulation%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Technol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for the study of neuronal cross-organ regulation: a narrative review.</a> Adv Technol Neurosci. 1 (2), 166-176 (2024).</li>
<li>Reitman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+links+astrocytic+activity+to+regulation+of+cortical+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine links astrocytic activity to regulation of cortical state.</a> Nat Neurosci. 26 (4), 579-593 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych sporów interesów, finansowych lub innego rodzaju.

W tej pracy opracowano metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności wapniowej komórek astrocytowych i neuronów w wielu obszarach mózgu myszy związanych z pamięcią podczas nauki i zachowań związanych z pamięcią. W odróżnieniu od pojedynczej rejestracji obrazowej regionu28 lub technik elektrofizjologicznych, synchroniczna rejestracja wielo-regionalna rejestruje skoordynowane dynamiki w rozproszonych sieciach pamięci, co czyni ją potężnym narzędziem do badania nauki i pamięci9</sup...

Uczenie się i pamięć to fundamentalne procesy poznawcze, które obejmują zdobywanie, przechowywanie i odzyskiwanie informacji, które są niezbędne do tworzenia adaptacyjnych zachowań. Procesy te leżą u podstaw wielu złożonych funkcji, takich jak nawigacja przestrzenna, rozpoznawanie obiektów, asocjacja kontekstowa i podejmowanie decyzji. Ponadto choroby dysfunkcji poznawczych, w tym choroba Alzheimera, choroba poznawcza związana z wiekiem i urazy mózgu, wykazują nieprawidłowości w tworzeniu pamięci1,2,3. Dlatego też, pełne zrozumienie podstawy neuronowej uczenia się i pamięci wymaga wyjaśnienia dynamicznej interakcji między różnymi typami komórek. Interakcja ta ma miejsce w obrębie i między tymi regionami podczas kodowania i odzyskiwania informacji.
Tradycyjnie uważano, że tworzenie pamięci jest przede wszystkim określone przez aktywność neuronów. Jednak rozległe badania wykazały, że komórki gleju znacząco regulują kodowanie, konsolidację i odzyskiwanie informacji. Osiągają to poprzez modulacje transmisji synaptycznej, regulację pobudliwości neuronów, uwalnianie gliotransmiterów i zapewnienie wsparcia metabolicznego4,5,6,7,8. Komórki gleju dynamicznie współdziałają z neuronami, a dwukierunkowa komunikacja jest na ogół nazywana "siecią komórek glejowych i neuronowych"9,10,11. Dlatego zrozumienie zsynchronizowanych interakcji między komórkami gleju a neuronami jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów komórkowych i sieciowych uczenia się i pamięci.
Uczenie się i pamięć opierają się na dynamicznej integracji informacji w wielu regionach mózgu. Interakcje między komórkami gleju a neuronami nie ograniczają się do lokalnych mikroobwodów, ale rozciągają się na rozproszone regiony mózgu zaangażowane w pamięć, w tym środkową korę przedczołową (mPFC), obszar CA1 hipokampu i środkową korę przedczołową (MEC). mPFC jest zaangażowana w konsolidację pamięci i regulację długotrwałej pamięci; CA1 jest kluczowe dla kodowania i reaktywacji pamięci epizodycznej; a MEC służy jako centrum integracji informacji przestrzennych i multimodalnych, dostarczając istotnych wejść do obwodu hipokampalno-korowego12,13,14,15,16. Rosnące dowody sugerują, że komórki gleju w tych regionach uczestniczą w zsynchronizowanych dynamicznych procesach między regionami wraz z neuronami, odgrywając kluczowe role w przepływie informacji i przejściach stanowych podczas uczenia się i zapamiętywania17,18.
Chociaż zwiększono rozpoznanie synergetycznej funkcji komórek gleju i neuronów w przetwarzaniu pamięci, nadal istnieje znaczny wyzwanie techniczne w jednoczesnym monitorowaniu aktywności wapniowej zarówno w komórkach gleju, jak i w neuronach w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią podczas zachowania wolno poruszających się zwierząt. Obrazowanie dwufotonowe oferuje wysoką rozdzielczość przestrzenną, ale jest ograniczone przez głębokość i fiksację głowy19,20; wielokanałowa elektrofizjologia umożliwia rejestrację z wysoką rozdzielczością czasową, ale brakuje specyficzności typu komórki i nie może rozróżnić sygnałów wapniowych komórek gleju. Dlatego opracowano metodę, która umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów wapniowych komórek gleju i neuronów w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią u myszy poruszających się swobodnie. Genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia (GECI) raportują dynamikę Ca2+ wewnątrzkomórkową poprzez Ca2+-zależne zmiany konformacyjne w CaM/M13, które modulują fluorescencje genetycznie zakodowanych fluoroforów. Dwukolorowe podejścia GECI wykorzystują spektralnie rozdzielne wskaźniki, takie jak zielone i czerwone czujniki wapnia, wraz z promotorami specyficznymi dla typu komórek, aby umożliwić jednoczesne rejestrowanie aktywności Ca2+ komórek gleju i neuronów w tej samej okolicy mózgu. Łącząc dwukolorowych wskaźników GECI specyficznych dla typu komórki (GCaMP6f i jRGECO1a) oraz wielokanałowy system fotometrii światłowodowej, osiągnięto monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności wapniowej w neuronach i komórkach gleju w mPFC, CA1 i MEC. Co więcej, biorąc jako przykład zadanie nowej rozpoznawalności obiektów (NOR), wykazano zsynchronizowaną dynamikę wapniową w różnych regionach mózgu i typach komórek podczas zadań uczenia się. Ta metoda jest rozmnażalnym, niezawodnym i skalowalnym protokołem do badania aktywności zespołów komórek glejowych i neuronowych w różnych regionach mózgu podczas uczenia się i zapamiętywania.

<table><tbody><tr><td>75 RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td>Łączy się z mikropipetą do iniekcji wirusowej</td></tr><tr><td>AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>52925</td><td>Astrocytospecyficzna ekspresja GCaMP6f</td></tr><tr><td>AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a</td><td>Addgene</td><td>100854</td><td>Neuronowy czerwono przesunięty wskaźnik wapnia</td></tr><tr><td>Bepanthen Eye and Nasal Ointment</td><td>Bepanthen</td><td>MA0008</td><td>Zapobiega wysychaniu rogówki</td></tr><tr><td>Bundled optical fibers with ceramic sleeves</td><td>Inper</td><td>BFO-1x3-W1.25</td><td>Łączy zaimplantowane włókna z systemem fotometrii</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Mind Vision</td><td>MV-SUA502C-T</td><td>Wideo zachowań zsynchronizowane z sygnałami wapniowymi</td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>NISSIN</td><td>Super-Bond C&amp;B</td><td>Używany do zamocowania tulejek do czaszki</td></tr><tr><td>Ferrule holder</td><td>Inper</td><td>SCH-1.25</td><td>Przytrzymywanie ceramicznej tulejki bezpiecznie podczas implantacji</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer &amp; Anesthesia system</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-29</td><td>Do indukcji i podtrzymiwania znieczulenia</td></tr><tr><td>Multi-channel fiber photometry system</td><td>RWD Life Science</td><td>R821</td><td>Do dwukolorowego nagrywania</td></tr><tr><td>OFRS software</td><td>RWD Life Science</td><td></td><td>Analiza nagranych sygnałów wapniowych</td></tr><tr><td>Optical fibers</td><td>RWD Life Science</td><td>R-FOC-BL200C-39N</td><td>Zaimplantowane w docelowej części mózgu</td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>RWD Life Science</td><td>68801</td><td>Używany do precyzyjnej iniekcji wirusowej i implantacji włókien</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>788130</td><td>Dostarcza wirusa w kontrolowanych szybkościach</td></tr><tr><td>Tissue glue</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB Vetbond</td><td>Do zamknięcia nacięć</td></tr></tbody></table>

metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

A Dual-Color Fiber Photometry Method for Recording Astrocyte-Neuron Activity Across Multiple Brain Regions During Learning and Memory Behaviors

Uczenie się i pamięć zależą krytycznie od koordynacji między neuronami i astrocytami w różnych obszarach mózgu. Astrocyty modulują transmisję synaptyczną i pobudliwość neuronów, przyczyniając się tym samym do kodowania i konsolidacji informacji w obwodach związanych z pamięcią. Wewnątrz- i międzyregionalne korelacje między astrocytami a neuronami są kluczowe dla zrozumienia zaburzeń pamięci i poznawczych. Jednak jednoczesne monitorowanie aktywności astrocytów i neuronów w wielu regionach podczas zachowania związanego z pamięcią pozostaje technicznie wyzwaniem. Przedstawiono tu metodę, która umożliwia jednoczesne rejestrowanie tych sygnałów wapniowych od astrocytów i neuronów w kilku obszarach związanych z pamięcią. Ta strategia łączy komórkowo-specyficzne dwukolorowe, genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia (GECI), wielokanałowy system fotometrii światłowodowej i zsynchronizowane śledzenie zachowań, aby osiągnąć monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronowej i astrocytowej w środkowym przedczołowym korze (mPFC), obszarze CA1 hipokampu i środkowym korze zakrętu sklepieniowego (MEC). Wyniki reprezentatywne wykazują skoordynowane dynamiki wapnia między regionami i typami komórek podczas zadania rozpoznawania obiektów. Ta metoda zapewnia powtarzalny i wydajny eksperymentalny рамка dla badania interakcji astrocyt–neuron leżących u podstaw procesów uczenia się i pamięci.

Na podstawie opisanej powyżej procedury, wykonano podwójne wielo-stanowiskowe rejestrowanie włókien u myszy C57 w wieku 4 miesięcy, skierowane na mPFC, CA1 i MEC. W niniejszym badaniu zastosowaliśmy dwuetapową strategię wstrzyknięć wirusowych w celu sekwencyjnego wprowadzenia dwóch wskaźników. W naszych warunkach eksperymentalnych, ta strategia może być niezawodnie i stabilnie wdrożona, a wynikający wzorzec ekspresji jest zgodny z oczekiwanym profilem promotora specyficznego dla typu komórki.
...

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Learning and memory depend critically on the coordination between neurons and astrocytes across distributed brain regions. Astrocytes modulate synaptic ...

Ten protokół umożliwia rejestrowanie sygnałów wapnia od neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu podczas zachowań uczenia się i pamięci. Protokół ten można zastosować do badania dynamiki sieci astrocytów-neuronów podczas uczenia się, pamięci i innych zachowań. Aby wykonać pierwszą operację w celu wstrzyknięcia astrocytów, wziąć unieruchomionego mysza i utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 do 38 stopni Celsjusza za pomocą podgrzewanej podkładki.Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Następnie usuń włosy ze skóry głowy i dokładnie wydezynfekuj skórę. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić powierzchnię czaszki.Umieść głowę w urządzeniu stereotaktycznym. Wyrównaj szwy bregma i lambda do tej samej płaszczyzny poziomej i dostosuj ramkę, aby upewnić się, że punkty dwa milimetrów bocznie od bregma po obu stronach są na jednym poziomie. Określ współrzędne stereotaktyczne za pomocą atlasu mózgu myszy, używając bregma jako punktu odniesienia.Wywierć okrągłą kraniotomie o średnicy 0,6 milimetra nad każdym miejscem. Utrzymuj otoczaki mózgowe wilgotne i nienaruszone po otwarciu czaszki. Włóż wirusa GCaMP6f do strzykawki z prędkością pięciu nanolitrów n

a-dual-color-fiber-photometry-method-for-recording-astrocyte-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności neuronalnej w swobodnie poruszającej się myszy za pomocą fotometrii światłowodowej. W tej metodzie neurony w określonym regionie mózgu wyrażają genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia. Bodziec jest stosowany do tego obszaru mózgu, a zależna od bodźca zmiana fluorescencji jest mierzona w celu zidentyfikowania aktywności neuronalnej.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się myszy za pomocą fotometrii światłowodowej

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak implementować i wykonywać zapisy fotometryczne z wieloma włóknami, jak korygować artefakty niezależne od wapnia, oraz ważne kwestie dotyczące obrazowania fotometrycznego dwukolorowego.

Fotometria wielowłóknowa do rejestrowania aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się zwierząt

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj metodę dwukolorowej fotometrii światłowodowej do równoczesnej rejestracji aktywności astrocytów i neuronów w wielu regionach mózgu związanych z pamięcią.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych (Wideo) | JoVE Journal

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Przeglądaj więcej filmów