Name: Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania wielomocysłowego do typowania szczepów Toxoplasma gondii z użyciem technologii nanopore. Protokół umożliwia wykrywanie polimorfizmów SNP i INDEL w genach SAG2 oraz SAG3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych Egiptu & Biuro Kultury i Spraw Edukacyjnych Egiptu w Londynie oraz UKRI MRC (MR/X502947/1). Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com

To the best of our knowledge, this is the first study to use nanopore long-read sequencing to genotype T. gondii from fibroblast cell cultures.
NOTE: This protocol describes the use of T. gondii RH strain genomic DNA as an example. This protocol can be applied to other strains, but the primers used in the PCR amplification step must be adjusted accordingly.
NOTE: To ensure high-quality results, it is important to optimize the protocol at every step. Here, we provide a general protocol, but researchers may need to make adjustments to suit their specific experimental setups.
NOTE: The protocol described here was optimized using Oxford Nanopore Technologies' MinION device. It is expected that similar results can be obtained using other nanopore devices.
1. Biomarker selection
<ol>
	<li>Download genomic sequences of SAG2 and SAG3 in FASTA format from ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app) genome database.</li>
	<li>Perform pairwise sequence alignments using EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).</li>
	<li>Select amplicon regions ≤1,600 base-pairs (bp) to minimize sequencing time and ensure efficient PCR amplification.</li>
	<li>Ensure each region contains informative SNPs or INDEL polymorphisms for strain differentiation.</li>
</ol>
2. Culture and harvesting of Toxoplasma gondii tachyzoites
<ol>
	<li>Maintenance of host cell cultures
	<ol>
		<li>Obtain human foreskin fibroblasts (HFFs) from a certified commercial source and culture them in complete growth medium composed of Dulbecco’s Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin.</li>
		<li>Incubate cultures at 37 °C with 5% CO2 in a humidified incubator.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Maintenance and expansion of parasite lines.
	<ol>
		<li>Infect fibroblast monolayers at 80–90% confluence using tachyzoites at a multiplicity of infection of 1–3 parasites per host cell. For a T25 flask containing approximately 1 × 106 fibroblasts, add 1–3 × 106 tachyzoites.</li>
		<li>Examine cultures daily using an inverted light microscope at 20× or 40× magnification. Identify host cell lysis by observing widespread monolayer disruption. 
		NOTE: Do not use fibroblast cultures beyond passage 20 to avoid culture-related artifacts.</li>
		<li>Harvesting of tachyzoites.
		<ol>
			<li>Collect cultures when ≤90% host cell lysis is visible.</li>
			<li>Centrifuge at 1,300 × g for 10 min at 4 °C.</li>
			<li>Resuspend the pellet in 10 mL sterile phosphate-buffered saline by gentle pipetting, and centrifuge again at 1,300 × g for 10 min at 4 °C. Repeat once more.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Extraction of genomic DNA and amplicon generation
<ol>
	<li>Extract genomic DNA using a silica column-based genomic DNA purification kit7. Elute DNA in 50 µL elution buffer.</li>
	<li>Measure DNA concentration using a microvolume spectrophotometer.</li>
	<li>Store DNA at 4 °C for short-term or –20 °C for long-term storage.</li>
	<li>Prepare PCR reactions using a high-fidelity DNA polymerase master mix, locus-specific primers (Supplementary Table 1), and nuclease-free water.</li>
	<li>Perform PCR amplification using a calibrated thermal cycler under the following cycling conditions: (a) initial denaturation at 98 °C for 30 s, (b) 35 cycles of 98 °C for 10 s; locus-specific annealing: 60 °C for SAG2, 68 °C for SAG3, 30 s; 72 °C for 20 s, (c) Final extension: 72 °C for 2 min.</li>
	<li>Verify PCR products by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.</li>
	<li>Purify PCR products using a column-based PCR and gel extraction purification system according to the manufacturer’s instructions8. Elute DNA in 15–20 µL of elution buffer. 
	NOTE: PCR efficiency and yield may be reduced by low DNA template quality, concentration, or suboptimal reaction conditions. If the amplicon yield is low, verify the DNA template integrity using agarose gel electrophoresis and concentration and purity using a spectrophotometer. PCR annealing temperatures and primer concentrations should also be optimized for the primer pairs used, and the PCR cycle number should be increased as necessary.</li>
</ol>
4. Library preparation for long-read sequencing 
<ol>
	<li>End-repair and dA-tailing
	<ol>
		<li>Thaw all reagents and mix thoroughly by vortex. Dilute the DNA control sample with 10.5 µL of elution buffer during the first use only and keep it on ice. 
		NOTE: Always vortex magnetic beads thoroughly before each use. 
		​CAUTION: Do not vortex the End-Prep Enzyme Mix; mix gently by pipetting.</li>
		<li>Pipette 200 fmol (~130 ng for a 1 kb fragment) of each DNA sample into 0.2 mL PCR tubes and adjust volume to 11.5 µL with nuclease-free water.</li>
		<li>Add 1 µL of diluted DNA control sample per tube and mix by pipetting 10–20 times.</li>
		<li>Prepare an end-prep master mix per sample containing 1.75 µL Reaction Buffer and 0.75 µL Enzyme Mix (including 5% excess).</li>
		<li>Add 2.5 µL of master mix to each sample, mix gently and spin down briefly.</li>
		<li>Incubate in a thermal cycler at 20 °C for 5 min followed by 65 °C for 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Purification of end-prepared DNA
	<ol>
		<li>Transfer the 15 µL reaction into a 1.5 mL low DNA-binding microcentrifuge tube.</li>
		<li>Add 15 µL resuspended magnetic beads, mix gently and spin briefly.</li>
		<li>Incubate samples on a rotator mixer for 5 min at room temperature.</li>
		<li>Prepare fresh 80% ethanol for washing.</li>
		<li>Place tubes on a magnetic rack until the beads pellet and remove the supernatant carefully.</li>
		<li>Wash beads twice with 200 µL of 80% ethanol. 
		NOTE: Allow the beads to fully pellet, then carefully remove the ethanol.</li>
		<li>Air-dry beads for ~30 s; avoid over-drying to prevent cracking.</li>
		<li>Resuspend beads in 10 µL nuclease-free water and incubate for 2 min at room temperature.</li>
		<li>Place tubes on a magnetic rack and transfer 10 µL eluate to a clean low DNA-binding microcentrifuge tube.</li>
		<li>Measure DNA concentration using 1 µL on a spectrophotometer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Native barcoding
	<ol>
		<li>Thaw Blunt/TA Ligase Master Mix, EDTA, Short Fragment Buffer (SFB), and Native Barcodes (NB01–NB24).</li>
		<li>Assign individual barcodes to samples 1–24.</li>
		<li>Assemble the barcoding reaction with 7.5 µL end-prepped DNA

<ol><li>Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+genotyping+and+phenotyping+Toxoplasma+gondii+in+Europe+-+A+critical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Waterborne+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective.</a> Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).</li>
<li>Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+host+genetic+factors+through+multi-locus+GWAS+against+toxoplasmosis+in+sheep%3A+addressing+one+health+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives.</a> BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).</li>
<li>Khedr, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+chitosan+and+curcumin-loaded+chitosan+nanoparticles+against+chronic+Toxoplasma+infection+in+experimental+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice.</a> Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).</li>
<li>Joeres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+European+Toxoplasma+gondii+strains+by+a+new+high-resolution+next-generation+sequencing-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).</li>
<li>Gohar, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-strain+genetic+heterogeneity+in+Toxoplasma+gondii+ME49%3A+Oxford+Nanopore+long-read+sequencing+reveals+copy+number+variation+in+the+ROP8-ROP2A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus.</a> BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).</li>
<li>Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+Toxoplasma+gondii+isolates+via+Nanopore-based+multi-locus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing.</a> AMB Express. 14 (1), 68(2024).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2023).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22User+manual+PCR+clean-up+and+Gel+extraction%22">User manual PCR clean-up and Gel extraction</a>. , MACHEREY-NAGEL. (2024).</li>
<li>Karst, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+long-read+amplicon+sequences+using+unique+molecular+identifiers+with+Nanopore+or+PacBio+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing.</a> Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).</li>
<li>Yu, P. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+fungal+identification+using+target+enrichment+and+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing.</a> BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).</li>
<li>Vilares, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+rapid+sequencing-based+molecular+surveillance+and+mosaicism+investigation+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii.</a> Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).</li>
<li>Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perspective+on+and+re-assessment+of+SAG2+locus+as+the+tool+for+genetic+analysis+of+Toxoplasma+gondii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates.</a> Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).</li>
<li>Targa, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+SAG2%2C+SAG3+and+GRA6+alleles+and+single+nucleotide+polymorphism+in+congenital+infections+with+known+parasite+load+and+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Inst+Med+Trop+Sao+Paulo%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome.</a> Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).</li>
<li>Rico-Torres, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cloning+and+sequencing+help+to+genotype+positive+Toxoplasma+gondii+clinical+samples%3F+Results+and+validation+using+SAG3+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Genet+Evol%22%5BJournal%5D)">Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model.</a> Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).</li>
<li>Sanchez, S. G., Besteiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenicity+and+virulence+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii.</a> Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

To studium demonstruje przydatność długiego sekwencjonowania Oxford Nanopore w połączeniu z ukierunkowanym podejściem wielolokacyjnym do szybkiego i niezawodnego genotypowania Toxoplasma gondii. Skupiając się na dwóch dobrze scharakteryzowanych lokacjach antygenów powierzchniowych, SAG2 i SAG3, stworzyliśmy dowód koncepcji sekwencji wielolokacyjnej opartej na Oxford Nanopore poprzez porównawcze analizy szczepów RH (Typ I) i ME49 (Typ II), wykazując zdolność platformy do rozdzielania genetycznyc...

Toxoplasma gondii to globalnie rozpowszechniony pasożyt z grupy apikompleksów i główne ryzyko zoonozy przenoszonej przez żywność i wodę, zdolny do infekcji praktycznie wszystkich ciepłokrwistych zwierząt, przy czym kotowate pełnią rolę ostatecznych gospodarzy1. Zakażenie u ludzi i zwierząt najczęściej następuje poprzez połknięcie cyst tkankowych lub oocyst sporulowanych, a zdolność pasożyta do przechodzenia między etapami tachyzoitu i bradyzoitu umożliwia długotrwałą persystencję w tkankach nerwowych i mięśniowych, przyczyniając się zarówno do przenoszenia przez mięso, jak i do transmisji środowiskowej2,3.
Chociaż trzy klonalne linie (Typy I, II i III) dominują w Europie i Ameryce Północnej, rozległa zmienność genetyczna, w tym atypowe i rekombinowane szczepy, została udokumentowana na całym świecie, szczególnie w regionach o bogatym zbiorniku dzikich zwierząt4. Dokładna dyskryminacja szczepów jest zatem niezbędna do wyjaśnienia dynamiki transmisji, badania wybuchów chorób i zrozumienia epidemiologii regionalnej. Tradycyjne podejścia do genotypowania, takie jak PCR-RFLP, oparta na Sangerze wielolokusowa typizacja sekwencji (MLST) i analiza mikrosatelitarów, znacząco przyczyniły się do zrozumienia struktury populacji T. gondii, ale są ograniczone pod względem rozdzielczości, przepustowości i zdolności do wykrywania wewnątrzgenotypowych zmian. Te podejścia często wymagają wielu oddzielnych reakcji i mogą nie wykrywać insercji, delecji lub złożonych haplotypów w obrębie polimorficznych locus1. Krótkoczytowe sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) poprawiło wykrywanie rzadkich wariantów, ale nadal ogranicza się w identyfikacji złożonych zmian strukturalnych4.
Platformy sekwencjonowania długich odczytów, zwłaszcza Oxford Nanopore Technologies, oferują teraz możliwość generowania ciągłych odczytów o wysokiej dokładności, nadających się do rozdzielania wariantów strukturalnych i wysoce polimorficznych locus5. Ich przenośność, zdolność do analizy w czasie rzeczywistym i kompatybilność z warunkami pracującymi na podstawie amplikongenów sprawiają, że są obiecującymi narzędziami do zastosowań terenowych i badań wybuchów6. Mimo tych zalet, standaryzowane wielolokusowe warunkiem długich odczytów do rutynowego genotypowania T. gondii są nadal ograniczone.
Aby wypełnić tę lukę, opracowałeśmy skalowalny warunek sekwencjonowania amplikongenów z długimi odczytami, ukierunkowany na dwa polimorficzne locus (Rysunek 1). W połączeniu z konsensualnym polerowaniem i pipelinem wykrywania wariantów, to podejście umożliwia dokładne wykrywanie SNP i INDEL, wspierając dyskryminację na poziomie szczepów. Protokół jest odpowiedni dla laboratoriów wyposażonych w amplifikację PCR i sekwencjonowanie długich odczytów i został zweryfikowany przy użyciu hodowlanych izolatów. Chociaż adaptacja do pierwotnych próbek klinicznych lub środowiskowych może być możliwa, takie zastosowania wymagają dodatkowej optymalizacji i walidacji. Ogólnie rzecz biorąc, ten warunek zapewnia strukturalną ramę dla ukierunkowanej molekularnej charakteryzacji i może wspierać badania epidemiologiczne.

<table><tbody><tr><td>Agarose powder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td>Środek do hodowli komórek</td></tr><tr><td>epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies, UK</td><td>N/A</td><td>Przepływ pracy Nextflow do przetwarzania i analizowania danych sekwencjonowania amplikonów nanopore; wersja 1.2.1 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION.</td></tr><tr><td>epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)</td><td>Oxford Nanopore Technologies, UK</td><td>N/A</td><td>Przepływ pracy Nextflow do dopasowywania odczytów sekwencjonowania nanopore do sekwencji referencyjnych i zintegrowanej wizualizacji za pomocą IGV; wersja 1.2.3 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION.</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, pure</td><td>Merck Life Science</td><td>51976-500ML-F</td><td>Do czyszczenia na perłach</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00132239</td><td>Suplement do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td>Mycie komórki przepływowej</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td>Potwierdzenie rozmiaru</td></tr><tr><td>HFF-1 human foreskin fibroblast cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>SCRC-1041</td><td>Ludzkie fibroblasty skóry pochodzące z pępowiny noworodka; używane do propagacji pasożytów</td></tr><tr><td>MinION Flow Cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td>Komórka przepływowa do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>MinION Mk1B Sequencing Device</td><td>Oxford Nanopore Technologies, UK</td><td>MIN-101B</td><td>Sekwencer nanopore; sekwencjonowanie wykonano za pomocą oprogramowania MinKNOW (v25.09.16) do sterowania urządzeniem i wywoływania zasad w czasie rzeczywistym.</td></tr><tr><td>MinKNOW Software</td><td>Oxford Nanopore Technologies, UK</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie używane do sterowania urządzeniem MinION Mk1B, sekwencjonowania w czasie rzeczywistym i wywoływania zasad; wersja 25.09.16.</td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 24 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.24</td><td>Kodowanie dla próbek wielokrotnych</td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367</td><td>Ligacja DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Quick Ligation Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056</td><td>Ligacja adaptera</td></tr><tr><td>NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5&times;)</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td>Stosowane w ligacji DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E7546</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0581</td><td>Stopień czystości molekularnej</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td>Oczyszczanie produktu PCR</td></tr><tr><td>Penicillin&ndash;Streptomycin (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140-122</td><td>Mieszanka antybiotyków</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Bufor myjący</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2&times; Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>Polimeraza o wysokiej dokładności</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Enzym do ligacji adaptera</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Barwnik do barwienia DNA</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Loading Dye (6&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1161</td><td>Wczytywanie próbek do żelu</td></tr><tr><td>Trypsin&ndash;EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>25200056</td><td>Do przemieszczania HFF</td></tr><tr><td>1&times; TAE or 1&times; TBE buffer</td><td>&mdash;</td><td>&mdash;</td><td>Bufor bieżący</td></tr><tr><td>2&times; PCR premix</td><td>&mdash;</td><td>&mdash;</td><td>Gotowy mieszanek do PCR</td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów toxoplasma gondii

Multi-Locus Sequencing for Strain Typing of Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii to pasożytniczy pierwotniak rozprzestrzeniony na całym świecie, charakteryzujący się znaczną różnorodnością genetyczną, co wymaga dokładnych metod molekularnych w celu rozróżnienia szczepów. Celem tego protokołu jest ustanowienie reproduktybilnego przepływu pracy dla ukierunkowanej wielolokacyjnej genotypizacji hodowli izolacji T. gondii. Procedura obejmuje in vitro propagację reprezentatywnych szczepów typu I (RH) i typu II (ME49), ekstrakcję DNA genomowego, lokus-specyficzną amplifikację genów SAG2 i SAG3 oraz analizy oparte na sekwencjonowaniu w celu wykrycia polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) i zdarzeń wstawiania/delecji (INDEL). Dane sekwencjonowania są przetwarzane w celu wygenerowania konsensusowych sekwencji o wysokiej pewności oraz przeprowadzenia porównawczej alinacji w celu identyfikacji polimorfizmów specyficznych dla szczepu. Zastosowanie tego przepływu pracy do archetypowych szczepów wykazało wysoką efektywność mapowania, jednolitą głębokość odczytów na całym obszarze docelowych lokusa oraz dokładne odzyskiwanie oczekiwanych rozmiarów amplikonów, potwierdzając wiarygodne wykrywanie różnorodności genetycznej na poziomie lokusa. Chociaż pełne przypisywanie genotypu wymaga włączenia dodatkowych standaryzowanych markerów, ten protokół zapewnia skalowalny i reproduktybilny rama dla ukierunkowanej charakteryzacji genetycznej izolacji T. gondii utrzymywanych w laboratorium i wspiera spójną wielolokacyjną analizę sekwencji.

Genomiczne DNA Toxoplasma gondii zostało pomyślnie amplifikowanie metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ukierunkowanej na dwa markery genetyczne: SAG2 i SAG3 (Rysunek 2). Po oczyszczeniu, produkty PCR dały odrębne pasma o spodziewanych rozmiarach na elektroforezie na żelu agarozy, odpowiadające 639 bp (SAG2) i 1158 bp (SAG3). Jasność i spójność tych pasm potwierdziły pomyślną amplifikację i integralność fragmentów genów do analizy sekwencji....

Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.

Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is a globally distributed apicomplexan parasite characterized by substantial genetic diversity, necessitating accurate molecular ...

Skupiamy się na różnicach genetycznych pasożyta przenoszonego przez żywność Toxoplasma, aby zidentyfikować niezidentyfikowane szczepy, które stwarzają większe ryzyko, szczególnie podczas ciąży. Szybkie genetyczne charakteryzowanie szczepów o znaczeniu kluczowym jest i ten protokół opisuje szybką metodę sekwencjonowania nanoporowego. Aby rozpocząć, rozmrażaj wymagane reagenty i oczyszczone amplikony PCR wygenerowane z genomowej DNA Toxoplasma gondii.Pipętą wleć każdą próbkę DNA do 0,2 mililitrowych probówek do reakcji łańcuchowej polimerazy i wyrównaj objętość do 11,5 mikrolitrów za pomocą wolnej od nukleazy wody. Dodaj jeden mikroliter rozcieńczonej próbki kontrolnej DNA do każdej probówki i wymieszaj pipetą 10 do 20 razy. Przygotuj master mix NPREP dla każdej próbki zawierający 1,75 mikrolitrów buforu reakcji i 0,75 mikrolitrów mieszanki enzymów, w tym 5% nadwyżki.Dodaj 2,5 mikrolitrów master mix do każdej próbki i delikatnie wymieszaj. Po krótkim wirowaniu, inkubatorz próbki w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pięć minut, następnie w 65 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie oczyść przygotowaną DNA N za pomocą magnetycznych pereł do czyszczenia DNA.P

multi-locus-sequencing-for-strain-typing-of-toxoplasma-gondii

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Trąd, wywoływany przez Mycobacterium leprae, wciąż występuje endemicznie w wielu miejscach. Aby poznać sposób rozprzestrzeniania się i drogi przenoszenia trądu, istotne jest określenie, który szczep M. leprae zainfekował pacjenta. Typowanie z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) jest jedną z takich metod.

Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Prezentowany tutaj test wielomiejscowej analizy tandemowo-powtórzeniowej (MLVA) umożliwia niedrogie, solidne i przenośne genotypowanie w wysokiej rozdzielczości bakterii Yersinia ruckeri. Zaczynając od czystych kultur, test wykorzystuje multipleksową reakcję PCR i elektroforezę kapilarną w celu wytworzenia dziesięcioloci-loci profili MLVA do dalszych zastosowań.

Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

Ta analityczna platforma obliczeniowa dostarcza praktycznych wskazówek dla mikrobiologów, ekologów i epidemiologów zainteresowanych genomiką populacji bakteryjnej. W szczególności zaprezentowane tutaj prace pokazały, w jaki sposób można przeprowadzić: i) mapowanie hierarchicznych genotypów pod kierunkiem filogenezy; ii) analiza genotypów oparta na częstotliwości; iii) analizy pokrewieństwa i klonalności; iv) Identyfikacja loci akcesoryjnych różnicujących rodowód.

Eksploracja heurystyczna hierarchicznych genotypów i dodatkowych loci genomu w populacjach bakteryjnych

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający sekwencjonowanie całego genomu bakteryjnych infekcji przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania docelowego. Ta nowatorska, panelowa metoda syndromiczna pozwala przezwyciężyć wyzwania związane z obfitością ludzkiego DNA i niskim obciążeniem bakteryjnym, ułatwiając nadzór genomiczny nad Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium.

Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Poznaj metodę sekwencjonowania wielomocysłowego do typowania szczepów Toxoplasma gondii z użyciem technologii nanopore. Protokół umożliwia wykrywanie polimorfizmów SNP i INDEL w genach SAG2 oraz SAG3.

Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Przeglądaj więcej filmów