ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Dr Carolina Delgado z Jednostki Anatomii Patologicznej Uniwersytetu Concepción za jej wsparcie i zapewnienie dostępu do zasobów mikroskopicznych.
Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo ANID kodów VIU24P0041 i SUC260026.

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Ludzką tkankę kostną pozyskano z głow la udowych przekazanych przez pacjentów poddawanych operacji wymiany stawu biodrowego w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody. Próbki przechowywano w temperaturze −80 °C do momentu użycia. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkich tkanek w badaniach. Cała ludzka tkanka kostna została pozyskana z głów udowych przekazanych przez pacjentów w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu świadomej zgody i za zgodą Komisji Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania ludzkich tkanek.
1. Synteza GelMA
<ol>
	<li>Rozpuścić 10 g żelatyny typu A w 100 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7.5) w temperaturze 60 °C przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Obniżyć temperaturę do 50 °C i dodać 5 mL bezwodnika metakrylowego z szybkością 0,5 mL/min, mieszając łagodnie przez 1–3 h.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 5-krotnie za pomocą PBS uprzednio ogrzanego do 40 °C, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Dializować roztwór za pomocą membrany 12–14 kDa przeciwko 3–5 L wody destylowanej w temperaturze 40 °C przez 5–7 dni, wymieniając wodę codziennie. 
	UWAGA: (Kluczowy krok) Należy zapewnić całkowitą codzienną wymianę wody, aby usunąć niezareagowany bezwodnik metakrylowy.</li>
	<li>Liofilizować zdializowany roztwór przez 24 h i przechowywać liofilizowane GelMA w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hydrożelu GelMA
<ol>
	<li>Przygotować 10 mL partii hydrożeli GelMA o stężeniu 5, 10 lub 15 w/v%.</li>
	<li>Rozpuścić 0,5, 1,0 lub 1,5 g liofilizowanego GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Schłodzić roztwór do 37 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 mL roztworu fotoinicjatora Irgacure 2959 (0,5 w/v% w etanolu absolutnym).</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i utrzymywać roztwór w temperaturze 37 °C aż do momentu sterylnej filtracji przez membranowy filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 µm.</li>
</ol>
3. Decelularyzacja kości
<ol>
	<li>Stopniowo rozmrażaj głowy kości udowej do temperatury 25 °C. Przetnij każdą głowę kości udowej na pół, a następnie na mniejsze fragmenty.</li>
	<li>Zanurz fragmenty w sterylnej wodzie destylowanej o temperaturze 60 °C i poddaj sonikacji przez 15 min (40 kHz, tryb ciągły).</li>
	<li>Przemyj próbki w 300 mL wody destylowanej uprzednio podgrzanej do 60 °C, wstrząsając z prędkością 200 rpm przez 5 min.</li>
	<li>Wiruj przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C. Powtórz etapy płukania i wirowania trzy razy.</li>
	<li>Zesterylizuj tkankę poprzez sonikację (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w temperaturze 60 °C w roztworze zawierającym 3% nadtlenku wodoru i 0,02% kwasu nadoctowego.</li>
	<li>Przenieś tkankę do 300 mL 70% etanolu i poddaj sonikacji (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w temperaturze 21 °C.</li>
	<li>Przemyj próbki dwukrotnie 300 mL wody destylowanej, wstrząsając z prędkością 200 rpm przez 10 min w temperaturze 60 °C, a następnie wiruj przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Najpierw zamroź wstępnie kość w temperaturze -80 °C przez 4 h, a następnie liofilizuj zdecelularyzowaną kość przez 24 h w naczyniu o szerokim dnie, aby zapewnić równomierne suszenie i uniknąć nadmiernej wysokości próbki, przy ciśnieniu 0,05 mbar i temperaturze od -40 do -60 °C. 
	UWAGA: (Krok krytyczny) Upewnij się, że wysokość próbki wewnątrz naczynia nie przekracza 2–3 cm, aby zapobiec niepełnej liofilizacji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mikrocząstek kostnych
<ol>
	<li>Umieścić zdecelularyzowane fragmenty kości w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 mL z roztworem sterylizującym i homogenizować za pomocą homogenizatora do uzyskania jednorodnego białego roztworu (Supplementary Video 1).</li>
	<li>Wirować przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C, odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 300 mL wody destylowanej w 25 °C przy mieszaniu z prędkością 200 rpm przez 10 min. Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Liofilizować (0,05 mbar w temperaturze od -40 do -60 °C) otrzymany materiał przez 48 h i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Rozetrzeć mechanicznie liofilizowaną kość korową lub rdzeniową w sterylnym moździerzu ceramicznym aż do uzyskania drobnego proszku (Ryc. 1).</li>
	<li>Przesiać proszek przez sito o oczkach 200 µm, zważyć końcowy materiał i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: (Krok krytyczny) Należy upewnić się, że proszek jest całkowicie suchy przed przesiewaniem, aby zapobiec agregacji i nieprawidłowemu doborowi wielkości cząstek.</li>
</ol>
Film uzupełniający 1: Procedura homogenizacji kości. Homogenizacja zdekularyzowanych fragmentów kości przy użyciu homogenizatora aż do uzyskania jednorodnej białej zawiesiny.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/Supplementary%20Video%201.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<img alt="Przygotowanie próbek chemicznych; proces z użyciem moździerza i tłuczka; mielenie proszku do analizy; zestaw laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70782/70782fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie mikrocząstek kostnych. (A) Zdecelularyzowane fragmenty kości po homogenizacji za pomocą homogenizatora OV5 i przechowywaniu w temperaturze -80 °C. (B,C) Sterylny moździerz ceramiczny użyty do zmielenia zdecelularyzowanej kości na drobny proszek. (D) Końcowe zdecelularyzowane mikrocząstki kostne po przesiewaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/70782fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Wytwarzanie żelu kostnego
<ol>
	<li>Przygotować 10 w/v% GelMA, rozpuszczając 1 g GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Ostudzić roztwór do 37 °C i dodać roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959.</li>
	<li>Utrzymać roztwór w temperaturze 37 °C i przeprowadzić filtrację sterylną za pomocą filtra 0,22 µm.</li>
	<li>Dodać mikrocząsteczki odkomórkowionej kości (DBMP) w stężeniu 1% w/v.</li>
	<li>Mieszać i ostrożnie pipetować w górę i w dół w temperaturze 40 °C, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny w celu utworzenia żelu kostnego (BG).</li>
	<li>Przechowywać BG w temperaturze 4 °C do 2 tygodni. 
	UWAGA: (Krok krytyczny) Przed wprowadzeniem komórek należy utrzymywać hydrożel powyżej temperatury żelowania (≥37 °C), aby uniknąć przedwczesnego stwardnienia.</li>
</ol>
6. Hodowla pierwotna osteocytów
<ol>
	<li>Ekstrakcja szpiku kostnego i wstępne przemywanie
	<ol>
		<li>Wyciąć i rozdrobnić tkankę szpiku kostnego z wnętrza głowy kości udowej, używając sterylnych narzędzi chirurgicznych (Rysunek 2).</li>
		<li>Przenieść rozdrobnioną tkankę do sterylnej szalki Petriego.</li>
		<li>Przemyć tkankę trzy razy pożywką hodowlaną α-MEM uzupełnioną o roztwór antybiotykowo-antygrzybiczny (100 µg/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 0,25 µg/mL amfoterycyny).</li>
		<li>Przepłukać raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). 
		UWAGA: (Krok krytyczny) Należy zminimalizować czas między pobraniem tkanki a jej przetwarzaniem, aby zachować żywotność komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie enzymatyczne
	<ol>
		<li>Inkubować tkankę w roztworze kolagenazy typu I przez 25 min w temperaturze 37 °C przy delikatnym mieszaniu.</li>
		<li>Przemyć roztworem HBSS.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 6.2.1–6.2.2 jeszcze dwa razy (łącznie trzy trawienia kolagenazą).</li>
		<li>Inkubować tkankę w 0,5 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 25 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć roztworem HBSS i powtórzyć etap z EDTA jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Przeprowadzić ostatnie trawienie kolagenazą typu I (25 min w 37 °C), a następnie przemyć roztworem HBSS. 
		UWAGA: (Rozwiązywanie problemów) Niepełne trawienie może skutkować niską wydajnością komórek; w razie potrzeby przedłużyć inkubację enzymatyczną o 5–10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie i hodowla komórek
	<ol>
		<li>Zebrać roztwór kolagenazy i przenieść ostatnią porcję przemywania HBSS do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Wirować przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odlać supernatant i resuspender osad w 2 mL pełnej pożywki α-MEM.</li>
		<li>Zasiać zawiesinę komórkową do dwóch kolb hodowlanych T75 i inkubować w 37 °C przy 5% CO₂. 
		UWAGA: Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2–3 dni, aż do osiągnięcia odpowiedniej konfluencji (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces dyssekcji tkanek; A: przygotowanie organu, B: zdyssekcyjne próbki w szalce Petri do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70782/70782fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pobieranie tkanki szpiku kostnego. (A) Głowa kości udowej uzyskana podczas operacji endoprotezoplastyki stawu biodrowego, z zaznaczonym obszarem szpiku wykorzystanym do izolacji komórek. (B) Rozdrobnione fragmenty kości szpikowej umieszczone w sterylnej szalce Petri przed trawieniem enzymatycznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/70782fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej przedstawiający wzorzec wzrostu fibroblastów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70782/70782fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Pierwotna hodowla osteocytów. Osteocyty przytwierdzone i proliferujące w monowarstwie w naczyniu T75 po izolacji z ludzkiej kości szpikowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/70782fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
7. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek
<ol>
	<li>Podgrzej odpowiednią ilość hydrożelu BG do 37 °C. 
	UWAGA: (Krok krytyczny) Należy upewnić się, że w obszarze roboczym nie ma przeciągów; ochłodzenie przyspiesza przedwczesne żelowanie.</li>
	<li>Odklej hodowane osteocyty i odwiruj w probówce 15 mL przy 500 × g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspenduj osad w 200 µL pożywki hodowlanej i wymieszaj z hydrożelem BG, aby uzyskać końcowe zagęszczenie komórek na poziomie co najmniej 1000 cells/µL (dalej określany jako biotusz).</li>
	<li>Pobierz 50 µL biotuszu za pomocą pipety 1000 µL i utrzymuj w temperaturze 37 °C do momentu osadzania.</li>
	<li>Nanieś pipetą 50 µL biotuszu na każdy konstrukt do poszczególnych dołków płytki hodowlanej (Supplementary Video 2); odczekaj około 5 min na fizyczne żelowanie w temperaturze pokojowej (Figure 4).</li>
	<li>Naświetlaj każdy dołek światłem UV o długości fali 365 nm przez 1 min, aby uzyskać nieodwracalne sieciowanie (0.30 J/cm2).</li>
	<li>Dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj konstrukty w 37 °C, 5% CO2 przez wymagany czas. Użyj osobnej płytki dla każdego punktu czasowego.</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie płytki do hodowli tkanek, eksperyment wzrostu komórek, sprzęt laboratoryjny, narzędzie do badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70782/70782fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przygotowanie konstrukcji do trójwymiarowej hodowli komórkowej. Płytka wielodołkowa zawierająca konstrukty GelMA z zawiesionymi komórkami bezpośrednio po pipetowaniu oraz po sieciowaniu UV (365 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/70782fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo uzupełniające 2: Przygotowanie trójwymiarowych konstruktów z obciążeniem komórkowym. Naniesienie mieszanin hydrożelu z komórkami do płytki 12-dołkowej przy użyciu prostej techniki pipetowania przed sieciowaniem UV.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70782/Supplementary%20Video%202.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
8. Badanie biokompatybilności
<ol>
	<li>Barwienie żywe/martwe
	<ol>
		<li>Kultywować rusztowania z komórkami przez wymagane odstępy czasu.</li>
		<li>Przepłukać delikatnie sterylnym PBS.</li>
		<li>Inkubować konstrukty przez 30 min w ciemności w roztworze do barwienia żywe/martwe zawierającym 0,2% etydium homodimeru-1 (EthD-1) i 0,05% kalceiny AM w PBS.</li>
		<li>Wyonać obrazowanie natychmiast przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami dla kalceiny AM (~495/515 nm) i EthD-1 (~495/635 nm). Standardowe zestawy filtrów izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i Texas Red są odpowiednio kompatybilne z detekcją kalceiny AM i EthD-1.</li>
		<li>Zidentyfikować żywe komórki po zielonej fluorescencji cytoplazmatycznej, a martwe komórki po czerwonej fluorescencji jądrowej. 
		UWAGA: Obrazy planarne można przetwarzać za pomocą programu ImageJ (Fiji). Obiektyw, czas ekspozycji, wzmocnienie (gain) oraz natężenie oświetlenia pozostawiono stałe dla wszystkich porównywanych próbek i dostosowano jedynie w celu uniknięcia nasycenia sygnału. Aby zminimalizować błędną interpretację spowodowaną autofluorescencją, dla wszystkich próbek w obrębie każdego eksperymentu utrzymano te same ustawienia akwizycji, a do rozpoznania wzorca fluorescencji tła związanej z biomateriałem wykorzystano obserwacje kontrolne konstruktów z rusztowania/mikrocząsteczek kostnych bez komórek. Kontrole te pozwoliły odróżnić sygnał pochodzący od cząsteczek od rzeczywistego barwienia zaokrąglonych komórek podczas interpretacji obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe oznaczanie AlamarBlue
	<ol>
		<li>Przygotować 5% roztwór roboczy AlamarBlue w pełnej pożywce.</li>
		<li>Inkubować rusztowania w roztworze alamarBlue przez 2,5 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Przenieść 100 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach, wliczając kontrole.</li>
		<li>Zmierzyć fluorescencję przy pobudzeniu 360/40 nm i emisji 460/40 nm.</li>
		<li>Znormalizować wartości fluorescencji względem kontroli w celu określenia względnej aktywności metabolicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Hatt, L. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+in+vitro+evaluations+of+engineered+bone+substitutes+are+not+sufficient+to+predict+in+vivo+preclinical+model+outcomes.">Standard in vitro evaluations of engineered bone substitutes are not sufficient to predict in vivo preclinical model outcomes.</a> Acta Biomater. 156, 177-189 (2023).</li><li>Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+organoid+culture+without+Matrigel.">Towards organoid culture without Matrigel.</a> Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).</li><li>Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+3D+bioprinting+technology+for+tissue/organ+regenerative+engineering.">Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering.</a> Biomaterials. 226, 119536 (2020).</li><li>Sun, Q., Choudhary, S., Mannion, C., Kissin, Y., Zilberberg, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+replication+of+phenotypic+functions+of+osteocytes+through+biomimetic+3D+bone+tissue+construction.">Ex vivo replication of phenotypic functions of osteocytes through biomimetic 3D bone tissue construction.</a> Bone. 106, 148-155 (2018).</li><li>Metzger, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+human+primary+osteoblasts+in+two-+and+three-dimensional+culture.">Expansion and differentiation of human primary osteoblasts in two- and three-dimensional culture.</a> Biotech Histochem. 88 (2), 86-102 (2013).</li><li>Walsh, C. M., Wychowaniec, J. K., Costello, L., Brougham, D. F., Dooley, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+and+ex+vivo+analysis+of+the+potential+of+GelMA+hydrogels+as+a+therapeutic+platform+for+preclinical+spinal+cord+injury.">An In vitro and ex vivo analysis of the potential of GelMA hydrogels as a therapeutic platform for preclinical spinal cord injury.</a> Adv Healthc Mater. 12 (26), e2300951 (2023).</li><li>Smith, C. A., Board, T. N., Rooney, P., Eagle, M. J., Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+decellularized+bone+scaffolds+from+aged+donors+show+improved+osteoinductive+capacity+compared+to+young+donor+bone.">Human decellularized bone scaffolds from aged donors show improved osteoinductive capacity compared to young donor bone.</a> PLoS One. 12 (5), e0177416 (2017).</li><li>Ryan, S. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+approaches+utilizing+three-dimensional+cell+culture.">Drug discovery approaches utilizing three-dimensional cell culture.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (1), 19-28 (2016).</li><li>Sittampalam, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+assays:+Are+they+more+predictive+of+in+vivo+efficacy+than+2D+monolayer+cell-based+assays?.">Three-dimensional cell culture assays: Are they more predictive of in vivo efficacy than 2D monolayer cell-based assays?.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (5), 254-261 (2015).</li><li>Knight, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+reviews+of+animal+experiments+demonstrate+poor+human+clinical+and+toxicological+utility.">Systematic reviews of animal experiments demonstrate poor human clinical and toxicological utility.</a> Altern Lab Anim. 35 (6), 641-659 (2007).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Schlander, M., Hernandez-Villafuerte, K., Cheng, C. Y., Mestre-Ferrandiz, J., Baumann, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Much+Does+It+Cost+to+Research+and+Develop+a+New+Drug?+A+Systematic+Review+and+Assessment.">How Much Does It Cost to Research and Develop a New Drug? A Systematic Review and Assessment.</a> Pharmacoeconomics. 39 (11), 1243-1269 (2021).</li><li>Shah, K. M., Stern, M. M., Stern, A. R., Pathak, J. L., Bravenboer, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+isolation+and+culture+methods.">Osteocyte isolation and culture methods.</a> Bonekey Rep. 5, 838 (2016).</li><li>Zhang, W., Lee, W. Y., Siegel, D. S., Tolias, P., Zilberberg, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+3D+microfluidic+tissue+model+for+multiple+myeloma.">Patient-specific 3D microfluidic tissue model for multiple myeloma.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (8), 663-670 (2014).</li><li>Jiang, Q., Nagano, K., Moriishi, T., Komori, H., Sakane, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Sp7+in+osteoblasts+for+the+proliferation,+differentiation,+and+osteocyte+process+formation.">Roles of Sp7 in osteoblasts for the proliferation, differentiation, and osteocyte process formation.</a> J Orthop Translat. 47, 161-175 (2024).</li></ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół oferuje dostępną i translacyjną metodę wytwarzania 3D konstrukcji przypominających kości, rozwiązując kluczowe ograniczenia obecnych podejść, takie jak zależność od drogich biodrukarów lub własnościowych matryc13. Łącząc GelMA z pozbawionymi komórek ludzkiej tkanki kostnej ekstrakomórkową matrycą8, fizjologicznie istotne konstrukty można wykonać wyłącznie za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego. Ta prostota umożliwia stosowanie w środowiskach ...

Niniejsza metoda ma na celu stworzenie opłacalnej i powtarzalnej platformy 3D do kultury komórek w celu modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w tym osteoporozy, poprzez łączenie GelMA z dECM pochodzącym z ludzkiego tkanki kostnej. Ta strategia umożliwia generowanie konstrukcji przypominających kości, które bardziej realistycznie odzwierciedlają fizjologiczne środowisko niż konwencjonalne dwuwymiarowej kultury, wspierając badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w warunkach biologicznie istotnych1. Zastosowanie osteocytów pochodzących od pacjenta oraz dECM pochodzących z głów kości udowej zwiększa wartość translacyjną i zapewnia praktyczne połączenie między eksperymentacją in vitro a potrzebami badań klinicznych2.
Niniejsza metoda została opracowana w celu przezwyciężenia kluczowych ograniczeń istniejących systemów kultur 3D i biofabrykacji, które często wymagają biodrukarki, specjalistycznych biomateriałów lub kosztownych materiałów eksploatacyjnych (np. Matrigel), ograniczając dostępność w wielu przypadkach3,4. Co więcej, syntetyczne żele często nie odzwierciedlają biochemicznej złożoności zmineralizaowanej macierzy pozakomórkowej kości lub zachowania osteocytów rezydujących w tkankach5. W przeciwieństwie do tego, protokół ten zawiera ludzkie dECM pochodzące z kości, zachowując zawartość zmineralizowaną, białka rodzime i cząsteczki sygnałowe, jednocześnie unikając wymagań infrastrukturalnych związanych z technologiami produkcji dodatkowej6.
Kombinacja GelMA i dECM zapewnia kilka zalet. GelMA wspomaga adhezję komórkową, ich żywotność i różnicowanie oraz może być przetwarzana w temperaturze 37 °C, umożliwiając enkapsulację komórek bez specjalistycznego sprzętu. Sieciowanie za pomocą niedrogich źródeł ultrafioletu (UV) (365 nm) dodatkowo zwiększa dostępność7. Suplementacja dECM wzbogaca konstrukcję o wskazówki specyficzne dla tkanki, które są nieobecne w syntetycznych substytutach, poprawiając kompatybilność osteogenną i ułatwiając dalsze badania takie jak immunofluorescencja i profilowanie molekularne8.
Niniejsza metoda zgadza się z obecnymi wysiłkami na rzecz opracowania ludzkich modeli kości, które zmniejszają zależność od badań na zwierzętach, których dokładność translacyjna jest często ograniczona przez międzygatunkowe różnice1,9,10. Protokół jest zgodny z zasadami 3R11 i może być dostosowany do generowania konstrukcji z użyciem innych tkankowych dECM, rozszerzając potencjalne zastosowania na inżynierię tkankową chrząstki, skóry i układu krążenia12.
Ogólnie rzecz biorąc, ta technika zapewnia dostępną i skalowalną platformę do badania biologii kości w warunkach fizjologicznie istotnych. Kompatybilność z rutynową infrastrukturą laboratoryjną oraz zdolność do włączenia ludzkich próbek klinicznych czynią ją szczególnie przydatną dla grup badawczych z uczelni i szpitali. Metoda wspiera nie tylko platformę do dalszych badań kości nad procesami kostnymi, ale również może być punktem wyjścia dla bardziej translacyjnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i spersonalizowanym rozwoju terapii.

<table><tbody><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-10G</td><td>Fotoinicjator polimeryzacji hydrożelu</td></tr><tr><td>AlamarBlue reagent żywotności komórek&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td>Do ilościowego testu żywotności</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antymykotyczny (100&acute;)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Składnik pożywki kulturalnej</td></tr><tr><td>Kolba do kultury komórek (T75)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70075</td><td>Do kultury osteocytów</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 1</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>Do enzymatycznego trawienia próbek kości</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa, 15 mL</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td>Do przygotowania hydrożelu</td></tr><tr><td>DarkDawn D15-365 nm</td><td>DarkDawn</td><td>-</td><td>Do UV krzyżowania hydrożelu</td></tr><tr><td>DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu</td><td>gibco</td><td>21600069</td><td>Rozpuszczalnik hydrożelu, rozpuszczalnik zestawu LIVE/DEAD</td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt 2-HID</td><td>Winkler</td><td>ED-0760</td><td>Do enzymatycznego trawienia próbek kości</td></tr><tr><td>Centryfuga Eppendorf 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000010</td><td>Do przygotowania mikrocząstek kości</td></tr><tr><td>Etanol absolutny do analizy</td><td>Supelco</td><td>1,00,98,32,511</td><td>Do deskielowania kości (rozcieńczony do 70%), rozpuszczalnik fotoinicjoru</td></tr><tr><td>Surowica bycza</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td>Składnik pożywki kulturalnej</td></tr><tr><td>Żelatyna z skóry świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-500G</td><td>Składnik hydrożelu</td></tr><tr><td>HBSS (10&acute;)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td>Do płukania próbek szpiku kostnego</td></tr><tr><td>L-Askorbinian 2-fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Składnik pożywki kulturalnej</td></tr><tr><td>Zestaw żywotności/cytotoksyczności LIVE/DEAD</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Do jakościowego testu żywotności/cytotoksyczności</td></tr><tr><td>MEM Alpha (1&acute;)</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td>Składnik pożywki kulturalnej</td></tr><tr><td>Anhydryd metakrylanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685-500G</td><td>Składnik hydrożelu</td></tr><tr><td>Mikroprobówka do centrum</td><td>Citotest</td><td>4610-1844</td><td>Do przygotowania barwników alamarBlue i LIVE/DEAD</td></tr><tr><td>NuncIon delta surface&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>150628</td><td>12-dołkowa płyta do siewu próbek</td></tr><tr><td>Źródło światła fluorescencyjnego OLYMPUS BX43 źródło światła Olympus U- LH100HG</td><td>Evident</td><td>U- LH100HG</td><td>Źródło światła do analizy fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>RC-6 Plus centryfuga</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>Do deskielowania kości i przygotowania mikrocząstek kości</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny czytnik Synergy HTX</td><td>BioTek Instruments</td><td>-</td><td>Spektrofotometr&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą</td><td>NIPRO</td><td>SY3-WN-R-03</td><td>Do filtrowania hydrożelu</td></tr><tr><td>Płytka do kultury tkankowej 96 dołków</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP001096</td><td>96 dołków do testu żywotności alamarBlue.</td></tr><tr><td>Oczyszczacz ultradźwiękowy</td><td>VWE</td><td>97043-958</td><td>Do sonicacji próbek kości</td></tr></tbody></table>

platforma hodowli kości 3d z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

A 3D Bone Culture Platform Using Human Osteocytes and Decellularized Extracellular Matrix for Modeling Musculoskeletal Diseases

Modelowanie chorób układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak osteoporoza, wymaga in vitro platform, które dokładnie odtwarzają kluczowe cechy ludzkiej biologii kości. Konwencjonalne systemy 3D kultury dostarczają cenny wgląd w interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, ale ich zależność od kosztownych materiałów, biodrukarki lub specjalistycznej infrastruktury ogranicza ich szersze przyjęcie. Opisujemy tutaj wytrzymały i niskobudżetowy protokół generowania 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem pochodzących od ludzi osteocytów osadzanych w hydrożelach GelMA, uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową (dECM) uzyskaną z podarowanych głów kości udowej. Ta metoda oparta na pipetowaniu umożliwia produkcję powtarzalnych, przypominających kości konstrukcji w temperaturze fizjologicznej (37 °C), przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.
Powstałe konstrukcje zachowują wysoką żywotność i integralność strukturalną, wspierając zastosowania dalsze, takie jak obrazowanie immunofluorescencyjne i badania molekularne. Wprowadzenie pochodzącej od pacjenta dECM zwiększa istotność translacyjną poprzez lepsze odzwierciedlenie przebudowy kości ludzkich i postępu choroby. To podejście zapewnia dostępną, skalowalną platformę do testowania leków, medycyny regeneracyjnej i badań mechanizmu biologii kości. Ogólnie rzecz biorąc, protokół oferuje praktyczną alternatywę dla drogich technik biodrukowania i może być łatwo dostosowany do innych tkankowych źródeł dECM.

Pierwotne osteocyty zostały pomyślnie wyizolowane z ludzkich główek kości udowej i były wykrywalne w hodowli około 5 dni po ekstrakcji. Komórki wykazywały morfologię gwiaździstą i tworzyły połączone sieci charakterystyczne dla morfologii osteocytów, co potwierdziło pomyślną izolację, adhezję oraz żywotność (Rycina 5).
<img alt="Wyniki testu fluorescencyjnego; wykres słupkowy, RFU przez 7 dni, TE1-TE3 w porównaniu z kontrolą, analiz...

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Modeling musculoskeletal diseases such as osteoporosis requires in vitro platforms that accurately reproduce key features of human bone biology. ...

a-3d-bone-culture-platform-using-human-osteocytes-decellularized

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Platforma 3D kultury kości z zastosowaniem ludzkich osteocytów i decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Tutaj prezentujemy protokoły analizy przebudowy kości w ramach platformy lab-on-a-chip. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące można sparować z platformą w celu wywołania mechanostransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Platforma może być również wykorzystana do ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości na podstawie osteoklastów i osteoblastów (resorpcja/tworzenie).

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Universidad San Sebastián.  Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kości przy użyciu ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metakrylowanym żelatynie (GelMA) uzupełnionym o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Przeglądaj więcej filmów