Kompleksowy model szczura do oceny dróg transportu wątrobowego poprzez jednoczesne pobieranie próbek limfatycznych i krwionośnych
15 maja 2026
Ten protokół eksperymentalny opisuje model szczura z kanalikiem limfatycznym wątroby, który umożliwia bezpośrednią i ilościową ocenę limfatycznego i naczyniowego drenażu wątroby. Model pozwala na jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi ogólnoustrojowej w celu zbadania transportu, metabolizmu i sygnalizacji odpornościowej wątroby, wspierając badania farmakokinetyki leków i biologii specyficznej dla wątroby.
Nasze laboratorium bada rolę układu limfatycznego w chorobach zapalnych i kardiometabolicznych oraz opracowuje strategie dostarczania leków do układu limfatycznego w celu leczenia tych chorób. Ten protokół umożliwia ocenę procesów wątrobowych, w tym metabolizm leków, przepływ składników odżywczych, sygnały odpornościowe i reakcję wątroby w różnych warunkach. Aby rozpocząć, umieść znieczulonego samca szczura Sprague-Dawley o wadze około 250-300 gramów, który został pomyślnie kanulowany przez tętnicę szyjną i żyłę szyjną, w pozycji leżącej na grzbiecie pod mikroskopem chirurgicznym.
Wykonaj 4-5 centymetrowy poziomy nacięcie skóry od linii środkowej do prawej flanki, około 1,5-2 centymetry poniżej klatki piersiowej. Odetnij skórę i wykonaj odpowiednie nacięcia w mięśniach skośnych zewnętrznych i wewnętrznych. Kauteryzuj lub związuj większe naczynia krwionośne, które napotkasz podczas zabiegu.
Użyj bawełnianych wacików zwilżonych roztworem fizjologicznym, aby przesunąć wątrobę w kierunku przepony, żołądek na lewą stronę, a jelito cienkie w dół. Utrzymuj narządy w stanie uciągu za pomocą gazy nasączonej roztworem fizjologicznym. Zidentyfikuj przewód limfatyczny wątroby biegnący równolegle i nieco bardziej do tyłu od tętnicy wątrobowej, przyśrodkowo do prawej nerki i sąsiadujący z dolną żyłą główną.
Użyj większego, nieprzezroczystego lub białego przewodu limfatycznego krezkowego jako punktu odniesienia anatomicznego, aby zidentyfikować przezroczysty i wąski przewód limfatyczny wątroby zlokalizowany bardziej do tyłu. Użyj prostych kleszczy Graefe, aby usunąć tkankę łączną pokrywającą przewód limfatyczny i żyłę główną dolną. Wsuń kleszcze przez łóżko tłuszczowe pod prawą nerką, aby stworzyć tunel pod żyłą główną dolną.
Przesuń kleszcze, aż końcówki pojawią się równolegle do przewodu limfatycznego wątroby po przeciwnej stronie żyły głównej dolnej. Użyj kleszczy, aby chwycić zewnętrzny koniec wstępnie przygotowanej kaniuły i wyciągnąć kaniułę przez tunel, aż jej końcówka pojawi się po przeciwnej stronie. Użyj kleszczy Halsted Mosquito Hemostat, aby zgiąć końcówkę igły 25-g do około 90 stopni.
Za pomocą wygiętej igły ostrożnie przekłuj przewód limfatyczny wątroby po prawej stronie, najbliżej operatora. Sprawdź kaniułę napełnioną roztworem przeciwkrzepliwym i usuń ewentualne bąbelki powietrza. Wsuń zaostrzony koniec około 2 milimetrów w przewód.
Potwierdź przepływ limfy na zewnętrznym końcu kaniuły na poziomie około 100 mikrolitrów na godzinę. Wyreguluj lub ponownie wsuń kaniułę, jeśli nie zaobserwuje się przepływu. Zakorkuj kaniułę na końcu zbierającym, a następnie nałóż niewielką kroplę weterynaryjnego kleju, aby zabezpieczyć miejsce wkłucia.
Gdy klej wyschnie, potwierdź przepływ limfy przez przewód. Następnie usuń gazę i przywróć narządy do pierwotnych pozycji. Umieść probówkę z roztworem przeciwkrzepliwym poniżej wylotu kaniuły i upewnij się, że limfa spływa do probówki kroplami.
Następnie zamknij ścianę brzucha, szyjąc warstwy mięśnia skośnego wewnętrznego, skośnego zewnętrznego i skóry kolejno. Natychmiast po punkcji przewodu limfatycznego wątroby, rozpocznij rehydratację poprzez wlew sterylnego roztworu fizjologicznego w ilości 1,5-3,0 mililitrów na godzinę przez kaniułę w żyle szyjnej. Monitoruj oddychanie i odruchy podczas utrzymywania znieczulenia przez kołnierz nosowy.
Po podaniu terapeutycznej dawki przez kaniułę w żyle szyjnej zbieraj limfę wątrobową ciągle do probówek zawierających roztwór przeciwkrzepliwy. Wymieniaj probówki zbiorcze co godzinę lub w razie potrzeby. Pobierz próbki krwi z tętnicy szyjnej w wyznaczonych punktach czasowych, utrzymując całkowitą objętość poniżej 10% szacowanej objętości krążącej przed pobieraniem próbek końcowych.
Ponownie otwórz nacięcie brzuszne, aby odsłonić górną jamę brzuszną, utrzymując głębokie znieczulenie i stabilną oddychanie. Użyj gazy zwilżonej roztworem fizjologicznym, aby delikatnie przesunąć wątrobę w kierunku przepony, żołądek na lewą stronę, a jelito cienkie w dół. Zidentyfikuj tętnicę wątrobową biegnąca równolegle do przewodu limfatycznego wątroby, znajdującą się sąsiadującą z przewodem limfatycznym krezkowym.
Uzyskaj kaniułę poliwinilową o średnicy zewnętrznej 0,61 milimetrów i średnicy wewnętrznej 0,28 milimetrów napełnioną roztworem przeciwkrzepliwym i usuń ewentualne bąbelki powietrza. Za pomocą zakrzywionych kleszczy Iris wyizoluj krótki odcinek tętnicy wątrobowa. Umieść szylk 4-0 pod tętnicą.
Delikatnie podnieś tętnicę i umieść drugą szylkę w odległości od pierwsz
Przegląd
Wątroba pełni funkcję centralnego ośrodka metabolicznego i immunologicznego, przetwarzając składniki odżywcze, ksenobiotyki oraz mediatory odpornościowe dostarczane przez żyłę wrotną i tętnicę wątrobową. Substancje przedostają się do hepatocytów i innych komórek wątroby poprzez naczynia włosowate zatokowe, przy czym filtrat osocza spływa do przestrzeni Disse’go w celu transformacji metabolicznej, nadzoru immunologicznego lub drenażu limfatycznego w postaci limfy wątrobowej. Niniejszy artykuł opisuje chirurgiczny model szczura umożliwiający jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej oraz krwi systemowej poprzez kaniulację przewodu limfatycznego wątroby, tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. Model ten pozwala na ciągłe pobieranie limfy wątrobowej i krwi tętniczej, a dostęp do żyły szyjnej umożliwia nawadnianie lub pobieranie krwi żylnej, co pozwala na porównanie krwi tętniczej i żylnej. Przepływy limfy wątrobowej wynoszące około 0.1 mL/h u znieczulonych szczurów pozwalają na do 8 godzin ciągłego pobierania limfy, podczas gdy krew tętnicza i żylna są pobierane symultanicznie. Końcowe pobranie próbek z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej na koniec procedury umożliwia bezpośrednie porównanie dopływu do wątroby, odpływu oraz drenażu limfatycznego. Ta wszechstronna platforma ułatwia ocenę procesów wątrobowych, takich jak farmakokinetyka leków, przepływ i metabolizm składników odżywczych oraz specyficzne odpowiedzi wątroby w różnych warunkach patofizjologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hepatologia
- Fizjologia
- Farmakokinetyka
Wstęp
- Wątroba otrzymuje podwójne ukrwienie z żyły wrotnej (krew jelitowa bogata w składniki odżywcze) oraz z tętnicy wątrobowej (utlenowana krew systemowa).
- Kapilary zatokowe umożliwiają wymianę między krwią a hepatocytami, przy czym filtrat osocza przedostaje się do przestrzeni Dissego.
- Limfa wątrobowa transportuje substancje zmodyfikowane metabolicznie oraz czynniki immunologiczne, odzwierciedlając funkcję wątroby.
- Jednoczesny pobiór krwi i limfy umożliwia analizę wychwytu, metabolizmu i sekrecji wątrobowej.
Cel badania
- Opracowanie chirurgicznego modelu szczura do ciągłego i jednoczesnego pobierania limfy wątrobowej, krwi tętniczej oraz krwi żylnej.
- Umożliwienie bezpośredniego porównania dopływu do wątroby (żyła wrotna, tętnica wątrobowa), odpływu (żyły wątrobowe) oraz drenażu limfatycznego.
- Wsparcie kompleksowej analizy transportu wątrobowego, procesów metabolicznych i sygnalizacji immunologicznej.
- Zapewnienie platformy do badania farmakokinetyki leków, przepływu składników odżywczych oraz specyficznych reakcji wątroby w stanie zdrowia i choroby.
Zastosowane metody
- Chirurgiczna kanulacja przewodu limfatycznego wątroby w celu ciągłego pobierania próbek odpływu limfy.
- Kanulacja tętnicy szyjnej do ciągłego pobierania próbek krwi tętniczej.
- Kanulacja żyły szyjnej w celu nawadniania, podawania płynów lub pobierania krwi żylnej.
- Terminalne pobranie próbek z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej po zakończeniu eksperymentu w celu oceny dopływu do wątroby.
- Pomiar szybkości przepływu limfy wątrobowej (~0.1 mL/h) u znieczulonych szczurów w celu walidacji funkcjonalności modelu.
Główne wyniki
- Pomyślna kanulacja pozwoliła na uzyskanie stabilnego przepływu limfy wątrobowej na poziomie około 0.1 mL/h u znieczulonych szczurów.
- Ciągły pobór limfy wątrobowej utrzymywano do 8 godzin, równocześnie z pobieraniem krwi tętniczej i żylnej.
- Model ten umożliwił bezpośrednie porównanie krwi tętniczej (wpływu systemowego) z odpływem limfy wątrobowej (produkcji przetworzonej przez wątrobę).
- Końcowy pobór krwi z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej umożliwił ocenę dopływu składników odżywczych i leków do wątroby.
- Ułatwiono analizę klirensu wątrobowego, transformacji metabolicznej oraz gospodarki mediatorami immunologicznymi.
Wnioski
- Model szczura z potrójną kaniulacją stanowi solidny system do jednoczesnego pobierania próbek limfy wątrobowej oraz krwi tętniczej i żylnej.
- Umożliwia on bezpośrednie porównanie dopływu i odpływu krwi z wątroby oraz drenażu limfatycznego w kontrolowanych warunkach.
- Model ten jest odpowiedni do badania transportu wątrobowego, metabolizmu, funkcji odpornościowych oraz farmakokinetyki.
- Zastosowania obejmują ocenę dystrybucji leków, przepływu składników odżywczych oraz reakcji wątroby w stanach fizjologicznych i patofizjologicznych.
- Podejście to pogłębia wgląd w mechanizmy funkcjonowania wątroby poprzez integrację pobierania próbek naczyniowych i limfatycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi w modelu szczura umożliwia bezpośrednią, ilościową ocenę transportu wątrobowego, klirensu oraz procesów metabolicznych, które są kluczowe dla odkrywania leków i badań translacyjnych. Platforma ta zwiększa pewność predykcyjną w zakresie dystrybucji wątrobowej, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celu w kluczowych punktach zwrotnych w procesie rozwoju produktów biofarmaceutycznych. Zdolność modelu do porównywania przedziałów tętniczych, żylnych i limfatycznych zapewnia wgląd na poziomie przedsiębiorstwa w specyficzne dla wątroby odpowiedzi oraz farmakokinetykę.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną analizę szlaków wychwytu, metabolizmu i klirensu wątrobowego.
- Wspiera walidację funkcjonalną transporterów wątrobowych i celów metabolicznych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie udziału naczyń krwionośnych i limfatycznych w dystrybucji związku.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie toksyczności i obciążeń wątrobowych w portfelach projektów na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane próbki biologiczne do późniejszych analiz ilościowych metabolitów, cytokin i ksenobiotyków.
- Umożliwia standaryzację analiz poprzez bezpośrednie porównanie przedziałów tętniczych, żylnych i limfatycznych.
- Wspiera powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w celu oceny związków w kontekście wątrobowym.
- Przygotowuje solidne zestawy próbek do wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening) i odkrywania biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dostosowanie modeli przedklinicznych do fizjologii wątroby człowieka poprzez zintegrowane pobieranie próbek z naczyń krwionośnych i limfatycznych.
- Umożliwia identyfikację biomarkerów translacyjnych dzięki analizie specyficznej dla poszczególnych przedziałów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka, dostarczając kompleksowych danych na temat dystrybucji w wątrobie.
- Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację terapii ukierunkowanych na wątrobę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji związków wiodących oraz badań przedklinicznych, umożliwiając bezpośrednią, ilościową analizę transportu i metabolizmu wątrobowego pomiędzy przedziałami naczyniowymi i limfatycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w mechanizmach transportu i klirensu wątrobowego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników w celu opracowania testów i selekcji związków.
- Analityka: Umożliwia pomiary wielokomorowe w celu porównania dopływu, odpływu oraz drenażu limfatycznego.
- Badania translacyjne: Koreluje wyniki przedkliniczne z procesami wątrobowymi i profilami biomarkerów istotnymi dla ludzi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań wątrobowych, od farmakokinetyki po sygnalizację immunologiczną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad dystrybucją wątrobową.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pobieranie próbek i analizę w przedziałach naczyniowych i limfatycznych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka wątrobowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój aktywów ukierunkowanych na wątrobę.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia chirurgicznego w celu precyzyjnego kaniulowania i pobierania próbek.
- Wymaga infrastruktury analitycznej do ilościowego oznaczania metabolitów i cząsteczek sygnałowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania próbek i integracji danych.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych modeli chorób i warunków eksperymentalnych zgodnie z protokołem.
- Objętość próbki i czas trwania są ograniczone przez szybkość przepływu limfy oraz fizjologię zwierząt.
