Name: Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowanie wieloomowe z pojedynczych komórek mózgu. Ta metoda łączy dane epigenomiczne i transkryptomiczne z tych samych jąder, poprawiając identyfikację typów komórek i odkrywając przestrzenne programy regulacyjne w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To prace została częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health R01 DK142826 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.; MPI), P30 DK084567 (T.O.: Epigenomics and Spatial Biology Core, Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology) oraz Mayo Clinic Presidential Strategic Initiative Fund (T.O.). Agencje finansujące nie miały wpływu na projekt badań, analizę danych, ani przygotowanie manuskryptu. Treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów.

<ol>
	<li>St&#229;hl, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+analysis+of+gene+expression+in+tissue+sections+by+spatial+transcriptomics.">Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics.</a> Science. 353 (6294), 78-82 (2016).</li><li>Asp, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+detection+of+fetal+marker+genes+expressed+at+low+level+in+adult+human+heart+tissue.">Spatial detection of fetal marker genes expressed at low level in adult human heart tissue.</a> Sci Rep. 7 (1), 12941 (2017).</li><li>Larsson, L., Fris&#233;n, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+transcriptomics+adds+a+new+dimension+to+genomics.">Spatially resolved transcriptomics adds a new dimension to genomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 15-18 (2021).</li><li>Rodriques, S. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide-seq:+A+scalable+technology+for+measuring+genome-wide+expression+at+high+spatial+resolution.">Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution.</a> Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).</li><li>Moffitt, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+spatial,+and+functional+single-cell+profiling+of+the+hypothalamic+preoptic+region.">Molecular, spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region.</a> Science. 362 (6416), eaau5324 (2018).</li><li>Kleshchevnikov, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell2location+maps+fine-grained+cell+types+in+spatial+transcriptomics.">Cell2location maps fine-grained cell types in spatial transcriptomics.</a> Nat Biotechnol. 40 (5), 661-671 (2022).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+multi-omics:+deciphering+technological+landscape+of+integration+of+multi-omics+and+its+applications.">Spatial multi-omics: deciphering technological landscape of integration of multi-omics and its applications.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 72 (2024).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year:+spatially+resolved+transcriptomics.">Method of the Year: spatially resolved transcriptomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).</li><li>Zhu, C., Preissl, S., Ren, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multimodal+omics:+the+power+of+many.">Single-cell multimodal omics: the power of many.</a> Nat Methods. 17 (1), 11-14 (2020).</li><li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome.">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).</li><li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility,+gene+expression,+and+protein+levels+in+single+cells.">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression, and protein levels in single cells.</a> Nat Biotechnol. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial-CUT&amp;Tag:+Spatially+resolved+chromatin+modification+profiling+at+the+cellular+level.">Spatial-CUT&amp;Tag: Spatially resolved chromatin modification profiling at the cellular level.</a> Science. 375 (6581), 681-686 (2022).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Spatial-Resolution+Multi-Omics+Sequencing+via+Deterministic+Barcoding+in+Tissue.">High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue.</a> Cell. 183 (6), 1665-1681.e18 (2020).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+epigenome-transcriptome+co-profiling+of+mammalian+tissues.">Spatial epigenome-transcriptome co-profiling of mammalian tissues.</a> Nature. 616 (7955), 113-122 (2023).</li><li>Lee, C. N., Fu, H., Cardilla, A., Zhou, W., Deng, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+joint+profiling+of+DNA+methylome+and+transcriptome+in+tissues.">Spatial joint profiling of DNA methylome and transcriptome in tissues.</a> Nature. 646 (8087), 1261-1271 (2025).</li><li>Russell, A. J. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide-tags+enable+single-nucleus+barcoding+for+multimodal+spatial+genomics.">Slide-tags enable single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics.</a> Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+molecular+approach+for+spatial+epigenome,+transcriptome,+and+cell+lineages.">Unified molecular approach for spatial epigenome, transcriptome, and cell lineages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (16), e2424070122 (2025).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+single-cell+joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptomes.">Droplet-based single-cell joint profiling of histone modifications and transcriptomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 30 (10), 1428-1433 (2023).</li><li>Caride, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titration-based+normalization+of+antibody+amount+improves+consistency+of+ChIP-seq+experiments.">Titration-based normalization of antibody amount improves consistency of ChIP-seq experiments.</a> BMC Genomics. 24 (1), 171 (2023).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+and+controlled+chromatin+extraction+from+FFPE+tissues+and+the+application+to+ChIP-seq.">Enhanced and controlled chromatin extraction from FFPE tissues and the application to ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 20 (1), 249 (2019).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nat Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Germain, P. L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doublet+identification+in+single-cell+sequencing+data+using+scDblFinder.">Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder.</a> F1000Res. 10, 979 (2021).</li><li>Thibodeau, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMULET:+a+novel+read+count-based+method+for+effective+multiplet+detection+from+single+nucleus+ATAC-seq+data.">AMULET: a novel read count-based method for effective multiplet detection from single nucleus ATAC-seq data.</a> Genome Biol. 22 (1), 252 (2021).</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 411-420 (2018).</li><li>Yao, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+transcriptomic+and+spatial+atlas+of+cell+types+in+the+whole+mouse+brain.">A high-resolution transcriptomic and spatial atlas of cell types in the whole mouse brain.</a> Nature. 624 (7991), 317-332 (2023).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Allen+Mouse+Brain+Common+Coordinate+Framework:+A+3D+Reference+Atlas.">The Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework: A 3D Reference Atlas.</a> Cell. 181 (4), 936-953.e20 (2020).</li></ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół opisuje przestrzenny przepływ pracy Trekker-CUT&Tag multiome, który integruje przestrzenną kodowanie, nisko-wejściowe profilowanie CUT&Tag H3K27ac, jednoczesne przechwytywanie wielu docelowych cząsteczek na żelowych perłach 10x Genomics single-cell multiome oraz przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania Illumina. Łącząc indeksowanie przestrzenne z epigenomowymi i transkryptonomicznymi odczytami jednokomórkowymi, to podejście eliminuje fundamentalną ograniczenie konwencjonalnych jednokomórkowych przepływów pracy multiome, które nie mają natywnego kontekstu tkankowego. To badanie z powodzeniem demonstruje wykonalność przestrzennego profilowania multiome CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + ekspresja genów) i ustanawia podstawę dla przestrzennego współprofilowania ekspresji genów oraz docelowych regulatorów, takich jak znaki histonowe i białka związane z chromatyną.
Rygoryzujący kontrolę jakości na wielu etapach przepływu pracy jest niezbędny dla pomyślnej implementacji tego przepływu pracy (Rysunek 1). Chociaż opisany tutaj proces rozpoczyna się od kroków po przekroju, jakość samego przekroju tkankowego jest krytyczna dla optymalnych wyników. Grubość przekroju powinna być dostosowana w oparciu o typ tkanki i oczekiwaną komórkowość. Podczas dysocjacji tkanki i izolacji jąder maksymalizacja wydajności jąder przy zachowaniu integralności jądra jest kluczowa dla ogólnej wydajności przepływów pracy multiome jednokomórkowych opartych na Trekkerze. Niska wydajność jąder może wynikać z nieoptymalnej dysocjacji tkanki, nieefektywnej izolacji jąder lub niewystarczającej grubości przekroju. Zła integralność jąder może wynikać z nadmiernego mechanicznego uszkodzenia, przedłużającego się czasu przetwarzania lub nadmiernego rozkładania. Izolacja jąder stanowi główny punkt rozwiązywania problemów dla pomyślnej implementacji przepływu pracy multiome jednokomórkowego opartego na Trekkerze. Dlatego zaleca się mocno tkankową optymalizację protokołu izolacji jąder przed rozpoczęciem przepływu pracy multiome jednokomórkowego opartego na Trekkerze. Izolowanych jąder należy oceniać ilościowo i jakościowo. Liczenie jąder za pomocą barwników jądrowych zapewnia estymację wydajności, podczas gdy mikroskopowe badanie umożliwia ocenę integralności błony jądrowej, agregacji oraz obecności niejądrowych zanieczyszczeń. Po przygotowaniu biblioteki wszystkie biblioteki powinny być oceniane pod kątem dystrybucji rozmiarów fragmentów i braku dimerycznych adapterów. W przypadku bibliotek CUT&Tag należy oceniać wzbogacenie docelowych regionów genomu nad tłem za pomocą ilościowej PCR, co zapewnia wczesny wskaźnik specyficzności assayu i ogólnej jakości biblioteki przed sekwencjonowaniem. Kontrolę jakości po sekwencjonowaniu jest równie ważna dla dokładnej interpretacji danych multiome przestrzennych. Takie wskaźniki jak współczynniki mapowania, liczba fragmentów na jądro, wzbogacenie miejsca startu transkrypcji, wyniki fragment-in-peak dla CUT&Tag, złożoność genów i głębokość odczytu na komórkę powinny być oceniane zgodnie z zaleceniami 10x Genomics i Takara Trekker. Wspólna ocena tych wskaźników w obu trybach epigenomowych i transkryptonomicznych umożliwia identyfikację artefaktów technicznych i zapewnia niezawodną integrację informacji przestrzennych, epigenomowych i transkrypcyjnych.
Mimo że wykonalność podejścia opartego na barkodzie Trekker w połączeniu z jednokomórkowym assayem multiome CUT&Tag jest demonstrowana w tym badaniu, opisane podejście ma również ograniczenia. Na przykład metoda jest obecnie ograniczona do świeżo zamrożonej tkanki, a jej wykonalność została zademonstrowana tylko dla profilowania pojedynczej modyfikacji histonowej (H3K27ac) w jednym typie tkanki (mózg myszy) bez replikat biologicznych. Ponadto podejście opiera się na dwóch komercyjnych platformach (Takara Trekker i 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Dalsza ocena na różnych typach tkanek i dodatkowych znakach epigenetycznych będzie konieczna, aby ocenić szersze zastosowanie, wydajność, ogólność i powtarzalność tej technologii.
Podsumowując, przestrzenny protokół Trekker-CUT&Tag multiome przedstawiony tutaj demonstruje zdolność do przestrzennego jednokomórkowego współprofilowania epigenomowych i transkryptonomicznych cech. Łącząc kodowanie przestrzenne z ugruntowanymi jednokomórkowymi chemiami multiome, umożliwia mechaniczne badanie regulacji genów w całym układzie tkankowym i oferuje potężną platformę dla przyszłych zastosowań biologii przestrzennej. Warto zauważyć potencjalne zastosowania, takie jak ocena wpływu różnych bodźców eksperymentalnych i środowiskowych na epigenetyczną kontrolę ekspresji genów w określonych typach komórek – na przykład skutki stymulacji nerwowej mogą być analizowane w określonych typach neuronów w centralnym i obwodowym układzie nerwowym, lub wpływ na sąsiednie komórki przenikających pro- i anty-zapalnych komórek odpornościowych można ujawnić w chorobach zapalnych i rakach.

Biologia przestrzenna to szybko rozwijająca się dziedzina, która mapuje lokalizację, organizację i oddziaływania cząsteczek, komórek i tkanek w ich naturalnym środowisku1,2,3. W przeciwieństwie do metod bulk lub konwencjonalnych metod jednokomórkowych, które wymagają dysocjacji tkanki i prowadzą do utraty informacji o położeniu, podejścia przestrzenne zachowują współrzędne fizyczne analitów lub komórek/jąder, co umożliwia bezpośrednie badanie wpływu architektury tkanki na tożsamość komórkową, komunikację międzykomórkową i funkcję biologiczną4,5,6,7. Choć transkryptomika przestrzenna i proteomika przestrzenna są obecnie najpowszechniej stosowanymi modalnościami, dziedzina ta szybko ewoluuje w kierunku przestrzennego profilowania multiomicznego3,8,9. Wspólne profilowanie ekspresji genów i stanów epigenomicznych w obrębie tej samej tkanki jest szczególnie wartościowe, ponieważ bezpośrednio łączy wynik transkrypcyjny z mechanizmami regulacyjnymi — takimi jak dostępność chromatyny i modyfikacje histonów — które sterują aktywnością genów i wykazują zmienność w zależności od domen przestrzennych10,11,12. Zatem zintegrowana analiza przestrzennego epigenomu i transkryptomu dostarczy kluczowych informacji na temat tego, w jaki sposób programy regulacyjne kształtują tożsamość komórkową i organizację tkanki.
Opracowano kilka przestrzennych strategii multiomicznych umożliwiających jednoczesne profilowanie epigenomiczne i transkrypcyjne. Metoda deterministycznego kodowania kreskowego w sekwencjonowaniu tkanek (DBiT-seq) wykorzystuje kanały mikroprzepływowe do dostarczania przestrzennych kodów kreskowych bezpośrednio lub pośrednio, poprzez stemplowanie płytkami żelowymi, do skrawków tkanki, co pozwala na przestrzenną adnotację analitów. Podejście to ułatwia przestrzennie rozdzielone współprofilowanie cech epigenomicznych i transkrypcyjnych12,13,14,15. Metoda Slide-tag, komercjalizowana jako platforma Takara Trekker, wprowadza przestrzenne kody kreskowe bezpośrednio do nienaruszonej tkanki przed dysocjacją, co pozwala na przetwarzanie przestrzennie indeksowanych jąder komórkowych przy użyciu standardowych procedur dla pojedynczych komórek i ich obliczeniowe rzutowanie z powrotem na oryginalne współrzędne tkanki16. Z kolei metoda przestrzennych analiz dostępnej chromatyny, linii komórkowych i ekspresji genów z sekwencjonowaniem (SPACE-seq) wykorzystuje strategię target-out, w której epigenetyczne cele z ogonami poly(A) oraz mRNA są wychwytywane przez sekwencję wychwytującą poly-dT w płytkach do transkryptomiki przestrzennej17.
Metoda Cleavage under targets &amp; tagmentation (CUT&amp;Tag) jest potężnym narzędziem do mapowania oddziaływań między DNA a białkami histonowymi lub niehistonowymi z próbek o niezwykle niskiej ilości materiału wyjściowego18. Metoda CUT&amp;Tag opiera się na fragmentacji chromatyny i znakowaniu DNA (tagmentacji) za pośrednictwem transpozazy Tn5, wykorzystując koniugowany z białkiem A kompleks Tn5 kierowany przez przeciwciała do specyficznego cięcia loci i znakowania molekularnego. Podczas gdy konwencjonalny test CUT&amp;Tag obejmuje wiele etapów inkubacji i płukania, w celu zwiększenia wydajności CUT&amp;Tag w późniejszych zastosowaniach multiomiki pojedynczych komórek wykorzystano uproszczony i usprawniony schemat postępowania CUT&amp;Tag19.
<img alt="Spatial CUT&amp;Tag: schemat procedury H3K27ac, kodowanie kreskowe DNA, izolacja jąder, przygotowanie biblioteki genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71046/71046fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd procedury i kontroli jakości w spatial Trekker–CUT&amp;Tag multiome assay.(A) Schematyczny diagram procedury spatial Trekker–CUT&amp;Tag multiome. Przekrój wieńcowy świeżo zamrożonej tkanki mózgu myszy jest montowany na płytce spatial Trekker i poddawany przestrzennemu kodowaniu kreskowemu. Po lizie tkanki jądra są izolowane i oceniane pod kątem wydajności oraz jakości. Około 50 000 jąder jest wykorzystywanych do CUT&amp;Tag H3K27ac, a tagmentowane jądra, po przeliczeniu, są poddawane kodowaniu kreskowemu pojedynczych komórek przy użyciu kulek żelowych 10x Genomics Chromium Multiome. DNA z kodem kreskowym pojedynczych komórek jest wstępnie amplifikowane i dzielone na dwie frakcje. Indeksowana biblioteka CUT&amp;Tag jest generowana bezpośrednio poprzez PCR indeksujący. W przypadku bibliotek ekspresji genów i przestrzennych kodów kreskowych, wstępnie amplifikowane DNA jest dalej amplifikowane i poddawane selekcji wielkością. Fragmenty odpowiadające typowym rozmiarom cDNA są wykorzystywane do przygotowania biblioteki ekspresji genów, natomiast krótsze fragmenty DNA służą do generowania biblioteki przestrzennych kodów kreskowych. Biblioteki są sekwencjonowane i mapowane zgodnie z wytycznymi 10x Genomics i Curio Trekker. Przewidywany harmonogram eksperymentu jest wskazany po lewej stronie. (B) Kluczowe punkty kontroli jakości (QC) i krytyczne uwagi w całej procedurze. QC jąder obejmuje ocenę wydajności, stopnia nienaruszalności, agregacji i zawartości zanieczyszczeń. QC przed sekwencjonowaniem obejmuje ocenę rozkładu wielkości DNA oraz zanieczyszczenia dimerami starterów dla wszystkich bibliotek. Specyficzność biblioteki CUT&amp;Tag jest oceniana za pomocą ilościowego PCR (qPCR), mierząc wzbogacenie docelowych regionów genomowych względem tła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71046/71046fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Niniejsze badanie przedstawia analizę multiomową spatial Trekker CUT&amp;Tag, która umożliwia jednoczesne profilowanie modyfikacji histonowej H3K27ac związanej z aktywnymi elementami cis-regulatorowymi oraz ekspresji genów w świeżo zamrożonych sekcjach tkanek. Protokół ten zawiera szczegółowe procedury dotyczące kodowania przestrzennego (spatial barcoding) metodą Takara Trekker, dysocjacji tkanek i izolacji jąder komórkowych, liczenia jąder i kontroli jakości, profilowania modyfikacji H3K27ac metodą CUT&amp;Tag z niskim wkładem materiału, wychwytu celów molekularnych na kulekach żelowych 10x Genomics single-cell Multiome oraz przygotowania bibliotek. Przepływ pracy zademonstrowano na koronalnym przekroju tkanki mózgu myszy. W przeciwieństwie do standardowego przepływu pracy 10x Genomics Multiome, w którym dostępność chromatyny jest mierzona za pomocą sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC-seq), niniejszy protokół zastępuje fragmenty ATAC fragmentami uzyskanymi z CUT&amp;Tag, co umożliwia bezpośrednią analizę krajobrazów modyfikacji histonów w rozdzielczości pojedynczych komórek. Aby powiązać przestrzenne kody kreskowe Trekker z kodami kreskowymi dla pojedynczych komórek 10x Genomics, przestrzenne kody z ogonem poly(A) oraz transkrypty mRNA są wychwytywane przez sekwencje poly-dT kulek żelowych Multiome, podczas gdy fragmenty DNA z CUT&amp;Tag są wychwytywane przez sekwencje łącznikowe (spacer sequences). Ta strategia podwójnego wychwytu umożliwia jednoczesne odzyskanie informacji epigenomowych, transkrypcyjnych i przestrzennych z tych samych pojedynczych jąder. Z naszej wiedzy jest to pierwszy przestrzenny przepływ pracy multiomowej, który bezpośrednio integruje adnotację przestrzenną barcode-in Trekker z analizą multiomową pojedynczych komórek w celu współprofilowania genomowego rozkładu znaku histonowego oraz transkryptomu. Uzyskane krajobrazy multiomowe o rozdzielczości przestrzennej, integrujące dane o zajętości H3K27ac i ekspresji genów, umożliwiają projekcję profilów pojedynczych komórek z powrotem do ich oryginalnych współrzędnych tkankowych i zapewniają bezpośredni związek między epigenomowymi mechanizmami regulacyjnymi a programami transkrypcyjnymi w odniesieniu do nienaruszonej architektury tkanki.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Rozcieńczony z 4% roztworu Trypan Blue (Invitrogen, T10282)</td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>10X Genomics Chromium X instrument</td><td>10X Genomics</td><td>1000331</td><td>RRID:SCR_024537</td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Thermo Fisher</td><td>150200</td><td></td></tr><tr><td>1X CUT&amp;Tag Nuclei Buffer</td><td>10x Genomics</td><td>Przygotowane z 20X Nuclei buffer</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 110 μL, wymieszaj 5.5 μL 20X Nuclei Buffer (10X Genomics) + 8.25 μL inhibitora RNAse + 1.1 μL 100 mM DTT + 95.15 μL wody bez nukleazy</td></tr><tr><td>20X Nuclei Buffer</td><td>10x Genomics</td><td>2000207</td><td></td></tr><tr><td>4% Trypan Blue solution</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>5200 Fragment Analyzer</td><td>Advanced Analytical</td><td>M5310AA</td><td></td></tr><tr><td>ABC atlas</td><td>open-source</td><td>N/A</td><td>Opracowanie: Allen Institute for Brain Science (Seattle, WA) RRID:SCR_024440</td></tr><tr><td>Activator</td><td>Epigenome Technology</td><td>CF1006</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor Ligation Mix</td><td>10X Genomics</td><td>Przygotowane z buforu ligacyjnego, enzymu, oligonukleotydów</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 50 ul mieszanki do ligacji adaptorów, wymieszaj 20 μL buforu ligacyjnego + 10 μL ligazy DNA + 20 μL oligonukleotydów adaptorów</td></tr><tr><td>Adaptor Oligos</td><td>10X Genomics</td><td>2000094</td><td></td></tr><tr><td>Amp Mix</td><td>10X Genomics</td><td>2000047</td><td></td></tr><tr><td>Amulet</td><td>open-source</td><td>N/A</td><td>Opracowanie: Ucar Lab (The Jackson Laboratory) RRID: N/A</td></tr><tr><td>Anti-H3K27ac antibody</td><td>EpiCypher</td><td>13-0059</td><td>Partia przeciwciała jest zweryfikowana dla próbek bulkowych i in situ CUT&amp;Tag assay RRID:AB_3712075</td></tr><tr><td>ATAC Buffer B</td><td>10X Genomics</td><td>PN-2000193</td><td></td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>cDNA Amplification Reaction Mix</td><td>10X Genomics</td><td>przygotowane z Pre-Amp Mix i primerów 2</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 65 μL mieszanki do amplifikacji cDNA, wymieszaj 50 μL Amp Mix + 15 μL primerów cDNA Feature 2</td></tr><tr><td>Cell Ranger Arc v2.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td>RRID:SCR_023897</td></tr><tr><td>CFX Opus Real-Time PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J</td><td>10X Genomics</td><td>PN 2000264</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome Gel Bead Kit</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000231</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome GEM Kit</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000232</td><td>Zestaw zawiera następujące elementy: Barcoding Reagent Mix, Barcoding Enzyme Mix, Template Switch Oligo, Reducing Agent B, Cleanup Buffer i Quenching Agent</td></tr><tr><td>Chromium Recovery Agent</td><td>10X Genomics</td><td>220016</td><td></td></tr><tr><td>Cleanup Buffer</td><td>10X Genomics</td><td>2000088</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>10X Genomics</td><td>220110</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dual Index TT Set A</td><td>10X Genomics</td><td>PN-3000431</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads® MyOne® SILANE to make Dynabeads Cleanup Mix</td><td>10X Genomics</td><td>PN-2000048</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 200 μL mieszanki do czyszczenia Dynabeads, wymieszaj 182 μL buforu do czyszczenia + 13 μL Dynabeads Myone SILANE + 5 μL Reducing Agent B</td></tr><tr><td>Elution Solution I</td><td>10X Genomics</td><td>Przygotowane z Bufferu EB</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 100 μL Elution Solution I, wymieszaj 98 μL Bufferu EB + 1 μL 10% Tween 20 + 1 μL Reducing Agent B</td></tr><tr><td>Feature cDNA Primers 2</td><td>10X Genomics</td><td>2000097</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentation Buffer</td><td>10X Genomics</td><td>2000091</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentation Enzyme</td><td>10X Genomics</td><td>2000090</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentation Mix</td><td>10X Genomics</td><td>Przygotowane z Bufferu do fragmentacji i enzymu</td><td>Aby uzyskać łączną objętość 15 μL mieszanki do fragmentacji, wymieszaj 5 μL Bufferu do fragmentacji + 10 μL enzymu do fragmentacji</td></tr><tr><td>Gasket, 6-pack</td><td>10X Genomics</td><td>370017</td><td></td></tr><tr><td>GEM Master Mix</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000232</td><td>Z zestawu Chromium Next GEM Single Cell Multiome GEM Kit (PN-1000232). Aby uzyskać łączną objętość 60 μL GEM Mater Mix, wymieszaj 49.5 μL Barcoding Reagent Mix + 1.1 μL Template Switch Oligo + 1.9 μL Reducing Agent B + 7.5 μL Barcoding Enzyme Mix</td></tr><tr><td>GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit</td><td>10X Genomics</td><td>PN 2000047</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit</td><td>Advanced Analytical</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>Incubation Buffer</td><td>Epigenome Technology</td><td>CF1001</td><td>Aby przygotować łączną objętość 100 μL buforu do inkubacji CUT&amp;Tag I, wymieszaj 90.5 μL buforu do inkubacji (CF1001, Epigenome Technology) z 1.5 μL permeabilizer, 0.5 μL stabilizatora i 7.5 μL inhibitora RNAse</td></tr><tr><td>Invent Minute buffer A</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>Z zestawu Minute Single Nucleus Isolation Kit (Cat. BN-020). Aby uzyskać łączną objętość 800 μL bufferu A, wymieszaj 786.4 μL Minute Buffer A + 13.6 μL inhibitora RNAse (Takara Bio)</td></tr><tr><td>Invent Minute Buffer B</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>Z zestawu Minute Single Nucleus Isolation Kit (Cat. BN-020)</td>

przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Spatially Resolved, Integrated Single-Cell Multiomic Profiling of the Transcriptome and Epigenomic Targets in Frozen Tissue Sections

Technologie przestrzenne multiomiczne w połączeniu z profilowaniem pojedynczych komórek oferują bezprecedensowe możliwości wyjaśnienia molekularnej i komórkowej architektury złożonych tkanek. Połączenie przestrzennego kodowania jąder w pojedynczych krojach kryogenicznych przygotowanych z bloków tkankowych osadzanych w optymalnym medium zamrażającym (OCT) z pojedynczymi pomiarami multiomicznymi w pojedynczej komórce w prosty i wydajny przepływ pracy może ułatwić adnotacje i przestrzennie rozdzieloną analizę molekularną komórek w typach tkanek. To badanie opisuje przestrzenny podejście do rozszczepienia pod celami i tagmentacji (CUT&Tag) multiomowi, które jednocześnie opisuje modyfikację histonu H3K27ac i ekspresję genów na pojedynczej zamrożonej sekcji mózgu. Po przestrzennym kodowaniu, pojedyncze jądra są izolowany i poddany CUT&Tag, połączonemu chwytaniu tagmentowanych DNA, RNA i przestrzennych kodów kreskowych, przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu. Przepływ pracy generuje przestrzennie adnotowany profil epigenomowy i transkryptomowy z tych samych jąder, umożliwiając przypisanie informacji multiomicznych do współrzędnych anatomicznych. Integracja informacji epigenomowych z danymi przestrzennymi transkryptomowymi zwiększa wiarygodność identyfikacji typów komórek i ujawnia przestrzennie zorganizowane programy regulacyjne i interakcje międzykomórkowe w nietkniętych tkankach.

Wykorzystując przekrój wieńcowy (grubość 25 µm, około 70% pokrycia płytki przestrzennej o wymiarach 10 × 10 mm) świeżo zamrożonej tkanki mózgu myszy, opisany tutaj schemat pracy pozwolił na konsekwentne uzyskanie 50 100 wysokiej jakości jąder (SD = 12 200, n = 8), co jest wartością wystarczającą do późniejszego profilowania multiomicznego pojedynczych komórek (Rycina 1). Po przestrzennym kodowaniu kreskowym (spatial barcoding) przekroju tkanki metodą Trekker, jądra zostały wyizolowane poprzez łagodną dysocjację tkanki, a następnie dodatkowo oczyszczone za pomocą zestawu do izolacji pojedynczych jąder Invent. Procedura ta doprowadziła do powstania minimalnej ilości zanieczyszczeń i niskiego poziomu agregacji jąder, co pozwoliło na przygotowanie zawiesin jąder odpowiednich do analiz pojedynczych komórek. Reprezentatywne obrazy wyizolowanych jąder przedstawiono na Rycynie 2.
W przypadku dalszych analiz pojedynczych jąder, w tym profilowania multiomowego CUT&amp;Tag (CUT&amp;Tag + ekspresja genów), zazwyczaj przetwarzano tutaj około 50 000 jąder. Aby zmaksymalizować odzysk jąder, zastosowano uproszczony, zoptymalizowany protokół CUT&amp;Tag dla niskich ilości materiału, wykorzystując bezpośrednie celowanie przeciwciało–pA/Tn5 i tagmentację, co pozwoliło zminimalizować czasy inkubacji oraz liczbę etapów płukania19. Stosując to podejście, odzyskano około 25 000 tagmentowanych jąder, co odpowiada średniej wydajności 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Jądra te zostały następnie wykorzystane do kodowania pojedynczych komórek za pomocą koralików żelowych 10x Genomics Chromium Multiome. Do generowania GEM-ów zaplanowano użycie około 15 000 jąder, z oczekiwaniem odzyskania ~10 000 jąder z indeksowaniem przestrzennym po filtrowaniu jakościowym. Na podstawie dekodowania przestrzennych kodów kreskowych Trekker, 81,3% jąder (SD = 9, n = 3) z zestawu danych pojedynczych komórek można było z pewnością przypisać do pozycji przestrzennych w obrębie kafelka.
Przepływ pracy multiomowej Trekker–CUT&amp;Tag w rozdzielczości przestrzennej generuje trzy indeksowane biblioteki: bibliotekę CUT&amp;Tag, bibliotekę ekspresji genów oraz bibliotekę kodów kreskowych przestrzennych (spatial barcode). Wstępnie amplifikowane DNA z kodami kreskowymi podzielono na dwie frakcje, z których każda została wykorzystana do przygotowania biblioteki zgodnie z chemią wychwytu celów na koralikach żelowych. Biblioteki CUT&amp;Tag zostały bezpośrednio amplifikowane z wstępnie amplifikowanego DNA i wykazały rozkłady wielkości fragmentów charakterystyczne dla tagmentacji CUT&amp;Tag, odpowiadające DNA wolnemu od nukleosomów oraz DNA nukleosomalnemu (Rycyna 3A). Biblioteka wykazała wyraźne wzbogacenie locus Actb dodatniego pod kątem H3K27ac w stosunku do loci genomicznych ujemnych pod kątem H3K27ac20,21 (tj. 68-krotna różnica, przekraczająca 10-krotny próg wcześniej ustalony dla analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny H3K27ac20) (Rycyna 3B). W przypadku bibliotek ekspresji genów i kodów kreskowych przestrzennych, wstępnie amplifikowane DNA najpierw poddano amplifikacji zgodnie z protokołem amplifikacji cDNA 10x Genomics, a następnie rozdzielono na dwie frakcje na podstawie wielkości fragmentów przy użyciu oczyszczania koralikami paramagnetycznymi. Indeksowana biblioteka kodów kreskowych przestrzennych została przygotowana z frakcji wzbogaconej w krótsze fragmenty i wykazała ostry pik przy oczekiwanej wielkości fragmentu. Biblioteki ekspresji genów wykazały charakterystyczny rozkład wielkości skoncentrowany wokół amplifikowanych fragmentów cDNA (Rycyna 3A).
<img alt="Diagram redukcji wymiarowości UMAP; analiza H3K27ac CUT&amp;Tag, ekspresja genów, przestrzenna mapa jąder." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71046/71046fig4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentacja jednokomórkowa i przestrzenna analizy multiomowej spatial Trekker–CUT&amp;Tag w tkance mózgu myszy. (A) Identyfikacja typów komórek za pomocą analizy jednokomórkowej. Wykresy jednorodnej aproksymacji i projekcji rozmaitości (UMAP) przedstawiają adnotowane populacje komórek uzyskane wyłącznie z danych H3K27ac CUT&amp;Tag, wyłącznie z ekspresji genów oraz z zintegrowanego zbioru danych multiomowych (CUT&amp;Tag + ekspresja genów). (B) Reprezentacja przestrzenna danych multiomowych spatial Trekker–CUT&amp;Tag. Jądra ze zintegrowanego zbioru danych multiomowych są przypisywane do współrzędnych przestrzennych przy użyciu kodów kreskowych Trekker, co ujawnia anatomicznie zorganizowane rozmieszczenie typów komórek w przekroju tkanki mózgu myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71046/71046fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Sekwencjonowanie i mapowanie bibliotek CUT&amp;Tag oraz ekspresji genów przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Cell Ranger ARC v2.0.2 zgodnie z wytycznymi firmy 10x Genomics, natomiast biblioteki kodów kreskowych przestrzennych (spatial barcode libraries) przetworzono za pomocą Trekker v1.3.0 zgodnie z zaleceniami firmy Takara Trekker. Do bibliotek CUT&amp;Tag zastosowano sugerowane opcje mapowania dla single-cell ATAC-seq. Wygenerowano zestawy danych dla samych jąder w CUT&amp;Tag, samej ekspresji genów oraz połączony multiome (CUT&amp;Tag + ekspresja genów). Komórki z całkowitą liczbą UMI dla CUT&amp;Tag (≥ 1 000 000 lub ≤ 100) lub ekspresji genów (≥ 100 000 lub ≤ 1000) zostały odfiltrowane przy użyciu pakietu Signac22. Przewidywanie dubletów wykonano za pomocą kombinacji scDblFinder23 dla ekspresji genów oraz AMULET24 dla CUT&amp;Tag. Usunięto komórki spełniające jedno z poniższych kryteriów: 1) scDblFinder.score &gt; 0,6; 2) scDblFinder.score między 0,3 a 0,6 oraz amulet.score &lt; 0,01. Adnotację typów komórek wykonano za pomocą funkcji FindTransferAnchors pakietu Seurat25 w oparciu o dane referencyjne26 z Allen Brain Cell Atlas. Dla biblioteki ekspresji genów w niniejszym badaniu mediana liczby UMI na komórkę wyniosła 15 378, a mediana liczby genów na komórkę wyniosła 4 378. Dla biblioteki CUT&amp;Tag wykryto 11 860 komórek, z medianą 6 631 wysokiej jakości fragmentów na komórkę i wynikiem wzbogacenia TSS wynoszącym 7,66. W przypadku biblioteki kodów kreskowych przestrzennych Trekker, 92,43% jąder przypisano do pozycji przestrzennych, a 51,54% jąder przypisano do pojedynczej lokalizacji przestrzennej. Surowe dane z sekwencjonowania oraz dane przetworzone z analiz wtórnych są dostępne w bazie GEO pod numerem dostępu GSE327406. Końcowy, po kontroli jakości (post-QC), adnotowany obiekt Seurat jest dostępny w Zenodo pod numerem dostępu 19475899. Reprezentatywne rzuty UMAP z adnotacjami typów komórek przedstawiono na Rysunku 4A. Poprzez powiązanie kodów kreskowych pojedynczych komórek z kodami kreskowymi przestrzennymi, poszczególne jądra przypisano z powrotem do ich lokalizacji przestrzennych w tkance w celu wygenerowania mapy przestrzennej (Rysunek 4B). Mapa ta ściśle odpowiada cechom anatomicznym zaobserwowanym w sąsiednich przekrojach i jest zgodna z koronalnym przekrojem mózgu w Allen Brain Atlas27, który stanowi standardowy wzorzec anatomii mózgu myszy. Wspólna analiza przestrzennej ekspresji genów i profili H3K27ac w rozdzielczości pojedynczej komórki umożliwiła identyfikację głównych typów komórek mózgu i ujawniła anatomicznie zorganizowane wzorce rozmieszczenia komórkowego w przekroju tkanki.

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Spatial multiomic technologies combined with single-cell profiling offer unprecedented opportunities to elucidate the molecular and cellular architecture ...

spatially-resolved-integrated-single-cell-multiomic-profiling

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przestrzennie Rozdzielone, Zintegrowane Profilowanie Multiomiczne Jednokomórkowe Transkryptomu i Celów Epigenomicznych w Zamrożonych Przekrojach Tkanki

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowanie wieloomowe z pojedynczych komórek mózgu. Ta metoda łączy dane epigenomiczne i transkryptomiczne z tych samych jąder, poprawiając identyfikację typów komórek i odkrywając przestrzenne programy regulacyjne w tkankach.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych (Wideo) | JoVE Journal

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Przeglądaj więcej filmów