ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To projekt był wspierany przez Narodowe Centrum Funduszu Nauki USA dla Geotechniki Bio-mediated i Bio-inspired (ERC-1449501), Szwajcarski Narodowy Fundusz Nauki (200021_188546) oraz Narodowe Centrum Funduszu Nauki USA (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Część tego badania została przeprowadzona w UC Davis Center for Nano and Micro Manufacturing (CNM2). Dziękujemy Stevenowi Lucero i UC Davis Tech Foundry za projektowanie i produkcję inkubatora mikroskopowego oraz systemu napromieniowania UVC. Dziękujemy również Dr. Yuze Wang i Dr. Jasonowi DeJongowi za dostarczenie geometrii porowatego medium używanego do produkcji reaktorów mikrofluidycznych oraz Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noahowi Goshi, Dr. Gregory'emu Girardi i Dr. Hyehyun Kim za przydatne dyskusje i/lub szkolenie z zakresu fotolitografii i miękkiej litografii. Na koniec dziękujemy Dr. Gaitanowi Gehinowi, Dr. Tonyi Kuhl, Dr. Filippo Mielemu i Dr. Charlesowi Graddy'emu za cenne dyskusje na temat projektu eksperymentu i analizy obrazu.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ta platforma eksperymentalna oferuje unikalne możliwości badania przestrzenno-czasowych dynamiki procesów biogeochemicznych w środowiskach porowatych, wolnych od artefaktów, które uniemożliwiają uzyskanie danych wysokiej wierności. Takie podejście jest szczególnie dobrze przystosowane do biomineralizacji Mn i Fe, które produkują osady mineralne o charakterystycznych odcieniach żółtej ochry, brązu i czerni, które mogą być łatwo segmentowane za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. Korzystając z biomineralizacji Mn jako przypadku studyjnego, możliwe jest ocena wzorców i szybkości osadzania minerałów in situ z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Kilka aspektów tego protokołu umożliwiło zebranie powtarzalnych pomiarów przemian biogeochemicznych. Po pierwsze, użycie zaworu sekwencyjnej iniekcji o małej objętości martwego zmniejszyło eksperymenty z wieloma płynami bez zakłócania biofilmów w przestrzeni porowej mikrofluidycznej. To ustawienie zachowało początkową przestrzenną dystrybucję biofilmu, zapobiegając przepływom ciśnienia, które mogą prowadzić do oderwania lub przemieszczenia biofilmów podczas zmiany wstrzykiwanych płynów, co może wystąpić z innymi instrumentami, takimi jak pompy strzykawkowe. Ten element zapewnia również użytkownikowi elastyczność w dostosowywaniu warunków geochemicznych nakładanych na mikroorganizmy zamieszkujące urządzenie. Wreszcie, ponieważ zachowało początkową dystrybucję biofilmu, to ustawienie pozwala użytkownikowi systematycznie testować, jak różne morfologie biofilmu lub ilości biomasy wpływają na dystrybucję i szybkość osadzania tlenku Mn.
Po drugie, łagodzenie tworzenia i wnikania bąbelków w przestrzeni porowej mikrofluidycznej umożliwiło kilkudniowe eksperymenty, które uchwyciły środowiskowo istotne skale czasowe biomineralizacji Mn. Bąbelki, częsty i często nieunikniony problem w długich eksperymentach powyżej temperatury pokojowej62,63, mogą rozdzielać i blokować pojedyncze pory, przekierowywać przepływ płynów i zakłócać postęp reakcji. Aby zapobiec uwięzieniu bąbelków w przestrzeni porowej, reaktor został w pełni nasycony przed inokulacją. Aby zminimalizować wprowadzenie bąbelków przez system kontroli przepływu, inkubator mikroskopu został ustawiony na 30 °C na długo przed eksperymentem, a wielokrotne objętości roztworu dopływowego zostały przepłukane przed przymocowaniem zainfekowanego reaktora. Ten krok usunął uwięzione powietrze z przewodów i armatury i zminimalizował ryzyko wygazowania płynu podczas eksperymentu. Do systemu kontroli przepływu zintegrowano również pułapkę na bąbelki, z odcinkiem 200-µm ID rury PTFE przymocowanej do wyjścia pułapki, aby zwiększyć opór i poprawić efektywność usuwania bąbelków. Wreszcie, aby zapobiec uwięzieniu powietrza lub wyciekom na granicy między przewodem dopływowym a otworem wejściowym reaktora, wszystkie połączenia zostały wykonane z kroplami płynu na obu końcach przewodu i wywierconego otworu, hydrofobowa rura PTFE została pokryta 1% PEG-DA, a koniec włożonego przewodu był utrzymywany prostopadle do powierzchni PDMS przez cały eksperyment.
Po trzecie, włączenie niestandardowego systemu napromieniania UVC do platformy eksperymentalnej utrzymało zdefiniowaną warunek graniczny geochemiczny i powtarzalnie ograniczało biomineralizację Mn w przestrzeni porowej mikrofluidycznej. Eksperymenty pilotażowe wykazały, że dodatkowe biofilmy w regionie wejściowym reaktora osadziły tlenki Mn w górę biegu od przestrzeni porowej, ograniczając dostępność Mn(II) w dół biegu. Krótkie napromienianie regionów wejściowych i wyjściowych reaktora z odpowiednim wyrównanie po okresie bez przepływu i osadzenia, zapobiegło rozwojowi biofilmu z dowolnych początkowo osadzonego bakterii. Ciągły jednokierunkowy przepływ płynu zapobiegał ponownej kolonizacji regionu wejściowego reaktora po tym początkowym napromienianiu UVC. Napromienianie regionu wyjściowego reaktora w t = 17,5 h przed początkiem fazy stacjonarnej i widocznym osadzanie tlenków Mn minimalizowało ilość akumulacji minerałów w dół biegu od przestrzeni porowej. Ułatwiło to bezpośrednie porównanie danych obrazów w jasnym polu z masą Mn strawioną i zmierzoną za pomocą ICP-MS.
Kombinacja odejmowania obrazów i pomiarów masy końcowej zapewniła półilościową metodę oceny kinetyka osadzania tlenków Mn in situ. Należy jednak zauważyć, że intensywność pikseli przestaje być bezpośrednio proporcjonalna do masy tlenków Mn w bardzo wysokiej gęstości minerału z powodu ograniczonej wrażliwości kamery na ciemne kolory61. Ocena tego nieliniowego zachowania mogłaby ulec poprawie poprzez kwasowe strawienie próbek w określonych punktach czasowych i porównanie strawionej masy z oryginalną masą skalowaną przez ostatni punkt czasowy eksperymentu. Jeśli wymagana jest dokładna ilościowa ocena masy minerału, użytkownicy mogą opracować krzywą kalibracyjną za pomocą próbek minerałów o znanej intensywności i masie, co zostało wcześniej wykazane w Fadely i in.61, lub

Minerały tlenków metali odgrywają krytyczną rolę w cyklu biogeochemicznym1. Tlenki manganu (Mn) i żelaza (Fe) są naładowane ujemnie w pH zbliżonym do neutralnego i łatwo adsorbują metale kationowe2,3,4,5,6,7,8, regulując dostępność mikroelementów i mobilność zanieczyszczeń w reozymie i strefie hiporhealnej. Minerały te wpływają na stabilność i degradację materii organicznej9,10,11,12, determinując absorpcję węgla przez rośliny i mikroby glebowe. W systemach inżynieryjnych (np. filtrach do uzdatniania wody, sztucznych mokradlach) osadzanie tlenków metali jest bezpośrednio wykorzystywane do usuwania Mn lub Fe i remediacji współwystępujących zanieczyszczeń13,14,15,16,17. Te tlenki metali są rozpoznawalne po ich charakterystycznych kolorach, które wahają się od okrowego do ciemnobrązowego i czarnego18,19.
Precypitacja tlenków metali jest zwykle ułatwiana przez mikroorganizmy w procesie znanym jako biomineralizacja20,21,22. Liczne bakterie i grzyby utleniające Mn syntezują wielomiedziowe oksydazy i peroksydazy, które katalizują transfer elektronów z Mn(II) do Mn(III) i Mn(IV) w warunkach tlenowych, co prowadzi do osadzenia tlenków Mn(III, IV) przypominających birnessyt2,23,24. Ponadto, zróżnicowane bakterie utleniające Fe enzymatycznie utleniają Fe(II) do Fe(III) w warunkach obniżonego pH lub niskietlenowych, produkując (oksy)hydr(oksydy) Fe(II, III), w tym ferrihydryt i magnetyt25,26,27,28. Te biogeniczne minerały osadzają się obok powierzchni komórkowych i gromadzą na polimerach pozakomórkowych, osłonkach i innych strukturach komórkowych, tworząc zespoły mikroby-minerał2,23,25,27,29,30.
Mimo powszechności biomineralizacji Mn i Fe w złożonych środowiskach, brakuje szczegółowych informacji na skalę porów. Przestrzenie porowe są strukturalnie heterogeniczne, wykazując preferencyjny przepływ płynów i nieuniformny transport reaktantów, które determinują dystrybucję reakcji biogeochemicznych31,32,33,34,35. Co więcej, aktywność mikrobiologiczna może generować lokalne gradienty geochemiczne, które promuje lub ogranicza biomineralizację, podczas gdy fluktuacje w chemii płynu porowego (np. pH, rozpuszczony tlen, potencjał redoks) mogą wzmacniać osadzanie minerałów lub ułatwiać rozpuszczanie34,35. Badania nad biomineralizacją Mn i Fe zazwyczaj polegają albo na warunkach dobrze wymieszanych w partii30,36,37,38,39,40 lub kolumnach41,42,43,44 do ilościowego określania kinetyki utleniania lub charakteryzowania osadów biomineralnych. Jednak eksperymenty w partii nie mają heterogeniczności przestrzennej niezbędnej dla środowisk porowych. Kolumny zawierające spakowane granulaty zapewniają odpowiednią architekturę fizyczną, ale są ograniczone w swojej użyteczności, ponieważ wymagają destrukcyjnego pobierania próbek w statycznych punktach czasowych, co zatrzymuje postęp eksperymentu i uniemożliwia niezakłócone obserwacje na skalę porów. Dlatego potrzebne są nowe podejścia eksperymentalne do badania mikrobialnego osadzania tlenków metali w środowiskach porowych.
Systemy mikrofluidalne są narzędziem do badania reakcji biogeochemicznych in situ i w czasie rzeczywistym. Reaktory mikrofluidalne mogą być szybko i tanio wykonane z powtarzalnymi i dostosowywalnymi geometriami, które symulują naturalne lub idealizowane środowiska porowe45. Powstałe urządzenia są optycznie przejrzyste, ułatwiając niedestrukcyjną wizualizację i ilościową ocenę procesów na skalę porów, w tym tworzenie biofilmu46,47,<

<table><tbody><tr><td>Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Używany do łączenia czujnika przepływu i bezflanszowych złączy.</td></tr><tr><td>Agar (Fisher BioReagents)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744</td><td>Używany do nalewania płytek do ścierania zamrożonych szczepów.</td></tr><tr><td>Air compressor (Jun-Air)</td><td>Elveflow</td><td>KCP-110</td><td>Używany do nadmuchiwania kontrolera przepływu.</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4915</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.</td></tr><tr><td>Angled tweezers</td><td>TDI International</td><td>7-SA</td><td>Używany do przymocowania wężyka do mikrofluidowego reaktora.</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk&nbsp;</td><td>--</td><td>Używany do projektowania geometrii mikrofluidowego reaktora.</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>--</td><td>Używany do sterylizacji materiałów i płynów.&nbsp;</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME2002T</td><td>Używany do ważenia bazy elastomeru PDMS i czynnika utwardzającego.</td></tr><tr><td>Barbed adapter (1/4-28 swivel to 3/32-in barbed)</td><td>Elveflow</td><td>KFI-06</td><td>Używany do podłączenia wężyka polieterowego poliuretanowego do złącza i stojaka zbiorników płynów.</td></tr><tr><td>Biopsy punch (Rapid-Core, 1.2-mm diameter)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>PT-T983-12-25</td><td>Używany do wybijania otworów wlotowych/wylotowych w mikrofluidowych kanałach PDMS.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bleach (Chlorox)</td><td>ULINE</td><td>S-19719</td><td>Używany do sterylizacji systemu sterowania przepływem. Rozcieńczony do 1% w ultraczystej wodzie.</td></tr><tr><td>Blunt-tip needle (Jensen Global, 21-gauge)</td><td>QSource</td><td>JG21-10HPX-J004</td><td>Używany do podłączania wężyka do strzykawek. Wysterylizowany przez autoklawację przez 30 min.</td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Humboldt</td><td>H-5970</td><td>Używany do utrzymania sterylnego obszaru doświadczalnego.</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&middot;2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.</td></tr><tr><td>Casamino acid (Fisher BioReagents, acid casein peptone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów.</td></tr><tr><td>Cell density meter (WPA Biowave CO8000)</td><td>Avantor</td><td>490005-906</td><td>Używany do pomiaru OD600 kultur bakterii.&nbsp;</td></tr><tr><td>Clear tape (Scotch Magic)</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td>Używany do uniemożliwienia przyklejania się kurzu do mikrofluidowych kanałów PDMS.</td></tr><tr><td>Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2&middot;6H2O, CAS: 7791-13-1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.</td></tr><tr><td>Compressed nitrogen</td><td>Airgas</td><td>NIUHP300</td><td>Używany do osuszania komponentów mikrofluidowego reaktora.</td></tr><tr><td>Conical tube (Falcon, 15-mL volume, polypropylene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td>Używany do roztworów napływowych i próbek ICP-MS. Wstępnie wysterylizowany.</td></tr><tr><td>Conical tube (Falcon, 50-mL volume, polypropylene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Używany do przedkultury LB. Wstępnie wysterylizowany.</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO4&middot;5H2O, CAS: 7758-99-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8027</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.</td></tr><tr><td>Cutting mat</td><td>ULINE</td><td>S-18543</td><td>Używany do cięcia mikrofluidowych kanałów PDMS i wybijania otworów wlotowych/wylotowych.</td></tr><tr><td>Cuvette (Fisherbrand, 1.5-mL volume, polystyrene)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-955-127</td><td>Używany do pomiaru OD600 kultur bakterii.&nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)</td><td>Nikon</td><td>77054115</td><td>Używany do czasoprzestrzennej kolorowej obrazowania jasnopolowymi mikrofluidowych doświadczeń.</td></tr><tr><td>Distribution valve (MUX)</td><td>Elveflow</td><td>MUX-D-12</td><td>Używany do sekwencyjnego wstrzykiwania wielu płynów.</td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI) software</td><td>Elveflow&nbsp;</td><td>--</td><td>Używany do sterowania szybkością przepływu/ciśnieniem między kontrolerem przepływu i czujnikiem przepływu oraz wykonywania przełączania zaworu dystrybucyjnego.</td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask (Fisherbrand, 50-mL volume)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50050</td><td>Używany do średnio-eksponencjalnej kultury. Wysterylizowany przez autoklawację przez 30 min.</td></tr><tr><td>Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% purity, CAS: 64-17-5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962P-4</td><td>Używany do czyszczenia PDMS i pokrywek szkła do produkcji reaktora. Rozcieńczony do 70% w ultraczystej wodzie.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, CAS: 60-00-4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.</td></tr><tr><td>Flangeless fitting (1/4-28 for 1/16-in OD tubing)</td><td>Elveflow</td><td>KFI-17</td><td>Używany do podłączania wężyka do komponentów sprzętowych Elveflow. Zestaw zawiera trzpień i nakrętki gwintowane.</td></tr><tr><td>Flow controller (OB1 MK3+)</td><td>Elveflow</td><td>OB1-2000</td><td>Używany do zap

mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

A Microfluidic Platform to Investigate Microbial Precipitation of Metal Oxides in Porous Media

Drobnoustroje powszechnie wytrącają nanocząstki tlenków metali w glebach, osadach i innych środowiskach porowatych istotnych z ekologicznego punktu widzenia. Jednak formacja i reaktywność tlenków manganu (Mn) i żelaza (Fe) pozostają słabo scharakteryzowane w fizycznie złożonych środowiskach. Chociaż systemy laboratoryjne mogą uwzględniać porowate media jako podłoże, wymagają destrukcyjnego pobierania próbek i nie nadają się łatwo do analiz na skalę porów. Dynamiczna, ale niedostępna natura porowatych mediów wymaga zatem możliwości rozdzielania mikrobialnie pośredniczonej precipitacji minerałów in situ i w czasie rzeczywistym. Aby uzupełnić tę lukę, opracowano platformę mikrofluidyczną do oceny mikrobialnej precipitacji tlenków metali w modelowej przestrzeni porowej. Ta platforma jest zweryfikowana z użyciem bakteryjnego gatunku wytrącającego Mn Pseudomonas putida GB-1. Rozwój biofilmu i związana z tym precipitacja tlenku Mn są wizualizowane w ciągłym przepływie z mikroskopią kolorowej jasnego pola z techniką time-lapse. Algorytm subtrakcji obrazów jest następnie łączony z pomiarami masy końcowej, aby oszacować szybkość precipitacji tlenku Mn. To podejście zapewnia narzędzie do systematycznego testowania, jak mikrobiальna precipitacja tlenków metali zmienia się w odpowiedzi na zmieniające się warunki fizyczne i chemiczne.

Niniejszy protokół stanowi platformę eksperymentalną do obrazowania z rozdzielczością czasowo-przestrzenną procesu tworzenia się biofilmu oraz biomineralizacji Mn. Kolorowe obrazy w jasnym polu wykazały, że biofilmy P. putida GB-1 były rozmieszczone równomiernie w całej przestrzeni porów mikrofluidycznych w czasie t = 18,5 h przed rozpoczęciem precypitacji tlenków Mn (Rysunek 5A). Następnie tlenki Mn kumulowały się preferencyjnie po stronie wlotowej przestrzeni porów, najbliżej źródła dopływu Mn(II) (Rysunek 5B). Różnica między obrazem referencyjnym a kolejnymi punktami czasowymi obrazowania ujawniła wyizolowany wkład precypitatów tlenków Mn w całkowitą intensywność obrazu (Rysunek 5C) i umożliwiła ilościowe określenie zaobserwowanego gradientu akumulacji minerałów w skali reaktora (Rysunek 5D). W skali biofilmu ta metoda odejmowania obrazów pozwoliła uchwycić stopniową precypitację tlenków Mn na powierzchniach biofilmu oraz akumulację minerałów na krawędziach biofilmów w kontakcie z cieczą w porach (Rysunek 6).
Protokół dostarcza ponadto schematu postępowania w celu oszacowania kinetyki wytrącania tlenków Mn na podstawie odejmowania obrazów i pomiarów ICP-MS. W trzech powtórzeniach reaktory mikroprzepływowe zawierały 4,29 ± 0,22 µg Mn w końcowym punkcie czasowym eksperymentu. Trawienie kwasowe zawartości reaktora zostało wcześniej zwalidowane przy użyciu pomiarów masy tlenków Mn w synchrotronie, co wykazało błąd mniejszy niż 18%61. W związku z tym macierze skorygowane o intensywność zostały przeskalowane do tej końcowej masy. Wynikowa szacowana szybkość wytrącania tlenków Mn była niemonotoniczna, gwałtownie wzrastając między t = 19,5 h a t = 21 h, osiągając szczyt na poziomie 0,29 ± 0,04 µg·h-1, a następnie stopniowo spadając aż do t = 43,5 h (Rysunek 7). Należy zauważyć, że obliczenia szybkości nie uwzględniają nanocząstek tlenków Mn znajdujących się poniżej rozdzielczości mikroskopu optycznego ani żadnej masy tlenków utraconej w wyniku transportu w czasie trwania eksperymentu, która prawdopodobnie była minimalna. Podejście to wykorzystuje zatem powszechnie dostępne techniki mikroskopowe do półilościowej oceny trendów czasowych w kinetyce biomineralizacji.
<img alt="Analiza porowatości gleby: obrazy mikroskopowe, mapowanie intensywności pikseli, wykres intensywności w funkcji odległości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Rozkład biofilmów i tlenków Mn w skali reaktora. (A). Kolorowy obraz w jasnym polu biofilmów P. putida GB-1 w mikrofluidycznej przestrzeni porów na początku fazy stacjonarnej (t = 18,5 h, tref). (B). Kolorowy obraz w jasnym polu osadów tlenku Mn na biofilmach i wokół nich P. putida GB-1 w końcowym punkcie czasowym eksperymentu (t = 43,5 h). (C). Skorygowana pod kątem intensywności macierz akumulacji minerałów w końcowym punkcie czasowym eksperymentu (t = 43,5 h), gdzie ziarna przedstawiono w kolorze szarym, a pory w białym. Pasek skali wynosi 1 mm. (D). Jednowymiarowy rozkład przestrzenny całkowitej skorygowanej intensywności od strony wlotowej (lewo) do wylotowej (prawo) przestrzeni porów (t = 43,5 h). Linia ciągła reprezentuje średnią ruchomą z zakresu 1 mm wzdłuż przestrzeni porów od wlotu do wylotu, uśrednioną z trzech powtórzeń eksperymentu, a zacieniowanie reprezentuje odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost komórkowy w czasie; obrazy mikroskopowe i analiza z kontrastem w wielu punktach czasowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig6.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Akumulacja tlenków Mn w skali biofilmu. (A). Wybrane kolorowe obrazy w polu jasnym reprezentatywnych biofilmów P. putida GB-1. Tlenki manganu były wykrywalne najpierw jako zmiana koloru z szarego na brązowy na powierzchniach biofilmu (pokazane w t = 20 h i t = 21 h), a później jako akumulacja ciemnobrązowych osadów na krawędziach biofilmu (pokazane w t = 33 h i t = 43 h). (B). Matryce akumulacji minerałów z korektą natężenia, gdzie ziarna zaznaczono ciemnoszarym kolorem, pory białym, a leżące pod nimi biofilmy jasnoszarym. Pasek skali wynosi 150 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres szybkości wytrącania w funkcji czasu; analiza danych kinetyki reakcji i wahań szybkości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71047/71047fig7.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Szacowanie szybkości wytrącania tlenków Mn w czasie. Szybkość (µg·h-1) określono poprzez przeskalowanie całkowitej skorygowanej intensywności w każdym punkcie czasowym do końcowej masy Mn zmierzonej za pomocą ICP-MS, a następnie wyznaczenie pochodnej po czasie. Markery reprezentują średnią z trzech powtórzeń eksperymentu, a obszar zacieniony reprezentuje odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/71047fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Step1_ImageRegistration.m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step1_ImageRegistration.m" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Step2_ImageSubtraction.m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step2_ImageSubtraction.m" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 3: Step3_Figures.m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71047/Step3_Figures.m" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół przedstawia system mikrofluidyczny do badania mikrobiologiczne precipitacji minerałów tlenku manganu. Powstawanie biomineralu jest mierzone in situ za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. To podejście może być dostosowane do badania precipitacji innych charakterystycznie zabarwionych biogenicznych minerałów w środowiskach porowatych.

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

Microorganisms commonly precipitate metal oxide nanoparticles in soils, sediments, and other environmentally relevant porous media. However, the formation ...

We've developed a microfluidic platform to study the dynamic precipitation of metal oxides by bacteria in a porous environment. This protocol enables in situ and real-time measurement of mineral precipitation, unlike conventional methods such as batch or column systems. To begin, add 10 milliliters of LB medium to a 50 milliliter conical tube.Inoculate the medium using a single colony of Pseudomonas putida GB-1, obtained from a plate that was streaked 20 hours earlier. Incubate the LB pre-culture in a shaker incubator at 30 degrees Celsius and 180 revolutions per minute for 16 hours to reach the stationary phase. Then, pellet one milliliter of LB pre-culture by centrifugation at 8, 000 G for one minute.After washing the pellet three times, re-suspend the final pellet in one milliliter of salt solution without manganese. Then, dilute the washed cell suspension fivefold in salt solution without manganese in a cuvette, and measure the optical density at 600 nanometers using a cell density meter. Inoculate 20 milliliters of growth medium without manganese with the washed cell suspension to an optical density of 0.01 in a 50 milliliter Erlenmeyer flask.Incubate at 30 degrees Celsius and 180 revolutions per minute for six hours to reach mid-exponential phase. Before beginning the experiment, verify that the microscope incubator is maintained at 30 degrees Celsius and prime the flow control system. Pour 10 milliliters of growth medium and salt solution with manganese into a 15 milliliter conical tube, and connect both tubes to the fluid reservoir rack.Degas the prepared microfluidic reactor in a vacuum desiccator for 20 minutes. Draw one to two milliliters of salt solution with manganese into a three milliliter plastic syringe. Attach a blunt tip needle and 20 centimeters of 0.02 inch inner diameter Tygon tubing, press the syringe plunger until the tubing is fully saturated.After de-gassing, use angled tweezers to attach the tubing to the reactor outlet hole. Manually saturate the reactor with the syringe until a droplet forms at the reactor inlet hole. Next, attach 20 centimeters of 0.02 inch inner diameter Tygon tubing to the reactor inlet hole.Continue dispensing salt solution with manganese into the reactor until all air bubbles are removed. To prepare the reactor inoculum, remove the mid-exponential culture from the shaker incubator six hours after inoculation. Dilute fourfold in salt solution without manganese in a cuvette.And measure the optical density. Then, dilute the mid-exponential culture in two milliliters of salt solution with manganese to an initial optical density of 0.005 in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert the tube several times to mix.Next, place the reactor inlet tubing in the microcentrifuge tube, ensuring that a droplet of fluid contacts the inoculum to prevent air introduction in the tubing. Partially close the microcentrifuge tube and secure the lid with tape to prevent contamination. Next, withdraw four to five milliliters of salt solution with manganese into a five milliliter glass gas tight syringe to wet the barrel.Dispense the solution until 0.5 milliliters remain in the syringe and load the syringe into a syringe pump. After disconnecting the plastic syringe from the needle, attach the needle to the glass syringe while avoiding trapping air in the needle hub. To inoculate the reactor, withdraw the inoculum into the reactor for 20 minutes at a flow rate of 8.33 microliters per minute.Turn off the syringe pump following inoculation and allow the bacteria to settle and attach for one hour with no flow. Then, remove the glass syringe from the syringe pump while leaving it connected to the outlet tubing. Next, move the reactor and syringe from the bench top to the microscope incubator.On the microscope stage, remove the inlet tubing from the reactor and push gently on the syringe plunger to create a droplet at the reactor inlet hole. Gently bend the polytetrafluoroethylene, or PTFE tubing, from the flow control system at a right angle. Dip the end of the PTFE tubing into a 1%polyethylene glycol diacrylate solution to wet the exterior of the hydrophobic tubing.Ensure a droplet of growth medium with manganese is present at the end of the PTFE tubing, and attach the tubing to the reactor inlet hole. After disconnecting the syringe, place the outlet tubing into a five milliliter microcentrifuge tube to collect the reactor effluent. Set the flow rate to 1.33 microliters per minute in the flow control system software.Program the system to supply growth medium with manganese for 15 hours to promote biofilm formation, followed by salt solution with manganese for 28.5 hours to induce manganese biomineralization. Next, place a sample frame underneath the reactor for stability. Rigidly mount the frame and reactor in the microscope stage insert to ensure full immobilization.Affix the PTFE tubing to the stage insert with a piece of tape to prevent its detachment from the reactor inlet hole. Align the ultraviolet C-arms two millimeters from the pore space edge on the outlet side and three millimeters on the inlet side to minimize UV light scattering and biofilm damage. Set up a program for reactor irradiation to treat the reactor inlet and outlet regions for five minutes at the experiment onset, then treat only the outlet region for five minutes, 17.5 hours after the experiment onset to inactivate remaining biofilms.Manually adjust the Kohler alignment, following the manufacturer's instructions to ensure even illumination. To prevent quilting artifacts, select Acquire and open the shading correction panel, then capture a shading image and set it as the current shading image. Select ND Acquisition and choose XY to set the center coordinate of the stitched image.Next, choose Large Image and set up the stitched image scan area as five by four fields of view, and apply a 1%overlap. Select Lambda and set up the acquisition of Color Brightfield images using the 4X objective. Select time and set the imaging frequency with intervals of one hour for 15 hours and 0.5 hours for 28.5 hours, then run the time lapse program.Brightfield images demonstrated that Pseudomonas putida GB-1 biofilms were uniformly distributed throughout the microfluidic pore space at 18.5 hours before the onset of manganese oxide precipitation. Subsequently, manganese oxides preferentially accumulated on the inlet side of the pore space closest to the influent manganese source. The difference between the reference image and subsequent image time points revealed the contribution of manganese oxide precipitates to the overall image intensity.Quantification of the observed mineral accumulation gradient was enabled at the reactor scale. At the biofilm scale, the image subtraction approach captured the gradual precipitation of manganese oxides on biofilm surfaces and accumulation of minerals at the edges of biofilms in contact with pore fluid. The resulting estimated rate of manganese oxide precipitation was non-monotonic, increasing steeply between 19.5 hours and 21 hours, peaking at 0.29 micrograms per hour and decelerating gradually until 43.5 hours.This protocol allows researchers to study the timing and location of mineral precipitation in a porous medium. It's critical to prevent biofilm growth in the reactor inlet region. This ensures a constant boundary condition and restricts precipitation to the pore space.Future studies can explore coupled microbe mineral fluid interactions under conditions relevant for environmental and engineering applications.

a-microfluidic-platform-to-investigate-microbial-precipitation-metal

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Systemy reakcji typu lab-in-a-drop pozwalają na wszechstronne przeprowadzanie złożonych reakcji w skali mikroprzepływowej. Opracowano zautomatyzowaną platformę uruchamiającą składającą się z matrycy cewek elektromagnetycznych o wymiarach 3 x 3, która z powodzeniem została wykorzystana do połączenia dwóch mikroreaktorów o pojemności 10 μl, a tym samym zainicjowania reakcji enzymatycznej w powstałych płynnych kulkach.

Kropelki wodne stosowane jako mikroreaktory enzymatyczne i ich elektromagnetyczne uruchamianie

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Celem tej procedury jest łatwe i szybkie wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego z dostosowywalną geometrią i odpornością na pęcznienie przez płyny organiczne do badań nad odzyskiwaniem oleju. Najpierw generowana jest forma z polidimetylosiloksanu, a następnie wykorzystywana do odlewania urządzenia na bazie żywicy epoksydowej. Przedstawiono reprezentatywne badanie przemieszczenia.

Urządzenia mikroprzepływowe do charakteryzowania procesów zdarzeń w skali porów w ośrodkach porowatych do zastosowań związanych z odzyskiwaniem oleju

Szczegółowe są tutaj protokoły działania i montażu modułowej platformy do badań przesiewowych mikroprzepływowych do systematycznej charakterystyki syntez koloidalnych półprzewodników nanokrystalicznych. Dzięki w pełni regulowanym układom systemów, wysoce wydajne zbieranie widm może być przeprowadzane w 4 skalach czasu reakcji rzędu wielkości w przestrzeni próbkowania kontrolowanej przeniesieniem masy.

Modułowa technologia mikroprzepływowa do systematycznych badań koloidalnych nanokryształów półprzewodnikowych

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Obecny protokół opisuje pneumatyczną platformę mikroprzepływową, która może być używana do efektywnego koncentracji mikrocząstek.

Pneumatycznie napędzana platforma mikroprzepływowa do zagęszczania mikrocząstek

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

University of California, Davis.  This protocol presents a microfluidic system for studying the microbial precipitation of manganese oxide minerals. Biomineral formation is measured in situ with optical microscopy and image analysis. This approach can be adapted to investigate the precipitation of other distinctively colored biogenic minerals in porous environments.

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

Przeglądaj więcej filmów