Name: In Vitro Test na degradację LpxC przez proteazę związaną z błoną FtsH i adaptor LapB z Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj ilościowy test degradacji LpxC przez proteazę FtsH z adaptorem LapB w proteoliposomach. Ta metoda fluorescencyjna umożliwia kinetyczną analizę proteolizy związanej z błoną u Escherichia coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wszystkie badania przeprowadzono na Uniwersytecie Yale. W.M. jest wspierany przez National Institute of General Medical Sciences w ramach numerów grantów R01GM137068 i RM1GM149406 oraz przez Fundację Rodziny Richard and Susan Smith poprzez Nagrodę Odyssey.

1. Labeling LpxC with Atto488
<ol>
	<li>Przygotowanie LpxC
	<ol>
		<li>Ekspresja i oczyszczanie białka LpxC jak opisano wcześniej18. Zmień bufor oczyszczonego LpxC z Tris na 50 mM bufor fosforanowy, pH 7.6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) przez filtrację gelową używając kolumny wysokiej rozdzielczości (np. Superdex 200 Increase 10/300 GL).</li>
		<li>Skoncentruj LpxC używając kolumny ultrafiltracyjnej do osiągnięcia końcowej koncentracji co najmniej 5 mg/mL w 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Labeling LpxC z Atto488
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 0.5 mg LpxC w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7.6, do końcowej objętości 225 μL. Dodaj 25 μL 1 M sodu bikarbonatu aby ustawić pH na około 8.3.</li>
		<li>Rozpuścić 0.24 mg reaktywnego barwnika Atto488 w 20 μL 0.1 M buforu sodu bikarbonatu aby przygotować roztwór bazowy (0.012 mg/μL). Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie 2 μL roztworu bazowego z 18 μL 0.1 M buforu sodu bikarbonatu, osiągając końcową koncentrację 0.0012 mg/μL.</li>
		<li>Natychmiast dodać 4 μL roztworu roboczego Atto488 do roztworu białka (odpowiadającemu proporcji molowej LpxC: Atto488 3:1). Owinąć probówkę folią aluminiową i inkubaować w 4 °C przez 2 h z delikatnym mieszaniem (18 rpm). 
		UWAGA: Zarówno bazowy jak i roboczy roztwór Atto488 mogą być błyskawicznie zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separowanie LpxC-Atto488 od wolnego barwnika
	<ol>
		<li>Równoważ kolumnę PD-10 desalting z 10 mL ultraczystej wody, następnie z 15 mL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.6.</li>
		<li>Zastosować mieszaninę reakcji labelującej do kolumny i pozwolić jej w pełni wejść w żywicę.</li>
		<li>Elutować z 5 mL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.6. Dwie oddzielne pasma odpowiadające LpxC-Atto488 (pierwsze pasmo) i wolnemu barwnikowi Atto488 (drugie pasmo) powinny stać się widoczne. Zbierać frakcje z pierwszego pasma w alikwotach około 0.5 mL.</li>
		<li>Analizować elutowane frakcje przez SDS-PAGE. Wizualizować fluorescencje pod oświetleniem UV przed barwieniem Coomassie Brilliant Blue (CBB).</li>
		<li>Zbierać frakcje zawierające LpxC-Atto488 i skoncentrować oznaczone białko do około 2 mg/mL.</li>
		<li>Szacować efektywność labelowania poprzez zmierzenie stężenia białka i stężenia Atto488 używając mikrowolumometru spektrofotometrycznego. 
		UWAGA: Proporcja stężenia Atto488 (w pmol/μL) do stężenia LpxC (w mg/mL) w zakresie 2-5 wskazuje na odpowiedni poziom labelowania. To odpowiada proporcji molowej Atto488 do LpxC w zakresie 1:15 do 1:6 po labelowaniu.</li>
		<li>Rozdziela LpxC-Atto488 do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1.5 mL, błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C. ﻿W tym momencie protokół może być zatrzymany na maksymalnie 3 miesiące. 
		UWAGA: Ciekły azot jest bardzo zimny; obsługiwać z odpowiednim sprzętem ochronnym (rękawice kriogeniczne, ochrona oczu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rekonstytuowanie FtsH/LapB w proteoliposomes
<ol>
	<li>Przygotowanie liposomów
	<ol>
		<li>Przenieść 100 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosforylocholeiny (POPC) w chloroformie do szklanej probówki testowej. Odparować rozpuszczalnik pod łagodnym strumieniem N2, następnie wysuszyć w ssącej chłodni przez noc. 
		UWAGA: POPC ma temperaturę przejścia fazowego około -2 °C i jest szeroko stosowany w biofizyce błon, formulacjach liposomów i systemach modelowych komórek. 
		UWAGA: Chloroform może uszkodzić oczy, skórę, wątrobę, nerki i układ nerwowy. Wymagany jest odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice, ochrona oczu, maseczka) podczas obsługi. Obsługiwać w wyciągu za pomocą szklanej strzykawki.</li>
		<li>Dodać 1,315 μL bufru A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) do wysuszonych filmów POPC. Znowu rozpuścić lipidy poprzez naprzemienne 1 min sonikacji w łaźni wodnej i 1 min wirowania z maksymalną prędkością przez łącznie około 15 min lub do całkowitego zmieszania. (końcowe stężenie lipidu: 100 mM). 
		UWAGA: Aby poprawić resuspendowanie lipidów, ustawić głębokość zanurzenia szklanej probówki w sonikatorze wodnym tak, aby uzyskać maksymalne zmieszanie. Resuspendowane lipidy mogą być przechowywane w -20 °C. W tym momencie protokół może być zatrzymany na maksymalnie 1 miesiąc.</li>
		<li>Rozdziela zawiesinę liposomów do porcji po 200 μL i przechowywać w -

<ol><li>Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+proteases%3A+ATP-fueled+machines+of+protein+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction.</a> Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).</li>
<li>Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%3A+A+class+of+chaperone-like+ATPases+associated+with+the+assembly%2C+operation%2C+and+disassembly+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes.</a> Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).</li>
<li>Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+substrate+denaturation+and+translocation+by+the+ClpxP+degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine.</a> Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).</li>
<li>Gur, E., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+misfolded+proteins+by+Lon%2C+a+AAA%2B+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease.</a> Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).</li>
<li>Ogura, T., Wilkinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+superfamily+ATPases%3A+Common+structure-diverse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function.</a> Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+FtsH+protein+is+a+prokaryotic+member+of+a+protein+family+of+putative+ATPases+involved+in+membrane+functions%2C+cell-cycle+control%2C+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+and+subcellular+localization+of+FtsH+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).</li>
<li>Ito, K., Akiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions%2C+mechanism+of+action%2C+and+regulation+of+FtsH+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).</li>
<li>Chai-Danino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-embedded+polar+residues+target+membrane+proteins+for+degradation+by+the+quality+control+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+trapping+of+ftsh+substrates+by+label-free+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics.</a> Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).</li>
<li>Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trapping+approach+reveals+novel+substrates+and+physiological+functions+of+the+essential+protease+ftsh+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).</li>
<li>Young, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envA+permeability+cell+division+gene+of+Escherichia+coli+encodes+the+second+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis%3A+UDP-3-o-%28r-3-hydroxymyristoyl%29-n-acetylglucosamine+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase.</a> J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+biosynthesis+of+major+membrane+components+through+regulated+degradation+of+the+committed+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis+by+the+AAA+protease+FtsH+%28HflB%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).</li>
<li>Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+requires+the+essential+LapB+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein.</a> J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).</li>
<li>Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YciM+is+an+essential+gene+required+for+regulation+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).</li>
<li>Nicolaes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+function+of+YciM%2C+a+heat+shock+membrane+protein+required+to+maintain+envelope+integrity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+LapB+%28yciM%29+in+regulating+Escherichia+coli+lipopolysaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).</li>
<li>Shu, S., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+FtsH+is+a+membrane-bound%2C+ATP-dependent+protease+that+degrades+the+heat-shock+transcription+factor+sigma%2832%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32).</a> EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).</li>
<li>Yang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-degradation+relationship+of+a+membrane+protein+mediated+by+the+universally+conserved+ATP-dependent+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH.</a> J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).</li>
<li>Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Asahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsH+recognizes+proteins+with+unfolded+structure+and+hydrolyzes+the+carboxyl+side+of+hydrophobic+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues.</a> J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).</li>
<li>Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+regulation+of+lysogenic+decision+in+bacteriophage+lambda%3A+Transmembrane+modulation+of+FtsH+%28HflB%29%2C+the+cII+degrading+protease%2C+by+HflKC+%28HflA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).</li>
</ol>

﻿Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Pierwszym krytycznym etapem tego protokołu jest etykieta Atto488 dla LpxC. Umiarkowane etykietowanie jest kluczowe dla dokładnego pomiaru aktywności degradacji in vitro. Na podstawie naszych eksperymentów optymalizacyjnych, optymalnym stosunkiem molowym LpxC do Atto488 jest od 9:1 do 3:1. Nadmierne stosowanie Atto488 prowadzi do nadmiernego etykietowania, co prawdopodobnie zakłóca stan natywny LpxC. W tych warunkach różnica w degradacji LpxC-Atto488 przez FtsH samodzielnie w porównaniu z FtsH/LapB jest znacznie ...

﻿ Proteasy AAA+ są zachowanymi, zależnymi od ATP maszynami molekularnymi, które odgrywają centralne role w kontroli jakości białek i regulacyjnej proteolizie1,2. Maszyny te zawierają sześciomeryczny pierścień domeny AAA+ ATPazy, która hydrolizuje ATP, rozpoznaje, odwija i ﻿translokuje substraty do domeny proteazy przedziałowej w celu degradacji1. Podczas gdy cytoplazmatyczne proteazy AAA+ takie jak ClpXP3 i Lon4 zostały dobrze scharakteryzowane za pomocą dobrze ugruntowanych testów in vitro, wiązane z błoną proteazy AAA+ pozostają stosunkowo słabo poznane. Ta luka w dużej mierze odzwierciedla wyzwania techniczne związane z rekonstytucją białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych i ilościowym mierzeniem ich aktywności proteolitycznej in vitro. Ogólnym celem tej metody jest ustanowienie wrażliwych, ilościowych testów do badania aktywności proteolitycznej wiązanych z błoną proteaz.
FtsH jest jedyną niezbędną proteazą AAA+ w Escherichia coli i służy jako prototypowa wiązana z błoną proteaza AAA+5,6,7. Zakotwiczona wewnętrznej błonie przez N-końcowe helisy transbłonowe, FtsH degraduje zróżnicowane zestawy substratów cytoplazmatycznych i wiązanych z błoną, regulując w ten sposób kontrolę jakości białek błonowych, reakcje na stres i homeostazę lipidową8,9,10,11. Jednym z jego najlepiej scharakteryzowanych substratów jest LpxC, rozpuszczalna deacetylaza, która katalizuje pierwszy zobowiązany krok w biosyntezie lipopolisacharydów (LPS)12,13. Skuteczna degradacja LpxC przez FtsH wymaga białka błonowego LapB, które funkcjonuje jako adaptor do specyficznego rozpoznania LpxC i dostarczenia go do proteazy14,15,16,17,18.
Mimo swojego fizjologicznego znaczenia, ilościowa analiza proteolizy pośredniczonej przez FtsH in vitro była ograniczona, szczególnie w przypadku substratów cytoplazmatycznych takich jak LpxC. Tradycyjne testy degradacji in vitro używają FtsH oczyszczonego w micelach detergentowych13,19, które nie zapewniają środowiska błonowego dla wiązanej z błoną proteazy. Ponadto, testy degradacji często opierają się na wykrywaniu znikania substratu opartym na SDS-PAGE13, które może być pracochłonne, o niskiej wydajności i niewystarczająco wrażliwe na analizy kinetykę. Bardziej niedawno, FtsH rekonstytuowany w bicele został użyty do badania degradacji substratów błonowych, jak pioniersko wykazał zespół Heedeok Hong20; jednak, porównywalny system do analizy substratów cytoplazmatycznych nadal nie istnieje. Tutaj, adaptujemy rekonstytucję bicele Heedeok Hong do rekonstytucji proteoliposomem, aby naśladować środowisko błonowe. Oprócz tego, wodorozpuszczalny substrat LpxC jest znacznikowym fluorescencją, co umożliwia wrażliwe i ilościowe pomiary kinetyki degradacji LpxC zależnej od FtsH/LapB in vitro.
Ta metoda powinna być stosowana, gdy naukowcy muszą ilościowo mierzyć proteolizę pośredniczoną przez FtsH wodorozpuszczalnych substratów. Zapewnia ona kilka zalet w porównaniu z istniejącymi podejściami. Po pierwsze, fluorescencyjność oparta na detekcji produktów proteolitycznych, zamiast znikania substratu, znacznie poprawia wrażliwość i zakres dynamiczny, ułatwiając ilościowe porównania aktywności proteolitycznej. Po drugie, użycie proteoliposomek zachowuje kontekst błonowy wymagany dla funkcji FtsH, umożliwiając jednocześnie precyzyjną kontrolę nad składem białkowym i lipidowym18. Wreszcie, chociaż opracowany przy użyciu systemu FtsH-LapB-LpxC, ten protokół jest łatwo przystosowywalny do innych wiązanych z błoną proteaz AAA+ i ich cytoplazmatycznych substratów, które wymagają wiązanych z błoną mechanizmów degradacji.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>200 nm polycarbonate membrane</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 Protein Labeling Kit</td><td>Sigma</td><td>38371</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-8920</td><td>Nonpolar polystyrene adsorbent&nbsp;</td></tr><tr><td>Black 96-well plate&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Filter support</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610017</td><td></td></tr><tr><td>Glass test tube</td><td>KIMBLE</td><td>45066-16150</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Avantor</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium acetate tetrahydrate</td><td>Sigma</td><td>228648</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75-002-436</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MLA-80 rotor&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>367096</td><td>Fixed-angle rotor&nbsp;</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite&nbsp;M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>POPC&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002559</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>American Bio</td><td>AB01920-00500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma</td><td>38400100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>567547</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-11201</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>SCILOGEX</td><td>SCI-V1000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>28990944</td><td>High-resolution gel filtration column&nbsp;</td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-XP</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltration column&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zinc acetate dihydrate</td><td>Sigma</td><td>379786</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro test na degradację lpxc przez proteazę związaną z błoną ftsh i adaptor lapb z escherichia coli

An In Vitro Assay For LpxC Degradation By The Membrane-Bound Protease FtsH And Adaptor LapB From Escherichia coli

Ten protokół przedstawia wrażliwy, ilościowy in vitro test degradacji LpxC za pomocą zrekonstruowanej proteazy AAA+ (ATPazy związanej z różnorodnymi procesami komórkowymi) FtsH i adaptora LapB w proteoliposomeach. Proteasy AAA+ to zależne od ATP maszyny molekularne, które utrzymują homeostazę białkową i regulują różnorodne procesy komórkowe w cytoplazmie lub na błonach komórkowych. W porównaniu z ich cytoplazmatycznymi odpowiednikami, wiązane z błonami proteazy AAA+ są słabo scharakteryzowane ze względu na trudności techniczne w rekonstytucji i pomiarze ich aktywności in vitro. Tutaj, stosujemy system FtsH–LapB–LpxC jako model do opracowania opartego na fluorescencji testu degradacji w proteoliposomeach. FtsH i LapB są zrekonstruowane w proteoliposomeach, aby naśladować natywne środowisko błony, a LpxC jest kowalencyjnie oznakowane fluorescującym barwnikiem Atto488. Degradacja jest inicjowana przez połączenie proteoliposomek z oznakowaną LpxC i ATP i kończona kwasem trichlorooctowym (TCA). Pomyślny test jest zdefiniowany przez zależny od czasu wzrost fluorescencji w rozpuszczalnej frakcji nadstanowej po precipitacji TCA, co odpowiada uwolnieniu fluorescencyjnych fragmentów peptydowych wygenerowanych przez proteoliza LpxC. Ten sygnał umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie początkowych szybkości degradacji w zdefiniowanych warunkach. W porównaniu z tradycyjnymi testami opartymi na żelu SDS-PAGE, ta metoda zapewnia znacznie lepszą czułość i umożliwia ilościową analizę kinetyczną. Ponadto, system proteoliposomek umożliwia systematyczne badanie, w jaki sposób komponenty białkowe, takie jak adaptory i anty-adaptory, jak również skład lipidowy, wpływają na degradację LpxC. Chociaż opracowany dla systemu FtsH–LapB–LpxC, ten test można łatwo dostosować do innych wiązanych z błonami proteaz AAA+ i substratów, zapewniając ogólną platformę do badania proteolizy związanej z błonami in vitro.

Aby zwiększyć czułość testu degradacji in vitro, substrat LpxC oznakowano fluorescencyjnym barwnikiem Atto488. Grupa estru succynimidylowego Atto488 reaguje wydajnie z grupami aminowymi LpxC w łagodnie zasadowych warunkach. Ponieważ bufor Tris zawiera aminy pierwszorzędowe, które zakłócają tę reakcję, LpxC oczyszczone w buforze Tris przeniesiono do buforu fosforanowego za pomocą filtracji żelowej przed oznakowaniem. W reakcji znakowania zastosowano stosunek molowy LpxC do Atto488 wynoszący 3:1, aby uzyskać umiar...

Escherichia coli reguluje biosyntezę lipopolisacharydów (LPS) głównie poprzez kontrolowanie degradacji LpxC, deacetylazy katalizującej pierwszy zobowiązany krok syntezy LPS. Celem tego protokołu jest ustanowienie wrażliwego, ilościowego in vitro testu degradacji dla LpxC, z wykorzystaniem zrekonstituowanej proteazy AAA+ FtsH i adaptora LapB w proteoliposomeach.

In Vitro Test na degradację LpxC przez proteazę związaną z błoną FtsH i adaptor LapB z Escherichia coli

This protocol presents a sensitive, quantitative in vitro degradation assay of LpxC using reconstituted AAA+ (ATPase associated with diverse cellular ...

E. coli regulują syntezę lipopolisacharydu poprzez kontrolowanie degradacji LPS. Niniejsze badanie koncentruje się na opracowaniu testu degradacji LPS in vitro. Protokół ten można zastosować do ilościowego pomiaru proteolizy substratów rozpuszczalnych w wodzie, zapośredniczonej przez FtsH.W pierwszej kolejności należy pozyskać białko LpxC. Rozpuścić 0,5 mg białka w buforze fosforanowym 50 mM o pH 7,6 do uzyskania objętości końcowej 225 µL. Dodać 25 µL 1 M wodorowęglanu sodu, aby dostosować pH do wartości około 8,3. Przygotować roztwór roboczy Atto488, rozcieńczając 2 µL wcześniej przygotowanego roztworu zapasowego w 18 µL buforu wodorowęglanowego 0,1 M, aby uzyskać stężenie końcowe 0,0012 mg/µL. Bezzwłocznie dodać 4 µL roztworu roboczego Atto488 do roztworu białka. Po owinięciu probówki folią aluminiową pozostawić ją w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu przez dwie godziny. Przepłukać kolumnę odsalającą PD-10 10 ml wody ultrapure, a następnie zrównoważyć kolumnę 15 ml buforu fosforanowego. Nanieść mieszaninę reakcyjną znakowania na zrównoważoną kolumnę i pozwolić jej w pełni wniknąć w żywicę. Dodać do kolumny 5 ml buforu fosforanowego 50 mM i zaobserwować dwa oddzielne pasm

an-vitro-assay-for-lpxc-degradation-membrane-bound-protease-ftsh

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Poznaj ilościowy test degradacji LpxC przez proteazę FtsH z adaptorem LapB w proteoliposomach. Ta metoda fluorescencyjna umożliwia kinetyczną analizę proteolizy związanej z błoną u Escherichia coli.

In Vitro Test na degradację LpxC przez proteazę związaną z błoną FtsH i adaptor LapB z Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów