ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez Radę Badań Naukowych i Technicznych Turcji (TUBITAK) 1003- 216S461 i 1001-221S419. Ilustracje schematyczne zostały stworzone za pomocą BioRender.com i licencjonowane na potrzeby publikacji (Rysunek 1: LB29MV4E2Q, Rysunek 2: JZ29CC68WD, Rysunek 3: BV29CC72LB, Rysunek 4: BN29CC6XFH). Autorzy wyrażają wdzięczność za użycie narzędzia ChatGPT (OpenAI) wyłącznie do edycji gramatycznej i ulepszania języka angielskiego. Narzędzie nie przyczyniło się do tworzenia treści naukowych. Z wdzięcznością wyrażamy uznanie za korzystanie z usług i urządzeń Centrum Badań Tłumaczeniowych Koç University (KUTTAM), finansowanego przez Prezydenturę Turcji, Szefa ds. Strategii i Budżetu.

<ol>
	<li>Almansour, N. M. Triple-negative breast cancer: brief review about epidemiology, risk factors, signaling pathways, treatment and role of artificial intelligence. Front Mol Biosci. 9, 836417 (2022).</li>
	<li>Nedeljkovic, M., Damjanovic, A. Mechanisms of chemotherapy resistance in triple-negative breast cancer-how we can rise to the challenge. Cells. 8 (9), 957 (2019).</li>
	<li>Bianchini, G., Balko, J. M., Mayer, I. A., Sanders, M. E., Gianni, L. Triple-negative breast cancer: challenges and opportunities of a heterogeneous disease. Nat Rev Clin Oncol. 13 (11), 674&#8211;690 (2016).</li>
	<li>Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer drug resistance: an evolving paradigm. Nat Rev Cancer. 13 (10), 714&#8211;726 (2013).</li>
	<li>Flavahan, W. A., Gaskell, E., Bernstein, B. E. Epigenetic plasticity and the hallmarks of cancer. Science. 357 (6348), eaal2380 (2017).</li>
	<li>Beretta, G. L. et al. Novel insights into taxane pharmacology: update on drug resistance mechanisms, immunomodulation and drug delivery strategies. Drug Resist Updat. 81, 101223 (2025).</li>
	<li>Sajid, A., Rahman, H., Ambudkar, S. V. Advances in the structure, mechanism and targeting of chemoresistance-linked ABC transporters. Nat Rev Cancer. 23 (11), 762&#8211;779 (2023).</li>
	<li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting multidrug resistance in cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219&#8211;234 (2006).</li>
	<li>Robey, R. W. et al. Revisiting the role of ABC transporters in multidrug-resistant cancer. Nat Rev Cancer. 18 (7), 452&#8211;464 (2018).</li>
	<li>Chen, Z. et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: review of the past decade. Cancer Lett. 370 (1), 153&#8211;164 (2016).</li>
	<li>You, D., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Epigenetic regulation of multidrug resistance protein 1 and breast cancer resistance protein transporters by histone deacetylase inhibition. Drug Metab Dispos. 48 (6), 459&#8211;480 (2020).</li>
	<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat Rev Genet. 16 (5), 299&#8211;311 (2015).</li>
	<li>Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? User&#39;s guide to genetic screens. Nat Rev Genet. 19 (2), 67&#8211;80 (2018).</li>
	<li>Yedier-Bayram, O. et al. EPIKOL, chromatin-focused CRISPR/Cas9-based screening platform, to identify cancer-specific epigenetic vulnerabilities. Cell Death Dis. 13 (8), 710 (2022).</li>
	<li>Gottesman, M. M., Lavi, O., Hall, M. D., Gillet, J. P. Toward better understanding of the complexity of cancer drug resistance. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 85&#8211;102 (2016).</li>
	<li>Theile, D., Staffen, B., Weiss, J. ATP-binding cassette transporters as pitfalls in selection of transgenic cells. Anal Biochem. 399 (2), 246&#8211;250 (2010).</li>
	<li>Yedier-Bayram, O. et al. Chromatin-focused genetic and chemical screens identify BRPF1 as a targetable vulnerability in Taxol-resistant triple-negative breast cancer. Exp Mol Med. 57 (6), 1294&#8211;1307 (2025).</li>
	<li>Gokbayrak, B. et al. Identification of selective SWI/SNF dependencies in enzalutamide-resistant prostate cancer. Commun Biol. 8 (1), 169 (2025).</li>
	<li>Kala, E. Y. et al. Functional genomic screens reveal RBBP4 as key regulator of cell cycle progression in TMZ-resistant glioblastoma. bioRxiv. doi:10.1101/2025.05.09.653010 (2025).</li>
	<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. J Vis Exp. 151, e59780 (2019).</li>
	<li>Yuan, Y. et al. Genome-wide CRISPR screen for unveiling radiosensitive and radioresistant genes. J Vis Exp. 219, e67982 (2025).</li>
	<li>Stewart, C., Manriquez Roman, C., Kenderian, S. S. Performing an in vitro genome-wide CRISPR knockout screen in chimeric antigen receptor T cells. J Vis Exp. 215, e67338 (2025).</li>
	<li>Joung, J. et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828&#8211;863 (2017).</li>
	<li>Li, W. et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554 (2014).</li>
	<li>McDermott, M. et al. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: practical guide with case studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).</li>
	<li>Hart, T. et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515&#8211;1526 (2015).</li>
	<li>Meyers, R. M. et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nat Genet. 49 (12), 1779&#8211;1784 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podejścia do przesiewowych badań opartych na CRISPR-Cas9 są dobrze ustalone w różnych kontekstach komórkowych. Jednak przesiewanie w komórkach odpornych na chemioterapię stwarza wyjątkowe wyzwania i wymaga dodatkowej optymalizacji. Ponieważ komórki odporne na chemioterapię służą jako cenne modele do badania podatności guzów odpornych na chemioterapię, ważne jest, aby rozwiązać te ograniczenia w strategiach przesiewowych, aby niezawodnie zidentyfikować genetyczne lub epigenetyczne regulatorzy odporności na chemioterapię.
Generowanie linii komórkowych odpornych na chemioterapię może być uciążliwe i zależy w dużym stopniu od stosowanego środka chemioterapeutycznego. Podczas gdy komórki mogą łatwo przystosować się do niektórych leków, mogą być bardzo podatne na inne25. Dlatego ważne jest określenie wartości IC50 specyficznych dla linii komórkowych przed rozpoczęciem protokołu generacji komórek odpornych17. W przypadkach, gdy komórki nie są w stanie tolerować narażenia na poziom leku odpowiadający IC50 przez kilka przelewów, można rozpocząć od niższego stężenia leku (np. IC10-20) (patrz sekcja Protokół 1)17. Ponieważ nabycie odporności jest zdarzeniem losowym, kilka dobrze/płytek komórek może być leczonych w tym samym czasie, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania odpornych komórek. Kluczowe jest wszechstronne scharakteryzowanie uzyskiwanej populacji komórek odpornych na leki, aby opisać zmiany transkrypcyjne i fenotypowe podczas procedury zwiększania dawki w porównaniu z ich stanem pierwotnym. Globalne podejście profilujące, takie jak RNA-seq, może być zastosowane do zidentyfikowania genów o zróżnicowanej ekspresji w stosunku do linii macierzystej. Funkcjonalnie, nabyta odporność na leki powinna być zweryfikowana za pomocą testów na żywotność i proliferację komórek, aby wykazać, że odporne komórki utrzymują przetrwanie w warunkach leczenia lekami, które są cytotoksyczne dla komórek macierzystych. Ponadto potencjalne zmiany w ich zdolności proliferacyjnej i szybkości wzrostu powinny być mierzone w porównaniu z linią komórek macierzystych, aby obliczyć ich odpowiednie PDL. Ponieważ znana jest nabyta odporność na Taxol, którą pośredniczą, przynajmniej częściowo, wydalanie leków za pośrednictwem ABC, ekspresja kluczowych transporterów ABC (np. ABCB1) powinna być oceniana na poziomie mRNA i białka za pomocą qPCR i Western blottingu i może być uzupełniona danymi transkryptomowymi. Na podstawie profilu ekspresji transporterów ABC należy rozważyć obecność fenotypu MDR i należy ocenić odporność na inne leki chemioterapeutyczne. W naszym poprzednim badaniu scharakteryzowaliśmy linie komórek odpornych na Taxol i zidentyfikowaliśmy ABCB1 jako jeden z najbardziej nadekspresowanych genów, i założyliśmy, że medianowana przez ABCB1 wielolekowa odporność może powodować niepowodzenie w selekcji puromycinem17. Dlatego po utworzeniu komórek odpornych należy ocenić ekspresję transporterów ABC i fenotypu MDR przed każdą procedurą transfekcji.
Metoda zwiększania dawki oferuje zalety w stosunku do protokołów narażenia na wysokie dawki leków, ponieważ komórki mogą być krioprzechowywane na każdym etapie przed zwiększeniem dawki leku, zapewniając elastyczność i ochronę przed utratą kultury. Ponadto stopniowe zwiększanie dawki pozwala na nabycie fenotypu odporności w czasie, umożliwiając adaptacyjną ewolucję; w przeciwieństwie do ostrej wysokiej dawki leczenia, która prowadzi do selekcji uprzednio istniejących podpopulacji odpornych. Jego stopniowe postępy umożliwiają badaczom celowe wybór pożądanego poziomu odporności, na którym należy przerwać selekcję i ocenić właściwości wynikającego fenotypu. Ponadto, pośrednie kroki zwiększania dawki mogą być wykorzystane do badania mechanizmów nabytej odporności w sposób chronologiczny. Zgodnie z podstawowym pytaniem biologicznym, można uzyskać różne poziomy odporności, aby badać wczesne mechanizmy adaptacyjne o niższych poziomach odporności lub stabilne i w pełni ustalone fenotypy odporności w bardziej odpornych komórkach. Co więcej, klinicznie istotne progi odporności różnią się znacznie w zależności od leku, linii komórek i właściwej szybkości proliferacji; dlatego harmonogram zwiększania dawki może się różnić (w naszym przypadku, generowanie komórek odpornych na Taxol wymagało około 6 miesięcy). Zgodnie z tym rozumowaniem, w naszym poprzednim badaniu ustaliliśmy dwa różne poziomy odporności z komórkami SUM159PT i porównaliśmy ich różne i wspólne cechy17. Dlatego zalecamy, aby badacze zdefiniowali docelowy zakres IC50 leku o interesującym klinicznie i biologicznie zainteresowaniu.
Jest dobrze ustalone, że wycofanie stresu leku może prowadzić do utraty odporności na chemioterapię, ponieważ komórki mogą przebudować swoje epigenom i transkryptom25. Z tego powodu sugeruje się ocenę stabilności fenotypu odporności przez kilka miesięcy. Jeśli komórki mają tendencję do powrotu do stanu wrażliwego po wycofaniu leku, komórki odporne mogą być hodowane w obecności dawki utrzymującej, która zazwyczaj odpowiada końcowej stężeniu leku

Rak potrójnie ujemny piersi (TNBC) to podtyp raka piersi, który stanowi 12–17% wszystkich przypadków raka piersi1. Charakteryzuje się upośledzoną ekspresją receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronu (PR) i ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórka-2 (HER2), co poważnie ogranicza dostępność opcji terapii ukierunkowanej i pozostawia konwencjonalną chemioterapię jako główną modalność leczenia2. W leczeniu TNBC powszechnie stosuje się taksany i antracykliny; jednak pacjenci zwykle rozwijają oporność2,3. Nabycie oporności na chemioterapię jest złożonym i wielowymiarowym procesem, który obejmuje adaptacje genetyczne, metaboliczne, transkrypcyjne i epigenetyczne2,4. Zmiany epigenetyczne stały się centralnymi regulatorami plastistyczności komórkowej, ułatwiając dynamiczne przeprogramowanie transkrypcyjne, które pozwala komórkom nowotworowym na tolerowanie toksyczności wywołanej chemioterapią5.
Taxol (paklitaksel) jest członkiem klasy taksanów, który powoduje śmierć komórki poprzez upośledzenie dynamiki mikrotubul i działa jako środek antymitotyczny6. Mimo że pacjenci z TNBC początkowo reagują na schematy chemioterapii obejmujące Taxol, z czasem zwykle rozwija się oporność2. Zdobyta oporność na Taxol jest zwykle związana z nadmierną ekspresją białek transportujących należących do klasy ABC (ATP-binding cassette), szczególnie ABCB1 (MDR1, P-glikoproteina), które pośredniczą w wydalaniu leku Taxol z komórek, co prowadzi do zmniejszenia toksyczności leku wewnątrzkomórkowej7. Ponieważ szeroka gama leków chemioterapeutycznych są substratami tych transportowanych ABC, ich nadekspresja ogranicza stosowanie innych leków chemioterapeutycznych, powodując wielooporność na leki (MDR)8. Hamowanie transportowanych ABC okazało się w dużej mierze nieskuteczne jako strategia przeciwdziałania wielooporności na leki w warunkach klinicznych, głównie ze względu na ich powszechne występowanie i istotne role w transporcie szerokiej gamy endogennych i egzogennych substratów9. Mimo że werapamil, inhibitor ABCB1 pierwszej generacji, wykazał ograniczone lub żadne korzyści kliniczne i był związany z znaczącą toksycznością w badaniach klinicznych10, pozostaje on cennym narzędziem eksperymentalnym do zwiększania wydajności selekcji w in vitro modelach MDR.
Fenotyp MDR jest dynamicznym i adaptacyjnym procesem, który zwykle pojawia się w warunkach stresu2. Ekspresja transportowanych ABC jest przede wszystkim kontrolowana przez mechanizmy regulacji transkrypcyjnych i epigenetycznych, a nie przez zdarzenia mutacyjne5,11. Ograniczenie bezpośredniego kierowania na transportowane ABC podkreśla potrzebę zidentyfikowania regulatorów układowych tych białek jako słabości specyficznych dla komórek opornych. Dlatego też systematyczne badanie czynników epigenetycznych stało się ważną strategią identyfikacji nowych regulatorów oporności na chemioterapię i opracowania terapii skojarzonych, których celem są te słabości.
Screeningi funkcjonalne oparte na CRISPR-Cas9 umożliwiają bezstronne, systematyczne zaburzenia genomowe w skali genomu w celu badania efektów utraty genów w raku12. Jednak biblioteki CRISPR w całym genomie oferują ograniczoną reprezentację pojedynczych RNA przewodnikowych (sgRNA) na gen, co zmniejsza czułość w porównaniu z bibliotekami skupionymi13. Co ważne, solidny screening nie tylko zależy od jakości zaburzeń, ale również od odpowiedniego modelu i zoptymalizowanego protokołu eksperymentalnego. W tym kontekście, badanie dynamicznego i złożonego procesu takiego jak oporność na leki może skorzystać na skupionym bibliotece z niestandardowym protokołem13. W poprzedniej pracy, stworzyliśmy bibliotekę knockout CRISPR-Cas9 skoncentrowaną na epigenomiu w celu kierowania na regulatorów chromatyny14. W porównaniu z innymi dostępnymi publicznie bibliotekami CRISPR skoncentrowanymi na epigenomiu, biblioteka knockout epigenomicznych (EPIKOL) zawiera 779 genów, składających się z czytaczy, pisarzy, mazańców chromatyny i związanych z nimi białek, każdy z nich ukierunkowany z 10 sgRNA, co umożliwia zwiększenie głębokości na gen i poprawę solidności i powtarzalności przesiewów funkcjonalnych skoncentrowanych na chromatynie14. EPIKOL jest dostępna zarówno w systemie LentiGuide, w którym Cas9 jest ekspresowany z różnego wektora, jak i w systemie LentiCRISPR, który zawiera Cas9, co zapewnia elastyczność w zależności od linii komórkowej. Osiągnięcie wystarczającego pokrycia biblioteki, zdefiniowanego jako średnia liczba komórek na sgRNA (np. 500×–1000×) jest łatwiejsze dla EPIKOL w porównaniu z bibliotekami w całym genomie, co daje przewagę podczas badania wolno rosnących chemooropornych linii komórkowych.
Chociaż przesiewy CRISPR oferują potężne podejście do badania mechanizmów oporności na chemioterapię, standardowe przesiewy zgrupowane nie są

<table><tbody><tr><td>100 mm plate</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>45 &micro;m filter&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>96-well black clear bottom plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>For CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>For selection</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo luminescent cell viability assay</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>For CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12 nutrient mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td></td><td></td><td>Kind gifts from Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>For Cas9-stable cell line generation</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>Backbone for gRNA cloning&nbsp;</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin tissue kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>For genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>Backbone for gRNA cloning&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>For lentivirus concentration</td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>For lentivirus production</td></tr><tr><td>Protamine sulfate (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>For lentivirus infection</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>For lentivirus production</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>For selection</td></tr><tr><td>SUM159PT adherent cells</td><td></td><td></td><td>Kind gifts from Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).</td></tr><tr><td>Taxol</td><td>Paclitaxel, Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>For res cell generation and maintenance</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>For selection</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>For lentivirus production</td></tr></tbody></table>

przesiewowe wyłączenia oparte na crispr-cas9 na poziomie epigenomu w chemoopornych komórkach

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

Oporność na chemioterapię pozostaje głównym wyzwaniem w leczeniu raka, spowodowana zdolnością komórek nowotworowych do nabywania właściwości adaptacyjnych, przełączania ścieżek sygnałowych i modyfikacji struktury chromatyny w celu uniknięcia cytotoksyczności wywołanej lekami. Ponieważ procesy te w dużym stopniu opierają się na mechanizmach epigenetycznych, które regulują organizację chromatyny i elastyczność transkrypcyjną, regulatorzy epigenetyczni wyłonili się jako kluczowy czynnik oporu na chemioterapię. Aby zbadać oporność na paklitaksel, jeden z najczęściej stosowanych leków chemioterapeutycznych w raku piersi potrójnie ujemnym (TNBC), zastosowaliśmy bibliotekę knockoutową skupioną na epigenomiu (EPIKOL), bibliotekę opartą na CRISPR-Cas9, zaprojektowaną w celu systematycznego zakłócania genów zaangażowanych w regulację chromatyny. Linie komórek opornych na chemioterapię zostały wygenerowane poprzez stopniowe zwiększanie dawki, które odbija klinicznie istotną adaptację do leków. Jednak te odporne komórki wykazują fenotyp wielolekooporności (MDR), co stanowi znaczne wyzwanie dla efektywnej transdukcji wirusowej i selekcji stabilnych populacji komórek. W niniejszym badaniu opisano kluczowe kroki metodologiczne umożliwiające osiągnięcie wysokiej efektywności transdukcji lentiwirusowej i selekcji, co umożliwiło pomyślne zastosowanie ekranowania CRISPR EPIKOL w modelach opornych chemioterapii TNBC. Zgodnie z opisanym protokołem przeprowadzono ekranowanie CRISPR na poziomie epigenomicznym komórek TNBC opornych na chemioterapię i zidentyfikowano nowe regulatorzy epigenetyczne oporu na chemioterapię. Ten protokół zapewnia solidną ramę do identyfikacji regulatorów epigenetycznych, które przyczyniają się do nabytej oporu na paklitaksel, stosując podejście oparte na CRISPR oparte na utracie funkcji.

Aby zbadać epigenetyczne regulatory chemooporności w TNBC, zastosowano ogólny protokół z wykorzystaniem linii komórkowej SUM159PT, przedstawiony na Rysunku 1. Najpierw wartości IC10 i IC50 Taxolu w komórkach SUM159PT określono poprzez traktowanie komórek rosnącymi stężeniami Taxolu (Rysunek 2A). W celu wygenerowania opornych na Taxol komórek SUM159PT zastosowano metodę stopniowej eskalacji dawki. Po kilku miesiącach przesunięcie wartości IC50 ilustruje pomyślne ustanowienie fenotypu opornego przy użyciu tego protokołu w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które były pasażowane równolegle bez ekspozycji na Taxol (Rysunek 2B).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat badania przesiewowego EPIKOL w komórkach SUM159PT opornych na Taxol. Ogólny schemat badania przesiewowego EPIKOL w wygenerowanych komórkach SUM159PT opornych na Taxol. Rycina została przygotowana w BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Po uzyskaniu linii komórek opornych przeprowadzono szereg eksperymentów w celu scharakteryzowania zmian fenotypowych i molekularnych. Zdolność do proliferacji komórek opornych podczas leczenia Taxolem oceniono za pomocą testu tworzenia kolonii w porównaniu z komórkami rodzicielskimi. Jak pokazano na Rysunku 2C,D, komórki oporne zachowują zdolność do proliferacji podczas leczenia Taxolem, podczas gdy komórki rodzicielskie nie są w stanie przeżyć. Test ten jest jednym z kluczowych etapów charakterystyki komórek opornych i demonstruje sposób oceny zdolności do proliferacji pod wpływem leku w porównaniu między komórkami rodzicielskimi a opornymi.
W ramach charakterystyki komórek opornych przeprowadzono sekwencjonowanie RNA komórek wyjściowych oraz opornych, aby przeanalizować zmiany transkryptomiczne związane z chemoopornością (Rysunek 2E). Wśród genów o najwyższym stopniu nadekspresji w komórkach opornych znajdował się ABCB1, a następnie kilka innych transporterów ABC, w tym ABCB4 i ABCA5. Nadekspresję ABCB1 potwierdzono za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w łańcuchu (qPCR), co obrazuje sposób walidacji zmian w ekspresji genów kandydackich z wykorzystaniem qPCR (Rysunek 2F).
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Generowanie komórek opornych i ich charakterystyka. (A) Schemat przedstawiający generowanie komórek SUM159PT opornych na Taxol metodą stopniowego zwiększania dawki. (B) Krzywa odpowiedzi na dawkę wykazująca różnicę między wartościami IC50 dla komórek wyjściowych a wygenerowanych komórek opornych. IC50 komórek wyjściowych = 6 nM, a IC50 komórek opornych na Taxol = 355.4 nM. (C) Test tworzenia kolonii w obecności Taxolu. (D) Kwantyfikacja powierzchni kolonii z (C). Dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya przeprowadzono przy użyciu programu Prism 8 (GraphPad Software). Poziomy istotności określono jako *P &#60; 0.05, **P &#60; 0.01, ***P &#60; 0.001. (E) Wykresy wulkaniczne (volcano plots) przedstawiające geny o różnej ekspresji w komórkach Taxol-Res w porównaniu z komórkami wyjściowymi, z odcięciem LFC&#62;2 i p&#60;0.001. (F) Walidacja qPCR ekspresji mRNA ABCB1 w komórkach wyjściowych i Taxol-Res. Wartości P wyznaczono za pomocą dwustronnego testu t Studenta w porównaniu z grupą kontrolną; **P &#60; 0.01. Panel A został stworzony za pomocą BioRender.com. Rysunek w panelu E został zmodyfikowany za zgodą autorów Yedier-Bayram i wsp.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po wykazaniu nadekspresji ABCB1 oraz innych transporterów ABC w komórkach opornych na Taxol i biorąc pod uwagę szerokie spektrum substratowe ABCB1, oceniono występowanie fenotypu MDR. W tym celu komórki oporne na Taxol poddano działaniu wielu leków, które są znanymi substratami transportera ABCB1 i posiadają różne mechanizmy działania, a następnie oceniono ich wrażliwość na te leki (Rysunek 3A,B). Zgodnie z zaobserwowanym profilem ekspresji transporterów ABC, komórki oporne na Taxol wykazały również oporność na doxorubicynę i winkrystynę, co potwierdziło obecność profilu MDR i zilustrowało sposób funkcjonalnej oceny fenotypu wielolekooporności.
Fenotyp MDR stanowi wyzwanie dla metody przesiewowej opartej na systemie CRISPR, EPIKOL, ponieważ biblioteka wymaga selekcji puromycyną w celu wzbogacenia populacji komórek transdukowanych. Ponieważ puromycyna może być usuwana z komórek poprzez efekt wysyłania leków zależny od ABCB1, selekcja puromycyną może być mało wydajna w komórkach opornych (Rycina 3C). W konsekwencji komórki nietransdukowane mogą przetrwać selekcję, co prowadzi do błędnych wyników przesiewu.
Aby wyeliminować to ograniczenie, proces selekcji komórek chemoopornych o profilu MDR został zoptymalizowany przed przesiewaniem EPIKOL. Verapamil, inhibitor ABCB1 pierwszej generacji, został użyty do zablokowania efleksu leków zapośredniczonego przez transportery ABC, co umożliwiło wewnątrzkomórkową akumulację środków chemioterapeutycznych lub puromycyny (Rysunek 3D). O ile sam verapamil nie wpływał na żywotność komórek, o tyle przy zastosowaniu w połączeniu ze środkami chemioterapeutycznymi przywracał on wrażliwość na leki (Rysunek 3E,F). Podobnie krzywe przeżywalności po podaniu puromycyny w połączeniu z nietoksycznymi dawkami verapamilu wykazały, że inhibicja ABCB1 przywraca wrażliwość na puromycynę (Rysunek 3G,H). Zapewnia to, że komórki, które przeżyły selekcję, są tymi, które zostały pomyślnie transdukowane, a nie komórkami, które uniknęły selekcji z powodu efleksu leków napędzanego przez ABCB1. Ustanowienie skutecznego schematu selekcji w komórkach chemoopornych jest kluczowe dla wiarygodnych wyników przesiewania EPIKOL.
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Fenotyp wielolekooporności oraz wpływ werapamilu na komórki oporne. Krzywe zależności dawka-odpowiedź wykazujące różnice w wartościach IC50 między komórkami macierzystymi a wygenerowanymi komórkami opornymi w przypadku (A) doksorubicyny, (B) winkrystyny, (C) puromycyny. (D) Schemat przedstawiający selekcję komórek SUM159PT opornych na Taxol z dodatkiem i bez dodatku werapamilu. Rysunek został przygotowany za pomocą BioRender.com. (E) Test żywotności komórek Taxol-Res w celu określenia optymalnego stężenia werapamilu przy zastosowaniu Taxolu. (F) Werapamil resensytyzuje komórki oporne na Taxol względem Taxolu. (G) Werapamil nie zmienia odpowiedzi komórek macierzystych na puromycynę. (H) Werapamil przywraca wrażliwość na puromycynę w komórkach Taxol-Res. Panele A, B i F zostały wykorzystane ponownie za zgodą Yedier-Bayram i wsp.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W celu zidentyfikowania nowych regulatorów chemooporności w TNBC przeprowadzono przesiew EPIKOL z wykorzystaniem komórek SUM159PT opornych na Taxol, zgodnie z ilustracją na Ryc. 4A. Ponieważ komórki oporne rosną wolniej niż komórki rodzice17, podczas całego przesiewu monitorowano poziom podwojeń populacji zarówno w grupie traktowanej Taxolem, jak i w grupie traktowanej DMSO, aby określić czas potrzebny do osiągnięcia 16 podwojeń populacji (Ryc. 4B). W związku z tym przesiew EPIKOL dla grupy traktowanej DMSO zakończono około 35. dnia, natomiast grupę traktowaną Taxolem hodowano przez dodatkowe 15 dni, aby osiągnęła ten sam poziom podwojenia populacji.
Po sekwencjonowaniu wykorzystano potok analizy MAGeCK, aby połączyć efekty sgRNA celujących w ten sam gen, w celu ujawnienia zmian na poziomie genów po ich nokautcie24. Biblioteka EPIKOL zawiera sgRNA celujące w geny niezbędne do przeżycia jako kontrole pozytywne; pierwszym etapem kontroli jakości była ocena, czy sgRNA te uległy ubytkowi zgodnie z oczekiwaniami. Wykresy kaskadowe (waterfall plots) ilustrują zmiany Log2 fold changes dla genów niezbędnych w różnych porównaniach (Ryc. 4C–E). Kiedy próbki z końcowego punktu czasowego z warunków traktowanych DMSO lub Taxolem porównano z punktem początkowym, niemal wszystkie geny niezbędne uległy ubytkowi po nokautcie, co wskazuje na efektywność przesiewu (Ryc. 4C,D). Jednakże ubytku tego nie zaobserwowano wyraźnie podczas porównywania dwóch próbek końcowych (traktowanych DMSO i traktowanych Taxolem), co było oczekiwane, ponieważ geny niezbędne są wymagane do przeżycia komórek w obu warunkach (Ryc. 4E).
Alternatywną wizualizacją wyników przesiewu jest wykres wulkaniczny (volcano plot), który przedstawia logarytmiczną zmianę krotności (Log2 fold change) wraz z istotnością statystyczną (wartością p lub FDR). W przesiewie EPIKOL przeprowadzonym w komórkach opornych na Taxol zidentyfikowano wiele genów kontroli pozytywnej jako znacząco uszczuplone, co dodatkowo potwierdza wiarygodność przesiewu, ponieważ uszczuplenie sgRNA celujących w geny kontroli pozytywnej stanowi typową kontrolę jakości udanego badania (Rycina 4F). Oprócz kontroli genów niezbędnych, biblioteka EPIKOL zawiera specyficzne dla kontekstu sgRNA kontroli pozytywnej celujące w kilka genów transporterów ABC. Zgodnie z oczekiwaniami, znormalizowane liczby sgRNA dla ABCB1 w różnych grupach wykazały znaczące uszczuplenie sgRNA celujących w ABCB1 konkretnie w grupie traktowanej Taxolem (Rycina 4G). Ogólnie dowodzi to, w jaki sposób zmiany na poziomie sgRNA mogą być interpretowane w celu zidentyfikowania genów kandydatów związanych z odpowiedzią na lek.
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71175/71175fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Wyniki przesiewu EPIKOL w komórkach opornych na Taxol oraz przykładowe wykresy. (A) Schemat protokołu przesiewu EPIKOL. (B) Poziom podwojenia populacji (PDL) komórek Taxol-Res. (C–E) Wykresy kaskadowe (waterfall plots) przedstawiające wyniki przesiewu EPIKOL w komórkach Taxol-Res, z zaznaczeniem genów niezbędnych; grupa traktowana DMSO w porównaniu do punktu początkowego w panelu C, grupa traktowana Taxolem w porównaniu do punktu początkowego w panelu D, grupa traktowana Taxolem w porównaniu do grupy traktowanej DMSO w panelu E. (F) Wykres wulkaniczny (volcano plot) przedstawiający Log2FoldChanges genów w próbkach traktowanych Taxolem w porównaniu do punktu początkowego. Geny o p&#60;0,05 zostały pokolorowane i opisane. Rycina ta została zmodyfikowana z poprzedniej publikacji17. (G) Wykresy liczby odczytów na milion (rpm) dla 10 różnych sgRNA ABCB1 z EPIKOL. Panel A został przygotowany za pomocą BioRender.com. Panel E został wykorzystany ponownie za zgodą autorów Yedier-Bayram et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/71175fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Tabela rozwiązywania problemów.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Obliczanie miana wirusa i MOI.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Lista sgRNA biblioteki EPIKOL.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Primery użyte w przygotowaniu biblioteki do sekwencjonowania EPIKOL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71175/Supplementary Table 4.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy tutaj protokół do generowania komórek chemooroporniczych za pomocą podejścia o stopniowym zwiększaniu dawki, poprzedzony przez przesiewowe badanie oparte na CRISPR/Cas9 przy użyciu skupionej biblioteki sgRNA, która ma na celu modyfikatory epigenetyczne, w celu zidentyfikowania regulatorów nabytej chemooropornosci. Protokół oferuje również wiele punktów optymalizacji dostosowanych do modeli komórek chemooroporniczych, zapewniając solidne ramy dla badaczy zajmujących się mechanizmami oporu.

Przesiewowe wyłączenia oparte na CRISPR-Cas9 na poziomie epigenomu w chemoopornych komórkach

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

Badamy mechanizmy epigenetyczne napędzające chemooporność w potrójnie ujemnym raku piersi, wykorzystując podejścia oparte na przesiewaniu CRISPR. Na początek należy wysiać około 159 przylegających komórek PT w zagęszczeniu 2 × 10³ komórek na dołek w czarnych płytkach 96-dołkowych z przezroczystym dnem, stosując pożywkę Ham's F-12 Nutrient Mix uzupełnioną o przedstawione składniki. Komórki należy inkubować przez 16 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Następnie przygotować roztwór zapasowy Taxolu rozpuszczony w dimetylosulfoksydzie lub DMSO. W celu potraktowania komórek przygotować rozcieńczenia szeregowe Taxolu w pożywce hodowlanej w zakresie od 0,3 nM do 10 µM, stosując sam DMSO jako kontrolę nośnika. Potraktować komórki 200 µL rosnących dawek Taxolu w trzech powtórzeniach.Pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 72 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Po 72 godzinach traktowania lekiem oceń żywotność komórek, wykorzystując luminescencyjny test ilościowego oznaczania ATP. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek i znormalizuj wyniki względem wartości kontroli DMSO.Następnie, oblicz wartości stężeń hamujących IC10 i IC50 za pomocą regresji nieliniowej z zastosowaniem czteroparametrowego logistycznego modelu odpowiedzi na dawkę w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym. Aby rozpocząć generowanie komórek chemoopornych, wysiej 2 × 10⁵ komórek 159 PT na dołek w płytkach 6-dołkowych. Następnie inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.Następnego dnia poddaj komórki działaniu Taxolu w stężeniach hamujących 10% lub 50% w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej przez 72 godziny. Jeśli komórki tolerują aktualne stężenie leku, rozdziel je do dwóch studzienek. Jedną zachowaj jako kontrolną z zapasem, stosując świeżą pożywkę, a w drugiej studniencie podwoj stężenie Taxolu.Podczas generowania komórek opornych, pasażuj komórki rodzicielskie w pożywce zawierającej DMSO jako kontrolę i dostosuj objętość DMSO tak, aby odpowiadała ilości obecnej w odpowiadającym im leczeniu Taxolem. Pomierz żywotność komórek co trzy do czterech tygodni, aż do momentu zaobserwowania istotnej różnicy w wartościach stężenia hamującego 50% między liniami komórkowymi rodzicielskimi a opornymi. Utrzymuj stabilne komórki oporne w końcowym stężeniu Taxolu stosowanym podczas zwiększania dawki.W celu charakterystyki komórek opornych należy przeprowadzić sekwencjonowanie RNA, analizę Western blotting, qPCR oraz testy żywotności komórek w obecności leku. Wysiać komórki 159 PT oporne na Taxol oraz komórki rodzicielskie w trzech powtórzeniach do czarnych płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem, w zagęszczeniu 2×10³ komórek na dołek. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.Komórki należy poddać działaniu dwukrotnych rozcieńczeń szeregowych werapamilu, w zakresie od 80 µM do 1,25 µM, utrzymując stałe stężenie Taxolu we wszystkich warunkach traktowania. Po 72 godzinach inkubacji należy ocenić żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu ilościowego ATP. Następnie należy wyznaczyć stężenie werapamilu, które utrzymuje żywotność komórek, jednocześnie przywracając wrażliwość w komórkach opornych.Aby wyznaczyć stężenie puromycyny do zastosowania w połączeniu z werapamilem, wysiej komórki 159 PT oporne na Taxol do płytki 96-dołkowej w zagęszczeniu 2 × 10³ komórek na dołek. Inkubuj płytkę przez 16 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przygotuj dwukrotne rozcieńczenia seryjne puromycyny w zakresie od 40 do 0,625 µg/mL w pożywce zawierającej wcześniej ustalone stężenie werapamilu.Inkubuj komórki z odpowiednimi rozcieńczeniami puromycyny przez 72 godziny. Po przeprowadzeniu testu żywotności określ najniższe stężenie puromycyny, które redukuje żywotność do 5% lub mniej w obecności werapamilu. Następnie wykorzystaj komórki 159 PT oporne na Taxol do obliczenia miana wirusa oraz wielokrotności infekcji (MOI).Obliczoną objętość lentiwirusa Cas9, dobraną na podstawie pożądanej wielokrotności infekcji (MOI), dodać bezpośrednio do komórek w pożywce hodowlanej zawierającej 8 µg/mL siarczanu protaminy. Po 16 godzinach od infekcji zastąpić pożywkę z wirusem świeżą pożywką. Następnego dnia przeprowadzić selekcję blastycydyną, wymieniając pożywkę hodowlaną na pożywkę zawierającą wcześniej ustalone stężenie blastycydyny.Kontynuuj selekcję do czasu wyeliminowania niezinfekowanych komórek. Zweryfikuj aktywność Cas9, stosując kontrolne pojedyncze RNA przewodzące dla genów niezbędnych lub wykorzystując GFP jako reporter do oceny wydajności nokautu. Oblicz liczbę pomyślnie zinfekowanych komórek niezbędną do osiągnięcia pożądanej liczby kopii biblioteki, korzystając z przedstawionego równania.Przygotuj niezależne mieszaniny do infekcji dla każdego powtórzenia biologicznego. Po wysianiu wcześniej obliczonej liczby komórek, zainfekuj je określoną objętością wirusa w 8 mL pełnej pożywki hodowlanej zawierającej 8 µg/mL siarczanu protaminy. Po 16 godzinach zastąp pożywkę z wirusem świeżą pożywką i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.Przeprowadzić selekcję puromycyną w obecności werapamilu w uprzednio określonych stężeniach, aby wzbogacić populację komórek zainfekowanych sg-RNA w niektórych komórkach 159 PT opornych na Taxol. Kontynuować selekcję do czasu wyeliminowania wszystkich komórek na płytce kontrolnej niezainfekowanej. Zazwyczaj trwa to około trzech dni.Po zakończeniu selekcji puromycyną i werapamilem, poddaj komórki trypsynizacji i pobierz próbkę wyjściową (pellet komórkowy z czasu zero) z każdego powtórzenia biologicznego, zgodnie z poziomem pokrycia ustalonym podczas transdukcji. Podziel komórki na grupy eksperymentalne, zachowując odpowiednie pokrycie. Jedną grupę wyznacz jako kontrolną z DMSO.A drugą jako grupę traktowaną Taxolem. Hodowle utrzymuj przez 14 do 16 podwojeń populacji. Oblicz poziom podwojenia populacji, korzystając z określonego wzoru.Przy każdym pasażu należy monitorować żywotność komórek i kinetykę wzrostu. Należy utrzymywać odpowiednią liczbę komórek, aby uniknąć efektu wąskiego gardła. Po osiągnięciu pożądanego poziomu podwojenia populacji należy zebrać osady dla końcowego punktu czasowego dla każdej repliki i warunku, zachowując przy tym pokrycie biblioteki na każdy osad.Osady należy przechowywać w temperaturze 80 °C do czasu przeprowadzenia późniejszej ekstrakcji genomowego DNA. Komórki oporne nadal proliferowały pomimo zastosowania Taxolu, podczas gdy komórki rodzicielskie nie przeżyły w tych samych warunkach. Sekwencjonowanie RNA wykazało, że ABCB1 jest jednym z najbardziej upregulowanych genów w komórkach opornych, a za nim następują inne transportery ABC, w tym ABCB4 i ABCA5.Zwiększenie ekspresji ABCB1 w komórkach opornych potwierdzono za pomocą ilościowej PCR. Komórki oporne na Taxol wykazywały fenotyp wielolekowości oraz oporność na doksorubicynę i winkrystynę. Selekcja puromycyną może być nieefektywna w komórkach opornych, ponieważ puromycyna może być usuwana z komórki poprzez efflux leków zależny od ABCB1.Sam verapamil nie wpływał na żywotność komórek. Jednakże w połączeniu z lekami chemioterapeutycznymi verapamil przywracał wrażliwość na te środki. Nietoksyczne dawki verapamilu przywracały również wrażliwość na puromycynę w komórkach opornych na Taxol.Kiedy próbki z końcowego punktu czasowego z warunków traktowanych DMSO lub Taxolem porównano z punktem początkowym, niemal wszystkie geny niezbędne uległy ubytkowi po nokaucie, co potwierdziło jakość przesiewu. W przeciwieństwie do tego, porównanie próbek końcowych traktowanych DMSO i Taxolem nie wykazało ubytku genów niezbędnych, ponieważ geny te pozostają niezbędne w obu grupach. Zamiast tego, porównanie to ujawnia modyfikatory epigenetyczne uwrażliwiające na Taxol.Wielokrotne geny kontroli pozytywnej oraz modyfikatory epigenetyczne zostały znacząco usunięte w badaniu przesiewowym EPIKOL przeprowadzonym w komórkach opornych na Taxol. Pojedyncze sgRNA celujące w ABCB1 zostały specyficznie usunięte w grupie traktowanej Taxolem, co potwierdziło rolę ABCB1 jako kontroli pozytywnej dla wrażliwości na Taxol w tym badaniu. Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę oporności terapeutycznej w modelach nowotworowych oraz identyfikację epigenetycznych regulatorów oporności na chemioterapię z wykorzystaniem platform przesiewowych CRISPR.Najważniejszymi kwestiami podczas przesiewania komórek chemoopornych są utrzymanie reprezentatywności biblioteki oraz optymalizacja warunków transdukcji i selekcji. Dalsze prace pozwolą na zidentyfikowanie podatności terapeutycznych wielolekoopornych komórek nowotworowych i opracowanie nowych podejść kombinowanych w celu przełamania chemooporności.

epigenome-wide-crispr-cas9-based-knockout-screens-on-chemoresistant

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.

Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Aby rozszerzyć możliwości laboratoriów na całym świecie do oceny kwalifikacji pacjentów z rakiem płuc do leczenia pembrolizumabem, w wiarygodny i powtarzalny sposób, opracowaliśmy test, który wykorzystuje koncentrat przeciwciał 22C3 na powszechnie dostępnym immunohistochemicznym autostainerze, zarówno dla próbek biopsyjnych, jak i cytologicznych.

Stosowanie przeciwciała 22C3 anty-PD-L1 Skoncentruj się na próbkach biopsji i cytologii od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Tutaj demonstrujemy metodę przykładania naprężeń ścinających płyn do komórek rakowych w zawiesinie, aby modelować wpływ stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe.

Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Koç University School of Medicine.  Here, we present a protocol for generating chemoresistant cells using a dose-escalation approach, followed by a CRISPR/Cas9-based screen using a focused sgRNA library targeting epigenetic modifiers to identify regulators of acquired chemoresistance. The protocol also provides multiple optimization points tailored to chemoresistant cell models, offering a robust framework for researchers investigating resistance mechanisms.

Przesiewowe wyłączenia oparte na CRISPR-Cas9 na poziomie epigenomu w chemoopornych komórkach

Przeglądaj więcej filmów