Izolacja i Walidacja Podpopulacji Komórek Macierzystych Mezenchymalnych Pozytywnych na Podoplaniny za Pomocą Pośredniej Strategii Używającej Magnesycznych Cząstek
23 czerwca 2026
Ten protokół opisuje metodę sortowania opartą na magnesowych kulkach z wykorzystaniem przeciwciał cytometrii przepływowej oznaczonych fykoerytryną (PE) i przeciwciał anty-PE w celu izolacji określonych subpopulacji komórek macierzystych mezenchymalnych o wysokiej dodatniości markera posortowania i zachowanej proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach, bez konieczności stosowania drogich sorterów komórkowych lub specyficznych dla celu niestandardowych kulek.
Nasze badania koncentrowały się na izolowaniu określonego podzbioru komórek macierzystych mezenchymalnych dla opłacalnego zmiękczania magnetycznych perełek o wysokiej czystości i czytelności. Ten protokół może być stosowany do dowolnego białka błonowego przy użyciu standardowych przeciwciał sprzężonych z PE. Aby rozpocząć, zbierz wymagane reagenty.
Wybierz komórki macierzyste mezenchymalne, lub MSC, z przelewów od trzech do pięciu, które osiągnęły 80 do 90%konfluencji. Wymieć środowisko kulturowe. Wypłucz komórki dwa razy z 10 mililitrami podgrzanego PBS.
Delikatnie kołysz naczynie i wymieć PBS. Dodaj dwa mililitry 0,25%trypsyny-EDTA i inkubować w 37 stopniach Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Pod mikroskopem obserwuj komórki, aż się zaokrąglą i zaczną się odczepiać.
Dodaj cztery mililitry środowiska kulturowego zawierającego 16,5%FBS, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie pipetuj komórki, aby zapewnić całkowite oderwanie i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej epruwetki do wirowania. Wiruj zawiesinę komórek przy 300 g przez trzy minuty i wymieć nadstan.
Ponownie zawieś pellet komórek w jednym mililitru buforu. Policz komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek. Wiruj i wymiej nadstan jak wcześniej pokazano.
Ponownie zawieś komórki z buforem, aby osiągnąć gęstość 100 milionów komórek na mililitr. Przenieś zawiesinę komórek do pięciomililitrowej polistyrenowej epruwetki z zaokrąglonym dnem. Dodaj 10 mikrolitrów blokera Fc gamma RII na 10 milionów komórek.
Delikatnie mieszaj i inkubujej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj pięć mikrolitrów sprzężonego z fykoerytryną lub PE przeciwciała przeciwko ludzkiemu podoplaninowi lub PDPN na 10 milionów komórek. Delikatnie mieszaj i inkubujej w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut, chroniąc przed światłem.
Dodaj 10 mikrolitrów koktajlu selekcyjnego na 10 milionów komórek. Delikatnie mieszaj i inkubujej w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Użyj mieszadła wirtualnego, aby energicznie mieszać fiolkę z perłami magnetycznymi przez 30 sekund.
Dodaj pięć mikrolitrów perełek magnetycznych na 10 milionów komórek. Delikatnie mieszaj i inkubujej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieść pięciomililitorową polistyrenową epruwetkę z zaokrąglonym dnem zawierającą oznakowane próbki komórek w stojaku do separacji magnetycznej.
Dodaj bufor do epruwetki, aby uzyskać całkowity objętość 2,5 do trzech mililitrów. I inkubujej w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Trzymając magnes i epruwetkę razem jako jedną jednostkę, odwróć je, aby wylać nadstan do nowej epruwetki do zbierania.
Umieść zebraną frakcję komórek PDPN ujemnych na lodzie. Powtórz procedurę separacji magnetycznej trzy razy jak wcześniej pokazano, wylewając nadstan do tej samej epruwetki do zbierania frakcji PDPN ujemnych po każdej separacji. Po ostatnim płukaniu, usuń epruwetkę zawierającą magnetycznie związaną frakcję komórek PDPN dodatnich ze stojaka do separacji magnetycznej.
Dodaj trzy mililitry buforu, aby ponownie zawieś dodatnie komórki. Przenieś zawiesinę dodatnich komórek do świeżo oznakowanej epruwetki. Policz komórki z dodatnich i ujemnych epruwetek.
Zapisz wydajność komórek dla każdej frakcji. Wiruj zawiesinę dodatnich komórek przy 300 g przez trzy minuty i wymiej nadstan. Ponownie zawieś pellet komórek w środowisku kulturowym MEM alpha zawierającym 16,5%FBS.
Dostosuj gęstość komórek według potrzeb i wysiej komórki do płytek kulturowych lub kolb. Inkubowaj komórki w 37 stopniach Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po zliczeniu komórek, wysiej je na 100-milimetrowej płytce kulturowej w gęstości trzech milionów komórek na płytkę w 12 mililitrach środowiska kulturowego.
24 godziny po wysiewie, obserwuj przyleganie komórek. Wymień środowisko kulturowe na świeże, aby usunąć pozostałe perły magnetyczne i komórki nieprzylegające. Zbierz komórki przez trypsynizację.
Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół 10 do 15 razy, aby oderwać i usunąć perły magnetyczne i pozostałości przeciwciał. Oceń procent komórek PDPN PE-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej. Zbieraj komórki podczas fazy wzrostu logarytmicznego.
Wysiej komórki do płytki 96-dołkowej. W różnych punktach czasowych, dodaj zestaw do liczenia komórek Kit-8m lub CCK-8, reagent i zmierz absorpcję zgodnie z instrukcjami producenta. Tabulując dane przed sortowaniem i po sortowaniu dla różnych punktów czasowych w oprogramowaniu GraphPad Prism, a następnie kliknij na dane, aby wykreślić krzywą proliferacji.
Po blokowaniu receptorów FC, oznakowaniu przeciwciał i separacji magnetycznej, końcowa liczba komórek wynosiła około 3,5 miliona komórek dla frakcji PDPN dodatnich i 6,4 miliona komórek dla frakcji PDPN ujemnych. Przed sortowaniem magnetycznym, częstotliwość komórek PDPN dodatnich w początkowej populacji komórek wynosiła 38,7% Po sortowaniu, frakcja dodatnia zawierała 97,
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestandaryzowany protokół sortowania za pomocą kulek magnetycznych w celu izolacji subpopulacji mezenchymalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem przeciwciał do cytometrii przepływowej znakowanych fykoerytryną (PE) oraz magnetycznych kulek anty-PE. To podejście z pośrednim sprzężeniem umożliwia wzbogacenie docelowych komórek bez konieczności stosowania kosztownych sorterów cytometrycznych lub specjalistycznych kulek magnetycznych. Wykorzystując jako model komórki dodatnie podoplaniny (PDPN), metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości po sortowaniu przy jednoczesnym zachowaniu proliferacji i aktywności metabolicznej komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki separacji komórek
- Heterogeniczność mezenchymalnych komórek macierzystych
Wprowadzenie
- Heterogeniczność funkcjonalna mezenchymalnych komórek macierzystych wymaga izolacji specyficznych subpopulacji
- Komercyjnie dostępne kulki magnetyczne dla większości białek błonowych są ograniczone lub niedostępne
- Produkcja kulek na zamówienie wiąże się z długim czasem oczekiwania i wysokimi kosztami
- Komórki PDPN-dodatnie służą jako model dla rzadkich lub słabo zbadanych markerów powierzchniowych
Cel badania
- Opracowanie ustandaryzowanego protokołu pośredniego sortowania koralikami magnetycznymi z wykorzystaniem przeciwciał znakowanych PE
- Umożliwienie wzbogacania populacji komórek docelowych bez użycia sorterów cytometrycznych
- Zapewnienie kosztownej i szybkiej alternatywy dla produkcji dedykowanych koralików magnetycznych
- Walidacja metody z użyciem mezenchymalnych komórek macierzystych wykazujących ekspresję PDPN
Zastosowane metody
- przeciwciała do cytometrii przepływowej znakowane PE, skierowane przeciwko białkom powierzchniowym komórek
- dostępne handlowo magnetyczne kuleczki anty-PE do sprzęgania pośredniego
- sortowanie mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą kuleczek magnetycznych
- walidacja po sortowaniu poprzez ocenę pozytywności na PDPN
- test CCK-8 do pomiaru proliferacji i aktywności metabolicznej
Główne wyniki
- Skuteczne wzbogacenie subpopulacji mezenchymalnych komórek macierzystych wykazujących pozytywność w kierunku PDPN
- Osiągnięto wysoką pozytywność PDPN po sortowaniu
- Zachowana proliferacja i aktywność metaboliczna w porównaniu z niesortowanymi MSC
- Protokół możliwy do adaptacji dla innych dostępnych markerów powierzchniowych po optymalizacji
Wnioski
- Niebezpośrednia metoda z użyciem przeciwciała PE/kulek anty-PE umożliwia wydajną i niskokosztową izolację subpopulacji MSC
- Eliminuje zależność od specjalistycznych kulek magnetycznych i sorterów cytometrycznych
- Odpowiednia dla rzadkich lub słabo zbadanych markerów powierzchniowych z dostępnymi epitopami
- Zachowuje żywotność i funkcję komórek po sortowaniu, co wspiera dalsze zastosowania
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna izolacja rzadkich subpopulacji mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak komórki wykazujące ekspresję podoplaniny, ma kluczowe znaczenie dla walidacji celu i funkcjonalnego ograniczania ryzyka we wczesnej fazie odkrywania. Strategia pośredniego wykorzystania kulek magnetycznych z użyciem przeciwciał znakowanych PE oraz kulek anty-PE umożliwia szybkie i kosztowo efektywne wzbogacanie docelowych populacji komórek bez konieczności stosowania dedykowanych odczynników lub sorterów cytometrycznych. Podejście to wspomaga skalowalną selekcję portfela projektów i przyspiesza badania translacyjne nad słabo rozpoznanymi markerami powierzchniowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę specyficznych subpopulacji komórek macierzystych w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez izolację rzadkich lub nowych komórek wykazujących ekspresję markerów powierzchniowych.
- Zwiększa pewność przewidywań przy wyborze celu poprzez dostarczanie oczyszczonych frakcji komórek.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane populacje komórek do dalszych analiz fenotypowych lub funkcjonalnych.
- Poprawia powtarzalność analiz poprzez standaryzację wejściowych podtypów komórek.
- Umożliwia skalowalne i wielokrotne wykorzystanie procesów sortowania dla wielu celów przy minimalnej optymalizacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera opracowywanie modeli istotnych dla chorób, umożliwiając dostęp do rzadkich typów komórek.
- Utrzymuje żywotność i funkcje komórek po sortowaniu, co wspomaga późniejsze badania translacyjne.
- Zmniejsza ryzyko w walidacji przedklinicznej poprzez zapewnienie czystości subpopulacji oraz integralności funkcjonalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół pośredniej selekcji za pomocą kulek magnetycznych znajduje zastosowanie na styku wczesnej fazy odkryć i badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między walidacją celu a opracowaniem analiz dla rzadkich populacji komórek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację funkcjonalnie odrębnych subpopulacji.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wzbogacenie populacji komórek docelowych dla wiarygodnych wyników analiz.
- Analityka: Umożliwia walidację pozytywności markerów po sortowaniu oraz przeprowadzenie testów funkcjonalnych, takich jak ocena proliferacji lub aktywności metabolicznej.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście z etapu odkryć do modeli przedklinicznych dzięki zachowaniu funkcji i żywotności komórek.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje elastyczny i adaptowalny przepływ pracy dla wielu markerów powierzchniowych z wykorzystaniem standardowych odczynników.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i usprawnia sortowanie komórek bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu lub niestandardowych odczynników.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza decyzje typu go/no-go i poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie szybkiej analizy subpopulacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modeli z uwzględnieniem ryzyka w ramach programów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie doboru przeciwciał i technik separacji magnetycznej.
- Wymaga dostępu do przeciwciał znakowanych PE oraz magnetycznych kulek anty-PE dla białek docelowych.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów modelowych przy optymalizacji specyficznej dla danego celu.
- Ograniczenie do dostępnych markerów powierzchniowych z dostępnymi przeciwciałami znakowanymi PE.
