ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Raymondowi Quiñonesom Alvarado (Yale University), Yitong Chen (Ragon Institute of Mass General, MIT i Harvard), Angelique Hoelzemer oraz Katharina Schiering (Institute for Infection and Vaccine Development, University Medical Center Hamburg-Eppendorf) oraz Abnerowi Louissaintowi, Jessica Duffy, Gennie Mullen i Gail Newton (Massachusetts General Hospital i Harvard Medical School) za naukową i techniczną poradę oraz pogłębiające dyskusje. Autorzy dziękują również Michaelowi Waringowi, Kat Folz-Donahue i Nathalie Bonheur z Ragon Institute Flow Cytometry Core za fachowe wsparcie techniczne. W.F.G.-B. jest wspierany przez Ragon Institute of Mass General, MIT i Harvard, Department of Pathology w Massachusetts General Hospital oraz National Institutes of Health Director's New Innovator Award (DP2CA311214). J.O.T. jest wspierany przez Kinghorn Foundation jako laureat stypendium Fulbright Future Postgraduate Scholarship.

<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
<li>Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+NKG2D-mediated+cytotoxic+immunity+by+sarbecoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses.</a> Cell. , (2024).</li>
<li>Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+conformers+of+HLA-F+are+high-affinity+ligands+of+the+activating+NK-cell+receptor+KIR3DS1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1.</a> Nat Immunol. , (2016).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+natural+killer+cell+immunotherapy+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer.</a> Front Immunol. , (2015).</li>
<li>Coënon, L., Villalba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CD16a+biology+to+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement.</a> Front Immunol. , (2022).</li>
<li>Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+alloreactive+NK+cells+in+adoptive+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer.</a> Curr Opin Immunol. , (2005).</li>
<li>Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> N Engl J Med. , (2020).</li>
<li>Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+natural+killer+cells+engineered+with+chimeric+antigen+receptors+enhance+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity.</a> Cell Stem Cell. , (2018).</li>
<li>Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+efficacy+and+determinants+of+response+of+allogeneic+CD19-specific+CAR-NK+cells+in+CD19%2B+B+cell+tumors%3A+a+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial.</a> Nat Med. , (2024).</li>
<li>Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+migration+in+the+context+of+hepatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells.</a> J Vis Exp. (156), e60714(2020).</li>
<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

W.F.G.-B. otrzymał honorarium od BioSciences.sas za prezentację naukową na temat cytometrii spektralnej w 2025 roku. Autorzy deklarują, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych interesów finansowych ani niefinansowych.

Te protokoły zapewniają dwa uzupełniające się podejścia do ilościowego określania cytotoksyczności komórek NK w standaryzowanym formacie 96-dołkowej płytki. Krok 1 wykorzystuje obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym do ciągłego monitorowania utraty komórek docelowych i nadaje się do oceny kinetyki naturalnego oraz pośredniczonego CAR zabijania dla wielu stosunków E:T. Krok 2 wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określania ADCC po określonym czasie współinkubacji, jednocześnie rozdzielając komponenty docelowe i efektorowe do analizy fenotypu17. Te metody, prezentowane jako uzupełniające się platformy assay, które mogą być wykorzystywane do modelowania odrębnych procesów biologicznych, są również łatwo zamieniane. Pierwotne ludzkie komórki NK mogą być używane do assayów ADCC opartych na obrazowaniu na żywo, a także mogą być przeprojektowane do zabijania pośredniczonego CAR w assayach cytometrii przepływowej. Ponadto, chociaż dzikobieżne komórki NK-92 nie wykazują ekspresji CD1618, wdrożenie CD16 (np. poprzez transdukcję lentiwirusową) pozwala komórkom NK-92 na pośredniczenie silnej ADCC. W związku z tym, oba assaye mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb naukowych i translacyjnych.
Istnieje kilka kroków, które są szczególnie ważne dla reprodukowalności w obu assayach. Drobne zmiany w liczbie i fenotypie komórek efektorowych mogą drastycznie zmienić przeżywalność komórek docelowych. Dokładne liczenie komórek i dokładne zawieszenie podczas nakładania na płytkę są niezbędne, aby zminimalizować odchylenia w liczbie komórek i niekompletne mieszanie. Podobnie, przygotowanie komórek musi być spójne między eksperymentami, w tym żywotność, czas odzyskania i poprzednie narażenie na cytokiny, aby zapewnić jednolite funkcjonowanie efektorów. Geometria płytki jest kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wydajność assayu. W przepływie obrazowania na żywo płytki z płaskim dnem i powłoką wspierają stabilne nabywanie obrazów i spójną analizę pola, podczas gdy w przepływie cytometrii przepływowej płytki z zaokrąglonym dnem sprzyjają kontaktowi komórka-komórka i ułatwiają odzyskiwanie nieadhezyjnych kultur współistniejących w punkcie końcowym. Ponadto, jakość fluorescencyjnego znaczenia musi być potwierdzona przed assayem, ponieważ słaba dyskryminacja komórek docelowych przez obrazowanie lub słabe rozdzielenie CFSE przez cytometrię przepływową kompromitują ilościową ocenę i interpretację.
Te dwa przepływy pracy prezentują odrębne uwagi techniczne. W assayu obrazowania na żywo, typowe przyczyny złej jakości danych obejmują nierównomierne nakładanie komórek, gęste skupienia komórek lub skupiska oraz nieoptymalne progi analizy obrazu, które wszystkie są łatwo korektowalne. Te problemy mogą zniekształcić liczenie komórek i prowadzić do niekonsekwentnego śledzenia w czasie. W assayu opartym na cytometrii przepływowej, nieoptymalne wyniki są częściej spowodowane wysokim tłem śmierci komórek docelowych, słabym rozdzieleniem populacji docelowych i efektorowych, słabym barwieniem przeciwciał lub niespójnym pipetowaniem między powtórzonymi dołkami. Ponieważ te assaye są zaprojektowane do analizy porównawczej, włączenie odpowiednich kontroli wewnętrznych jest niezbędne do interpretacji, w tym kontroli tylko docelowych do normalizacji i dopasowanych kontroli negatywnych dla warunków specyficznych dla przeciwciał lub CAR.
Kilka wspólnych i specyficznych dla assayu ograniczeń musi być brane pod uwagę przy tych metodach. Assay obrazowania na żywo zapewnia rozdzielczość czasową, ale zależy od dokładnego fluorescencyjnego znaczenia i parametrów analizy obrazu, które mogą być wpłynięte przez skupienia komórek, nakładanie spektralne lub zmiany w morfologii podczas współkultury15. W niektórych przypadkach, szczególnie gdy assaye obejmują pierwotne komórki efektorowe, osiągnięcie odpowiedniego fluorescencyjnego znaczenia bez zmiany dynamiki zabijania jest trudne lub niemożliwe. Assay oparty na cytometrii przepływowej zapewnia wyższą rozdzielczość fenotypową w określonym punkcie końcowym, ale nie rozróżnia niezależnie wczesnego od późnego zabijania, chyba że zebrane są wielokrotne dopasowane punkty czasowe, co może być kosztowne i czasochłonne17. Ponadto, pomiary końcowe mogą odzwierciedlać nie tylko śmierć komórek docelowych, ale także różnice w proliferacji komórek docelowych, zużyciu efektorów lub odzyskiwaniu podczas obsługi próbki. W związku z tym, odczyty mechanistyczne takie jak CD107a są najlepiej interpretowane jako uzupełniające wskaźniki aktywacji komórek efektorowych, a nie bezpośrednie zamienniki dla eliminacji komórek docelowych19. Bardziej ogólnie, żadna z platform nie odzwierciedla w pełni architektury przestrzennej, interakcji z stromą, gradientów cytokin czy ograniczeń ruchu, które kształtują funkcję komórek NK in vivo.
Kilka czynników biologicznych musi również być brane pod uwagę przy interpretacji assayów zabijania komórek NK. Zmienność między dawcami jest właściwa eksperymentom z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK, które

Komórki Natural Killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają kluczową rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko wirusowo zakażonym i złośliwym komórkom, wykazując szybką i silną cytotoksyczność1. W przeciwieństwie do komórek B i T, komórki NK nie wykazują receptorów antygenowo-specyficznych i zamiast tego polegają na szeregiem receptorów aktywacyjnych i hamujących w celu wykrycia utraty ekspresji głównego zespołu zgodności tkankowej klasy I lub stresu komórkowego. Umożliwia im to mediację bezpośredniej cytotoksyczności poprzez uwolnienie granule cytotoksycznych zawierających perforację i granzymy lub, w niektórych przypadkach, poprzez aktywację receptorów śmierci1,2,3,4. Oprócz naturalnej cytotoksyczności, komórki NK wykazują FcγRIII (CD16), receptor, który rozpoznaje fragment Fc immunoglobuliny G (IgG) i wpływa na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) przeciwko komórkom docelowym pokrytym IgG5,6.
Ze względu na swoje wrodzone mechanizmy cytotoksyczne i korzystny profil bezpieczeństwa, komórki NK stały się obiecującymi kandydatami do immunoterapii komórkowej. Dzięki potencjałowi zastosowania allogenicznego, komórki NK mogą funkcjonować jako terapia "pod ręką" z minimalnym ryzykiem choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi, umożliwiając szersze zastosowanie kliniczne i obniżając koszty7. Ostatnie osiągnięcia dalece poszerzyły terapeutyczny potencjał komórek NK poprzez strategie inżynierii genetycznej, w tym wprowadzanie chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) które przekierowują komórki NK do rozpoznawania specyficznych antygenów nowotworowych. CAR-NK wykazały skuteczność przeciwnowotworową w in vivo modelach ksenograftu i badaniach klinicznych, z mniejszą toksycznością w porównaniu z komórkami CAR-T8,9,10. Dlatego wzrasta zainteresowanie rozwijaniem inżynieryjnych platform dla komórek NK i strategii terapeutycznych opartych na przeciwciałach. W tym kontekście, dokładne i ilościowe pomiary zdolności do zabijania komórek NK są niezbędne do zrozumienia biologii komórek NK, oceny skuteczności CAR lub innych inżynieryjnych terapii komórek NK oraz oceny przeciwciał monoklonalnych, które polegają na ADCC.
Różnorodne in vitro metody były szeroko stosowane w laboratoriach w celu oceny cytotoksyczności komórek NK. Typowymi metodami są testy uwalniania radioaktywnego chromu-51, testy uwalniania dehydrogenazy mleczanowej oraz testy uwalniania kalceiny-acetoksymetylowej11,12. Chociaż te tradycyjne metody były szeroko stosowane do pomiaru cytotoksyczności, opierają się na pośrednich wskaźnikach śmierci komórkowej, dostarczają pomiarów końcowych zamiast danych kinetycznych oraz oferują ograniczoną czułość i zakres dynamiczny. Nie dostarczają również informacji o fenotypie lub stanie aktywacji komórek efektorowych. Ostatnio, platformy obrazowania żywych komórek i cytometria przepływowa są coraz częściej stosowane, ponieważ umożliwiają bezpośrednie ilościowe pomiary przeżycia komórek docelowych, monitorowanie zabijania w czasie oraz jednoczesną analizę fenotypową komórek efektorowych i docelowych13,14. Jednak nawet wśród tych nowszych podejść istnieje znaczna zmienność między laboratoriami i opublikowanymi badaniami, w tym różnice w przygotowaniu komórek docelowych, stosunkach efektor-do-cel (E:T) i czasach współinkubacji, co ogranicza powtarzalność i porównania między badaniami, szczególnie w ocenach przedklinicznych immunoterapii opartych na komórkach NK.
Niniejszy artykuł przedstawia standaryzowany proces ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK przy użyciu dwóch niezależnych, uzupełniających się platform: obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym (IncuCyte SX5) oraz testy końcowe oparte na cytometrii przepływowej. Obrazowanie żywych komórek umożliwia ciągłe monitorowanie przeżycia komórek docelowych podczas współhodowli z komórkami efektorowymi, pozwalając na kinetyczną ocenę cytotoksyczności w wielu stosunkach E:T i warunkach eksperymentalnych przy minimalnym manipulowaniu testem15. W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, która dostarcza wysoce wrażliwej pomiaru końcowego śmierci komórek docelowych, wraz z jednoczesną charakterystyką fenotypową komórek NK i komórek docelowych przy użyciu panelu barwników wielomarkerowych.
Dodatkowo, ten protokół uwzględnia standaryzowane parametry eksperymentalne, w tym stosunki E:T, warunki inkubacji, format płytki i przepływy analityczne, aby poprawić powtarzalność i ułatwić porównanie pomiarów cytotoksyczności między laboratoriami i badaniami. Proces umożliwia ilościową ocenę wielu funkcji efektorowych NK, w tym naturalnej cytotoksyczności, zabijania z pośrednictwem CAR oraz ADCC, i jest kompatybilny z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK i liniami komórek NK.

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>Podstawowe medium dla kultur NK-92 i pierwotnych ludzkich komórek NK (patrz protokół dla pełnej formuły)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Marker degranulacji do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Centryfuga stołowa z obrotowym rotorem do pojemników 15-mL i płytek 96-dołkowych (Eppendorf Centrifuge 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Używany do pelletowania komórek i wirowania płytek (100&ndash;300 &times; g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Barwnik proliferacji komórkowej do oznaczania komórek docelowanych</td></tr><tr><td>Cytek Aurora spectral flow cytometer (lub odpowiednik)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Używany do akwizycji i analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenylindol)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Barwnik jądrza do różnicowania żywych i martwych komórek</td></tr><tr><td>Głębokodołkowa płytka 96-dołkowa</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Używany do przygotowania przeciwciał</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Środek do krioprezerwacji</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Dodatek do podstawowego medium; używany w buforze FACS (2% FBS)</td></tr><tr><td>General Purpose Water Bath, 10 L (37 &deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Do odmrażania komórek</td></tr><tr><td>GlutaMAX (suplement L-alanyl-L-glutamina)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stabilne źródło glutaminy</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Dodatek do kultur medium pierwotnych ludzkich komórek NK</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 live-cell imaging system</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Obrazy na żywo w czasie rzeczywistym i analiza komórka po komórce</td></tr><tr><td>LUNA-FL dual fluorescence cell counter (lub odpowiednik)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Automatyczne liczenie komórek</td></tr><tr><td>Parafilm M (4 in &times; 250 ft roll)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Uszczelnianie i przechowywanie płytek</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2&ndash;7.4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Używany do płukania i przygotowania bufora FACS</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Środek do powlekania płytek</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Recombinant human interleukin-2 (IL-2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Cytokine</td></tr><tr><td>RosetteSep Human NK-cell enrichment kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Kompleks wzbogacania ludzkich komórek NK</td></tr><tr><td>SYTOX Orange dead cell stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Barwnik do obrazów na żywo martwych komórek</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Barwnik do liczenia komórek</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Do odczepiania komórek przylegających</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Używany do przygotowania bufora FACS</td></tr><tr><td>15-mL stożkowe pojemniki z dnem do wirowania</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Używany do odzyskiwania komórek NK</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z okrągłym dnem (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Używany do kokultur i badań cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płytka z czarnym, przezroczystym dnem z polistyrenu (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Kompatybilny z systemami obrazu na żywo</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja cytotoksyczności komórek nk potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Komórki natural killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają krytyczną rolę w ochronnej odporności przeciwko różnym patogenom wewnątrzkomórkowym i rakiem. Ich główną funkcją jest zabijanie komórek docelowych, które są zakażone, złośliwie przekształcone lub pokryte przeciwciałami poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Komórki NK mogą być również genetycznie modyfikowane tak, aby wyrażały chimeryczne receptory antygenowe (CAR), które umożliwiają selektywne rozpoznawanie określonych antygenów. Ilościowe pomiary cytotoksyczności komórek NK są niezbędne do oceny początkowej funkcjonalności oraz do przedklinicznej ewaluacji przeciwciał monoklonalnych i strategii inżynierii CAR. Jednak in vitro testy funkcjonalne nadal są bardzo różnorodne w różnych laboratoriach z powodu różnic w przygotowaniu komórek, komórkach docelowych, proporcjach efektor-cel oraz czasach współinkubacji i metodach pomiarów, co ogranicza powtarzalność i możliwość porównywania różnych badań. W tym artykule przedstawiono znormalizowany protokół ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym. Pierwotne ludzkie komórki NK i komórki NK-92 wyrażające CAR były oceniane pod kątem ich zdolności do zabijania komórek nowotworowych i komórek pokrytych przeciwciałami w formacie 96-dołkowej płytki w celu zmierzenia naturalnej cytotoksyczności, zabijania za pośrednictwem CAR i ADCC. Przeżywalność komórek docelowych była mierzona ciągle za pomocą obrazowania na żywo lub w określonym punkcie czasowym za pomocą cytometrii przepływowej, co również umożliwiało charakteryzację fenotypową komórek NK i komórek docelowych. Te protokoły zapewniają solidną ramę za pomocą rutynowych metod hodowli tkankowej, obrazowania i cytometrii przepływowej, aby umożliwić powtarzalne ilościowe określenie funkcji efektorowych komórek NK w badaniach nad wrodzoną odpornością i immunoterapiami opartymi na komórkach NK.

Aby ilościowo ocenić cytotoksyczność komórek NK w czasie rzeczywistym, komórki efektorowe NK-92 zmodyfikowane tak, aby eksprimeowały CAR anty-BCMA, współhodowano z komórkami docelowymi Ramos BCMA+ w czarnej, przezroczystej płytce 96-dołkowej z płaskim dnem i monitorowano za pomocą obrazowania żywych komórek (Rysunek 1A oraz Rysunek dodatkowy 1A). Komórki efektorowe dodawano w stosunkach E:T wynoszących 0:1 (tylko komórki docelowe), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdą warunek wykonano w trzech powtórzeniach. Ewaluowano trzy różne konstrukty CAR NK-92: CAR1 bez domeny kostymulującej, CAR2 z domeną kostymulującą 4-1BB (CD137) oraz CAR3 z domeną kostymulującą DAP10, wraz z kontrolnymi komórkami NK-92 eksprimującymi wektor zawierający wyłącznie ZsGreen. Wszystkie komórki efektorowe wygenerowano poprzez transdukcję lentiwirusową, zgodnie z wcześniejszym opisem4, wykorzystując kasety transgenowe ZsGreen-P2A-CAR. Komórki docelowe Ramos transdukowano w podobny sposób lentiwirusowym wektorem kodującym emiRFP670. Wzrost i przeżywalność komórek docelowych śledzono co godzinę przez okres 24 h przy użyciu urządzenia do obrazowania żywych komórek, mierząc fluorescencję zieloną dla komórek NK-92 ZsGreen+, fluorescencję pomarańczową dla martwych komórek SYTOX Orange+ oraz fluorescencję NIR dla komórek docelowych emiRFP670+ (Rysunek 1A oraz Rysunek dodatkowy 1B i 1C).
Obrazy mikroskopowe pozyskano w określonych odstępach czasu, aby zwizualizować komórki efektorowe, żywe komórki docelowe oraz komórki martwe podczas kokultury (Rysunek 1B). Ilościowe oznaczenie wzrostu i przeżywalności komórek docelowych wykazało, że komórki NK-92 CAR2 i CAR3 charakteryzowały się szybszą kinetyką zabijania niż komórki NK-92 CAR1, szczególnie we wczesnych punktach czasowych przy stosunku E:T wynoszącym 1:1. Zabijanie komórek docelowych wzrastało wraz z wyższymi stosunkami E:T, również w przypadku kontrolnych komórek NK-92, które wykazały naturalną cytotoksyczność (Rysunek 1C). Pomiary te podkreślają zdolność obrazowania żywych komórek do rejestrowania dynamicznych zmian w aktywności cytotoksycznej. Przeżywalność komórek docelowych analizowano również jako funkcję stosunku E:T w określonych punktach czasowych, aby porównać potencję CAR NK-92. Komórki NK-92 CAR2 i CAR3 wykazały większą potencję przy niższych stosunkach E:T w późniejszych punktach czasowych (np. E:T = 0,25:1 po 24 h) oraz przy pośrednich stosunkach E:T we wczesnych punktach czasowych (np. E:T = 1:1 po 4 h) (Rysunek 1D). W przeprowadzonych analizach nie zaobserwowano istotnych różnic w zabijaniu między efektorowymi komórkami NK-92 CAR2 i CAR3.
Mapa ciepła integrująca stosunek E:T, czas współinkubacji oraz przeżywalność komórek docelowych zapewnia kompleksową wizualizację cytotoksyczności naturalnej i CAR-zależnej we wszystkich populacjach efektorowych i umożliwia ocenę ilościową. Zdefiniowano trzy parametry służące do ilościowego określenia siły działania i kinetyki: KR50, czyli stosunek komórek zabójczych do docelowych, przy którym uzyskano 50% śmierci komórek (po 12 h); KT50, czyli czas współinkubacji wymagany do osiągnięcia 50% śmierci komórek (przy stosunku E:T 1:1); oraz IKI50, zintegrowany indeks zabójstwa reprezentujący obszar mapy ciepła poniżej 50% przeżywalności, wyznaczony przez izoklinę 50% przeżywalności (Rycina 1E). Metryki te umożliwiają porównanie siły działania komórek CAR NK-92 (KR50), kinetyki zabijania (KT50) oraz zintegrowanej wydajności cytotoksycznej (IKI50) (Rycina 1F). Analiza ta pokazuje, w jaki sposób test może ilościowo porównywać zmodyfikowane platformy komórek NK w oparciu o wiele parametrów w ramach jednego eksperymentu.
Do pomiaru ADCC wykorzystano cytometrię przepływową z liczeniem komórek, polegającą na kokultywacji znakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK w obecności lub przy braku przeciwciał terapeutycznych oraz ilościowym oznaczeniu pozostałej populacji żywych komórek docelowych po 16–18 h inkubacji (Rysunek 2A). Można użyć cytometrów przepływowych takich jak Cytek Aurora, BD Symphony lub BD Fortessa z próbą wysokoprzepustową. W reprezentacyjnym układzie (Rysunek uzupełniający 2) komórki docelowe chłoniaka pochodzące od pacjenta CD38+ wysiano do okrągłodennej płytki 96-dołkowej, a do odpowiednich dołków dodano daratumumab (lub przeciwciało izotypowe). Następnie przeprowadzono kokultywację z komórkami NK w stosunku E:T wynoszącym 0,5:1, który został zoptymalizowany dla tych komórek docelowych w celu zminimalizowania naturalnej cytotoksyczności przy jednoczesnym umożliwieniu wykrycia ADCC. Po inkubacji wykonano cytometrię przepływową w celu rozdzielenia populacji komórek na podstawie rozpraszania światła w przód i w bok, wykluczenia zdarzeń nieżywotnych przy użyciu DAPI oraz oddzielenia komórek docelowych CFSE+ od komórek NK CD56+CD16+ do analizy równoległej (Rysunek 2B). Taki projekt umożliwia jednoczesny pomiar cytotoksyczności i charakterystykę fenotypową.
<img alt="Układ testu komórek NK; wyniki testu ADCC; schemat cytometrii przepływowej; przeżywalność komórek i degranulacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71377/71377fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test przeciwciałowej cytotoksyczności komórkowej (ADCC) oparty na cytometrii przepływowej umożliwia jednoczesną kwantyfikację przeżywalności komórek docelowych i aktywacji komórek NK. (A) Schematyczny przegląd testu ADCC. Komórki docelowe chłoniaka CD38+ znakowane CFSE wysiano w zagęszczeniu 2,5 × 104 komórek na dołek i hodowano w pięciu warunkach: same komórki docelowe; komórki docelowe z daratumumabem (25 µg/mL); komórki docelowe z komórkami NK (E:T = 0,5:1); komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem; oraz komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym (25 µg/mL). (B) Reprezentatywna strategia bramkowania w cytometrii przepływowej. Zdarzenia najpierw bramkowano według rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC), a następnie wykluczono komórki nieżywe za pomocą DAPI. Komórki docelowe zidentyfikowano jako zdarzenia CFSE+, a komórki NK jako zdarzenia CD56+ i CD16+. Degranulację komórek NK oceniano na podstawie ekspresji CD107a. (C) Kwantyfikacja przeżywalności komórek docelowych, wyrażona jako procent w stosunku do warunku kontrolnego z samymi komórkami docelowymi (ustalonego na 100%). (D) Kwantyfikacja degranulacji komórek NK, przedstawiona jako procent komórek CD107a+ w populacji komórek NK. Słupki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe, a nałożone punkty reprezentują poszczególne dołki powtórne (n = 3). Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z testem wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Istotność statystyczną oznaczono następująco: *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/71377fig2largev1.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Głównym punktem końcowym jest przeżywalność komórek docelowych, obliczana w bramce żywych komórek CFSE+ i znormalizowana względem warunku z samymi komórkami docelowymi, który uznano za 100% przeżywalności. Normalizacja ta pozwala skontrolować spontaniczną utratę komórek docelowych i umożliwia bezpośrednie porównanie poszczególnych warunków. Na reprezentatywnych danych (Rycina 2C) dodanie samego daratumumabu nie zmniejszyło przeżywalności komórek docelowych, co potwierdza, że przeciwciało nie ma bezpośredniego wpływu na żywotność komórek docelowych w obecności samych komórek efektorowych. Kokultura z samymi komórkami NK zmniejszyła przeżywalność komórek docelowych do około 70%, co wskazuje na podstawową cytotoksyczność naturalną. Dodanie daratumumabu dodatkowo obniżyło przeżywalność do około 37%, co jest zgodne ze zwiększoną śmiercią indukowaną przez przeciwciała, podczas gdy w warunku z kontrolą izotypową przeżywalność wyniosła około 62%, co jest porównywalne z warunkiem z samymi komórkami NK. Pomyślne eksperymenty wykazują wyraźną różnicę między warunkami z zastosowaniem przeciwciał a grupami kontrolnymi przy wysokiej powtarzalności między powtórzeniami.
Wtórne fenotypowanie komórek NK zapewnia uzupełniające potwierdzenie związku między zabijaniem komórek docelowych a aktywacją efektorową. Degranulacja komórek NK, mierzona jako procent komórek NK CD107a+, była najniższa w kokulturze komórek NK z komórkami docelowymi bez przeciwciał, a najwyższa w warunkach z zastosowaniem daratumumabu (około 31%), podczas gdy kontrola izotypowa wykazała pośredni poziom degranulacji (około 19%), co potwierdza aktywację zależną od przeciwciał (Rysunek 2D). Wyniki te pokazują, że test pozwala odróżnić zabijanie komórek docelowych od aktywacji efektorowej. Chociaż trendy degranulacji i przeżywalności są zazwyczaj zbieżne, nie pokrywają się one w pełni, co wskazuje, że reprezentują one powiązane, lecz odrębne procesy biologiczne.
Nieoptymalne eksperymenty zazwyczaj wykazują zmniejszoną separację między warunkami, zmienność liczby komórek w poszczególnych studniach, wysoką śmiertelność komórek docelowych w studniach kontrolnych, słabe barwienie CFSE lub podwyższoną tła degranulacji. Wyniki te mogą wynikać z niskiej żywotności komórek docelowych, niespójnego odzysku komórek NK, niewystarczającego mieszania lub zmienności w barwieniu i akwizycji. Ponieważ test ten niezależnie identyfikuje przedziały docelowe i efektorowe, można go rozszerzyć o dodatkowe fenotypowanie komórek docelowych (np. gęstość antygenu lub ekspresję liganda) oraz szerszą charakterystykę komórek NK. Wprowadzenie warunku „tylko NK” pozwala dodatkowo określić bazową degranulację i żywotność komórek NK. Taki wieloparametrowy projekt jest kluczową zaletą, umożliwiając interpretację funkcjonalnej cytotoksyczności wraz z mechanicznymi fenotypami immunologicznymi.
Rycina dodatkowa 1. Reprezentatywny układ płytki i schemat analizy dla testu cytotoksyczności z obrazowaniem żywych komórek. (A) Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej dla testu zabijania przez komórki CAR NK. Cztery warunki komórek efektorowych są rozmieszczone w kwadrantach, z których każdy jest testowany przy stosunkach E:T wynoszących 0:1 (kontrola tylko z komórkami docelowymi), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdy warunek wykonano w trzech powtórzeniach (łącznie 60 dołków testowych). (B) Reprezentatywna konfiguracja analizy Cell-by-Cell dla komórek nieprzywierających w oprogramowaniu IncuCyte 2021C, ilustrująca parametry rozdzielania widmowego (spectral unmixing), segmentacji i maskowania użyte do identyfikacji poszczególnych komórek efektorowych i docelowych przy wykluczeniu zanieczyszczeń i agregatów. (C) Reprezentatywna strategia bramkowania klasyfikacji Cell-by-Cell z wykorzystaniem fluorescencji NIR względem SYTOX Orange w celu zdefiniowania populacji żywych komórek docelowych. Do potwierdzenia separacji między populacjami komórek żywych i martwych wykorzystano dołki z samymi komórkami docelowymi oraz dołki z kokulturą w przykładowym punkcie czasowym (t = 4 h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 2. Reprezentatywny układ płytki dla testu ADCC opartego na cytometrii przepływowej. Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej przedstawiający pięć warunków eksperymentalnych naniesionych w trzech powtórzeniach w rzędach B–D i kolumnach 2–6 (łącznie 15 dołków testowych): (1) kontrola zawierająca tylko komórki docelowe, (2) komórki docelowe z daratumumabem, (3) komórki docelowe z komórkami NK, (4) komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem oraz (5) komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym. Komórki docelowe naniesiono w liczbie 2,5 × 104 komórek na dołek, a komórki NK dodano w liczbie 1,25 × 104 komórek na dołek, aby uzyskać stosunek E:T wynoszący 0,5:1. Przeciwciała zastosowano w końcowym stężeniu 25 µg/mL. Sąsiednie dołki wypełniono PBS w celu zminimalizowania parowania. Warunek z samymi komórkami docelowymi posłużył do normalizacji przeżywalności komórek docelowych, a kontrola izotypowa pozwoliła uwzględnić efekty wynikające z formulacji przeciwciał, niezależnie od swoistości antygenowej. W zależności od podatności linii komórek docelowych może być wymagana optymalizacja stosunku E:T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71377/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Nasze laboratorium bada rolę komórek NK (natural killer) w zdrowiu i chorobie, dążąc do wykorzystania ich potencjału w celu usprawnienia leczenia nowotworów litych oraz białaczek i chłoniaków. Istniejące testy cytotoksyczności komórek NK charakteryzują się brakiem standaryzacji między różnymi platformami i układami. Niniejszy protokół przedstawia powtarzalne metody obrazowania żywych komórek oraz cytometrii przepływowej w celu dokładnej oceny cytotoksyczności.W celu rozpoczęcia przygotuj 10 ml 2x SYTOX Orange, rozcieńczając roztwór zapasowy SYTOX Orange w pożywce do hodowli NK-92 w 15-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej. Policz komórki docelowe za pomocą licznika Luna Counter po wymieszaniu z błękitem trypanowym lub zastosuj dowolną zwalidowaną metodę liczenia komórek opartą na wykluczaniu barwnika. Przenieś wymaganą liczbę komórek docelowych do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej.Wirować probówkę z prędkością 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Następnie zawiesić ponownie komórki docelowe do końcowego stężenia 250 000 komórek na mililitr w podłożu 2X SYTOX Orange. Aby przygotować komórki efektorowe, ocenić żywotność i stężenie komórek NK-92 i kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy żywotność przekracza 80%, ponieważ niższa żywotność może wpłynąć na wyniki testu.Należy odliczyć i przenieść wymaganą liczbę komórek NK-92 do poszczególnych probówek wirówkowych o stożkowym dnie o pojemności 15 ml. Po wirowaniu komórki należy zawiesić ponownie do końcowego stężenia 500 000 komórek na ml. Rozcieńczenia komórek efektorowych przygotowuje się poprzez dodanie 240 µL komórek efektorowych do dołków płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie dla stosunku efektorów do celu 2:1, a do pozostałych dołków należy dodać 120 µL pożywki.Przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenia seryjne dla stosunków efektor do celu wynoszących odpowiednio 2:1, 1:1 oraz 0,25:1, mieszając zawiesiny poprzez co najmniej pięciokrotne pipetowanie i zmieniając końcówki między transferami. Następnie, w celu przygotowania kokultury, należy użyć 96-dołkowej płytki z płaskim dnem pokrytej polilizyną. Bezpośrednio przed transferem należy dokładnie resuspendować komórki celu i efektorowe, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie dodać 100 µL każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków.Następnie do pozostałych nieużywanych studzienek dodaje się 200 µL PBS. Płytkę wiruje się z prędkością 100G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie płytkę umieszcza się w systemie do obrazowania żywych komórek.Należy pozyskiwać obrazy co jedną godzinę przez 24 godziny w temperaturze 37°C i przy 5% carbon dioxide. Po pierwszym skanowaniu należy zweryfikować jakość obrazu i w razie potrzeby dostosować ustawienia obrazowania. Należy przeprowadzić dekonwolucję spektralną (spectral unmixing), aby skorygować przenikanie sygnału SYTOX Orange do kanału zielonego.Należy zweryfikować, czy pomarańczowe pozytywne martwe komórki nie zostaną błędnie zidentyfikowane jako komórki pozytywne dla koloru zielonego. Aby skonfigurować analizę poszczególnych komórek nieprzylegających, należy ustawić oczekiwaną średnicę obiektów na 15 micrometers, co odpowiada przybliżonej średnicy komórek. Czułość progu i czułość tekstury należy ustawić na wartość pięć, a czułość krawędzi na 10, aby ułatwić oddzielenie skupisk komórek.Ustaw zakres filtra obszaru akceptowanych obiektów od 50 do 2 000 µm², aby wyeliminować zanieczyszczenia i duże obiekty. Ustaw maksymalną ekscentryczność na 0,95, aby wykluczyć obiekty niekomórkowe. Pozyskaj pierwotne ludzkie komórki NK hodowane przez 16 do 24 godzin.Przenieś 500 000 komórek docelowych do 15 mililitrowej probówki wirówkowej z stożkowym dnem. Przepłucz komórki raz 10 mililitrami PBS. Wirowarkuj komórki przy 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć nadsącz. Przygotować 0,5 µM roztwór roboczy estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) w PBS, rozcieńczając 1 µL 5 mM roztworu zapasowego CFSE w 10 mL PBS. Ponownie zawiesić otrzymany osad w roztworze CFSE w stężeniu około 1 mln komórek/mL.Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C, owijając naczynie folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Następnie przerwać reakcję, dodając od pięciu do 10 objętości pożywki hodowlanej, i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Po odwirowaniu komórek, resuspender osad komórkowy do stężenia 250 000 komórek na mililitr, tak aby 100 µL zawierało 25 000 komórek.Do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem nanieś za pomocą pipety wielokanałowej 100 µL komórek docelowych na dołek. Każdy wariant doświadczalny przygotuj w trzech powtórzeniach. Następnie, dla każdego przeciwciała testowego oraz dopasowanej kontroli izotypowej, przygotuj 200 µL 4X roztworu przeciwciał w pożywce do hodowli komórek NK.Przenieś roztwory przeciwciał do płytki głębokodołkowej. Do każdego dołka zawierającego komórki docelowe dodaj 50 µL roztworu przeciwciał i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy. Do dołków kontrolnych bez przeciwciał dodaj 50 µL pożywki do hodowli komórek NK na dołek i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.Inkubować płytkę przez 25 do 30 minut w standardowych warunkach inkubacji. Odliczyć i uzyskać 200 000 komórek NK i kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy żywotność wynosi 75% lub więcej. Resuspender komórki do stężenia 250 000 komórek na mililitr w 800 µL pożywki do hodowli pierwotnych ludzkich komórek NK. Dodać 50 µL komórek NK do odpowiednich studni i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy.Następnie do studzienek kontrolnych pipetujemy po 50 µL pożywki hodowlanej i dokładnie mieszamy. Należy uważnie sprawdzić 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem, aby potwierdzić, że wszystkie studzienki zawierają 200 µL cieczy, poziom menisku jest jednolity i nie ma pęcherzyków powietrza. Płytkę wirujemy przez dwie minuty przy 100G, a następnie inkubujemy przez 16 do 18 godzin w standardowych warunkach inkubacji.Wiruj płytkę przez pięć minut przy 300G i odlej nadsącz. Przemyj wszystkie dołki, używając 200 µL na dołek buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (bufor FACS). Przygotuj główną mieszaninę przeciwciał powierzchniowych w buforze FACS zgodnie z opisem przedstawionym w tym miejscu.Ponownie zawiesić komórki w 50 µL na dołek mieszaniny głównej przeciwciał i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, owiniętą w folię aluminiową w celu ochrony przed światłem. Dodać 150 µL na dołek buforu FACS.Po wirowaniu ponownie zawiesić komórki w 100 µL na dołek 5 µM DAPI w buforze FACS. Niezwłocznie przystąpić do akwizycji w cytometrii przepływowej, pomijając inkubację przed pomiarem. Analizę cytometryczną przeprowadzić przy użyciu instrumentu Cytek Aurora, rejestrując kanały fluorescencji dla CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI oraz wszelkich dodatkowych fluoroforów.Podczas kokultury komórki efektorowe, żywe komórki docelowe oraz martwe komórki wizualizowano za pomocą mikroskopii żywych komórek w czasie rzeczywistym. Komórki CAR2-NK-92 i CAR3-NK-92 wykazały szybszą kinetykę zabijania niż komórki CAR1-NK-92, szczególnie wyżej w wczesnych punktach czasowych przy równym stosunku efektorów do komórek docelowych. Zabijanie komórek docelowych wzrastało wraz z wyższymi stosunkami efektorów do komórek docelowych, w tym w przypadku kontrolnych komórek NK-92, które wykazały naturalną cytotoksyczność.Komórki NK-92 CAR2 i CAR3 wykazały większą aktywność przy niższych stosunkach efektorów do komórek docelowych w późniejszych punktach czasowych. Jednocześnie w wcześniejszych punktach czasowych zaobserwowano zwiększoną aktywność przy pośrednich stosunkach efektorów do komórek docelowych. W celu ilościowego określenia aktywności komórek CAR-NK-92, kinetyki zabijania oraz ogólnej wydajności cytotoksycznej w populacjach efektorowych zdefiniowano trzy parametry: KR50, KT50 oraz IKI-50.Samo dodanie daratumumabu nie zmniejszyło przeżywalności komórek docelowych, co potwierdziło, że przeciwciało nie miało bezpośredniego wpływu na żywotność komórek docelowych wobec braku komórek efektorowych. Współhodowla z samymi komórkami NK zmniejszyła przeżywalność komórek docelowych do około 70%, co wskazuje na bazową cytotoksyczność naturalną. Dodanie daratumumabu dodatkowo zmniejszyło przeżywalność komórek do około 37%, co jest zgodne ze zwiększoną cytotoksycznością zależną od przeciwciał.W przeciwieństwie do tego, w warunkach z kontrolą izotypową odnotowano przeżywalność na poziomie około 62%, co było porównywalne z warunkiem zawierającym wyłącznie komórki NK. Degranulacja komórek NK była najniższa w kokulturze komórek NK i komórek docelowych bez przeciwciał, a najwyższa w warunku traktowanym daratumumabem, wynosząc około 31%, podczas gdy kontrola izotypowa wykazała pośredni poziom degranulacji na poziomie około 19%. Niniejszy protokół umożliwia badaczom ilościowe określenie naturalnej cytotoksyczności komórek NK, ocenę potencjału zabijania nowotworów przez konstrukty CAR-NK oraz porównanie skuteczności ADCC przeciwciał monoklonalnych. Kluczową kwestią podczas realizacji tego protokołu jest zachowanie dokładnego i spójnego liczenia komórek, pipetowania oraz wysiewania komórek NK i komórek docelowych, aby zapewnić wiarygodne i interpretowalne wyniki.Przyszłe badania mogą wykorzystać te protokoły do badania mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej przez komórki NK, porównywania podatności nowotworów oraz oceny nowych immunoterapii opartych na komórkach NK w różnych typach nowotworów.

quantifying-nk-cell-cytotoxicity-potentiated-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje aktywność lityczną komórek NK w stosunku do komórek docelowych barwionych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia pomiar cytotoksyczności indukowanej komórkami NK poprzez barwienie martwych komórek i użycie cytometru przepływowego do ilościowego określenia żywych i martwych komórek docelowych.

Test cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej przepływowej

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  This protocol provides a standardized in vitro. workflow for consistent measurement of natural, chimeric antigen receptor–mediated, and antibody-dependent cytotoxicity of human natural killer cells using live-cell imaging and flow cytometry.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów