Name: Oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę oznaczania fluorków w surowicy, kościach i zębach myszy z wykorzystaniem dyfuzji HMDS oraz elektrody jonoselektywnej. Protokół umożliwia precyzyjną analizę małych próbek biologicznych w badaniach toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania opisane w niniejszej publikacji były wspierane przez Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) oraz National Institute of Dental and Craniofacial Research z National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) i K02DE029531 (M.S.).

<ol>
	<li>Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x</li>
	<li>Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O&#39;Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2</li>
	<li>Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885</li>
	<li>Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273</li>
	<li>Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279</li>
	<li>Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038</li>
	<li>Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302</li>
	<li>Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629</li>
	<li>Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.</li>
	<li>Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948</li>
	<li>Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.</li>
	<li>Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.</li>
	<li>Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600</li>
	<li>Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.</li>
	<li>Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436</li>
	<li>Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495</li>
	<li>Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2</li>
	<li>Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.</li>
	<li>Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486</li>
	<li>Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.</li>
	<li>Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.</li>
	<li>Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.</li>
	<li>Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2</li>
	<li>Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.</li>
	<li>Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339</li>
	<li>Mart&#237;nez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657</li>
	<li>Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.</li>
	<li>Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.</li>
	<li>Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.</li>
	<li>Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.</li>
	<li>Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.</li>
	<li>Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.</li>
	<li>Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel&#39;s Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.</li>
	<li>Ku&#269;era J, &#352;tef&#225;nik, M. &#38; Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583</li>
	<li>Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.</li>
	<li>Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.</li>
	<li>Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

Pomiary fluorków przeprowadzono przy użyciu elektrody jonoselektywnej (ISE) selektywnej względem fluorków, zawierającej membranę z kryształu fluorku lantanu (LaF₃)38,39. Membrana ta tworzy wysoce stabilne wiązania La–F, co skutkuje silną preferencją jonów fluorkowych nad innymi halogenkami. Zgodnie z uznaną literaturą elektrochemiczną i specyfikacjami producenta, membrana LaF₃ wykazuje bardzo niskie współczynniki selektywności dla chlorków, co wskazuje, że jony chlorkowe nie powodują mierzalnych zakłóceń w warunkach zastosowanych w niniejszym protokole. Chociaż chlorek występuje naturalnie w zębach i kościach, jego aktywność nie wpływa na potencjał elektrody, a rejestrowany sygnał odzwierciedla specyficznie aktywność fluorków. Dolna granica wykrywalności 0,02 ppm odpowiada potwierdzonej przez producenta minimalnej mierzalnej koncentracji dla elektrody selektywnej względem fluorków marki Orion. Granica ta odzwierciedla najniższe stężenie fluorków, przy którym elektroda utrzymuje stabilną odpowiedź nernstowską i liniową zależność od krzywej kalibracyjnej. Ponieważ granica wykrywalności jest zdefiniowana przez właściwości membrany elektrody i została zwalidowana przez producenta, w niniejszym protokole nie było wymagane dodatkowe oznaczenie eksperymentalne; jednak w odniesieniu do górnego zakresu wykrywania autorzy zaobserwowali, że masy fluorków przekraczające około 38 000&#160;ng w 50&#160;µL pułapce NaOH prowadziły do nieliniowej odpowiedzi elektrody, co wskazuje, że krzywa kalibracyjna nie jest już wiarygodna przy bardzo wysokich ładunkach fluorków. Nieliniowość ta wynika prawdopodobnie z przekroczenia optymalnej siły jonowej i zakresu aktywności dla elektrody w danych warunkach eksperymentalnych, a nie odzwierciedla immanentnej górnej granicy samej elektrody ISE. W przypadku próbek, w których spodziewana jest masa fluorków powyżej tego progu, zaleca się zwiększenie objętości pułapki NaOH, aby utrzymać pomiary w liniowym zakresie dynamicznym elektrody.
Należy wziąć to pod uwagę przy stosowaniu protokołu do próbek o nietypowo wysokiej zawartości fluorków. Ponieważ etap dyfuzji zużywa całą objętość próbki, w przypadku próbek biologicznych nie można było przeprowadzić pomiarów powtórzonych ani eksperymentów z odzyskiem po dodaniu wzorca (spike‑and‑recovery). Aby zapewnić dokładność i precyzję analityczną, do każdej serii pomiarowej włączono standardy kontroli jakości (QC) o znanych stężeniach fluorków. Standardy QC były przetwarzane i mierzone w ten sam sposób, co próbki doświadczalne. we wszystkich seriach pomiarowych zmierzone stężenia fluorków w standardach QC konsekwentnie mieściły się w granicach 5% ich wartości oczekiwanych. Dla każdej serii 10–20 próbek materiału przygotowano równolegle dwa niezależne zestawy po 5–6 próbek kalibracyjnych, a krzywą kalibracyjną rejestrowano przed każdą sesją pomiarową. Zakres kalibracji dostosowywano dla każdego pomiaru tak, aby odpowiadał przewidywanej masie fluorków w próbkach materiału, co zależało od rodzaju materiału, masy materiału dodanego do naczynia dyfuzyjnego, a także grupy terapeutycznej i wieku zwierzęcia. W przypadku pomiarów surowicy standardy kalibracyjne odpowiadały stężeniom fluorków w materiale na poziomie około 0,06–1,20 ppm. W przypadku pomiarów kości i zębów standardy kalibracyjne odpowiadały stężeniom fluorków w materiale na poziomie około 19–7 600 ppm.
Niniejszy protokół przedstawia czułą i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametyldisyloksanem, a następnie analizy metodą ISE. Metoda ta niezawodnie wychwytuje fluorek uwalniany z różnorodnych matryc biologicznych i umożliwia ilościową ocenę akumulacji fluorków po kontrolowanej ekspozycji. Reprezentatywne wyniki uzyskane od myszy młodzieńczych i dorosłych wykazują wyraźne różnice w depozycji fluorków w tkankach, zależne od wieku i dawki, co podkreśla użyteczność tego podejścia w badaniu metabolizmu i toksykokinetyki fluorków in vivo.
Kluczową zaletą niniejszego protokołu jest zastosowanie naczyń dyfuzyjnych, które fizycznie oddzielają reakcję uwalniania fluorków od środowiska ich wychwytywania. Konstrukcja uszczelniona wazeliną minimalizuje wymianę z atmosferą i zapewnia efektywne wychwytywanie uwolnionych jonów fluorkowych przez krople wodorotlenku sodu znajdujące się na pokrywie. Kwas siarkowy nasycony HMDS zapewnia silną i stałą siłę napędową dla uwalniania fluorków z tkanek zmineralizowanych, w tym ze struktur silnie zwapniałych, takich jak kości i zęby. Następczy pomiar ISE, skalibrowany za pomocą standardów dopasowanych do procesu dyfuzji, umożliwia dokładną kwantyfikację w szerokim zakresie dynamicznym. Inną zaletą tego podejścia jest możliwość oznaczania ilości fluorków w niezwykle małych próbkach biologicznych. Tkanki zmineralizowane myszy, w szczególności siekacze żuchwy, dają zaledwie 3–5 mg popiołu z jednego zęba. Konwencjonalne metody analityczne często wymagają większej masy próbki lub wyższej zawartości fluorków, aby osiągnąć wiarygodną detekcję. W przeciwieństwie do nich, konstrukcja oparta na dyfuzji koncentruje wszystkie fluorki uwolnione z całego preparatu w małej, określonej objętości, co pozwala na dokładną kwantyfikację nawet w bardzo małych próbkach o niskiej bezwzględnej masie fluorków. Cechą tą jest szczególna wartość w badaniach z wykorzystaniem małych zwierząt, przy ograniczonej dostępności tkanek lub w przypadku mikrosekcjonowanych struktur zmineralizowanych.
Głównym ograniczeniem tej metody jest granica wykrywalności elektrody jonoselektywnej (ISE) zastosowanej w niniejszym badaniu (0,02 ppm). Próbki surowicy od zwierząt kontrolnych, które nie otrzymywały fluorków, często znajdowały się poniżej tego progu, co uniemożliwiało ilościowe oznaczenie ekstremalnie niskich stężeń fluorków. W przypadku pomiaru śladowych stężeń w pobliżu lub poniżej granicy wykrywalności może być konieczne zastosowanie większej masy lub objętości próbki w naczyniu dyfuzyjnym (jeśli jest dostępna) lub wykorzystanie alternatywnych technik analitycznych. Ponadto metoda ta wymaga nocnej dyfuzji oraz ostrożnego obchodzenia się z żrącymi odczynnikami, co może ograniczać przepustowość w badaniach o dużej skali. Chociaż ISE zapewnia czułe ilościowe oznaczenie całkowitej zawartości fluorków, nie pozwala na ocenę ich rozkładu przestrzennego w tkankach. W celu wizualizacji i mapowania rozkładu fluorków w skali od mikro- do makro można zastosować podejścia komplementarne, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa sprzężona ze spektroskopią rentgenowską z detekcją energii (SEM-EDX) lub emisja promieniowania gamma indukowana cząstkami (PIGE). Te metody obrazowania pozwalają na ocenę lokalnej akumulacji fluorków w tkankach zmineralizowanych lub miękkich, uzupełniając tym samym pomiary ISE i zapewniając bardziej kompleksową ocenę zawartości fluorków w tkankach.
Kilka powtarzających się czynników technicznych może wpływać na dokładność i wiarygodność dyfuzji oraz pomiaru fluorków w tym protokole, a nasze obserwacje wskazują, jak przygotowanie kalibracji, uszczelnianie naczynia do dyfuzji, kontrola pH, wydajność elektrody oraz obchodzenie się z próbkami wspólnie kształtują jakość danych. Możliwymi przyczynami nieliniowej krzywej kalibracyjnej (R2 &#60; 0,99) lub odczyty z próbek tkankowych poza oczekiwanym zakresem obejmują błędne obliczenia objętości roztworu zapasu NaF dodanego do naczynia dyfuzyjnego lub błędy pipetowania podczas przygotowywania standardów kalibracyjnych. Zalecane działanie: Przygotuj co najmniej dwa niezależne zestawy próbek kalibracyjnych dla każdego przebiegu, aby w razie wypadnięcia jednej krzywej kalibracyjnej poza oczekiwany zakres dostępny był zestaw zapasowy. Niedokładne uszczelnienie naczynia dyfuzyjnego może również spowodować utratę fluorków podczas dyfuzji, co prowadzi do sztucznie niskich odczytów. Dzieje się tak zazwyczaj, gdy na krawędź pokrywy naczynia dyfuzyjnego nałożono niewystarczającą ilość wazeliny.. Zalecane działanie: Nanieść obfitą ilość wazeliny na krawędź pokrywki naczynia dyfuzyjnego i mocno docisnąć, aby zapewnić szczelne zamknięcie. Błędy podczas pipetowania roztworu kwasu octowego do pułapki z NaOH mogą spowodować zmianę pH próbki poza optymalny zakres pH 5,0, co prowadzi do niedokładnego odzysku fluorków. Zalecane działanie: Należy sprawdzić pH każdej próbki za pomocą papierka lakmusowego i odrzucić każdą próbkę, której pH wykracza poza zakres pH 5. Próbki kalibracyjne mogą również wykraczać poza dopuszczalne granice pomiarowe elektrody selektywnej do fluorków. Stężenia poniżej 0,02 ppm znajdują się poniżej granicy wykrywalności elektrody. Zalecane działanie: Nie należy stosować próbek kalibracyjnych zawierających mniej niż 0,02 ppm fluorków. Z kolei próbki kalibracyjne z nadmiernie wysokimi stężeniami fluorków mogą zmienić siłę jonową roztworu i wywołać nieliniowe odpowiedzi elektrody. Zalecane działanie: Na początku projektu należy przygotować roztwory kalibracyjne obejmujące szeroki zakres stężeń fluorków, aby wyznaczyć liniowy zakres pracy używanej elektrody. Jeśli próbki tkanek przekraczają ten zakres liniowy, należy zmniejszyć masę tkanki lub zwiększyć objętość pułapki z NaOH, odpowiednio dostosowując objętość kwasu octowego w celu utrzymania pH 5. Trudności w uzyskaniu liniowych krzywych kalibracyjnych w zakresie 0,02–1 ppm: powszechną przyczyną jest starzenie się elektrody. Starsze elektrody selektywne na jony fluorkowe tracą czułość przy bardzo niskich stężeniach fluorków. Zalecane działanie: wymienić elektrodę selektywną na jony fluorkowe. Niestabilne odczyty potencjometru (dryfowanie lub skoki sygnału) występują zazwyczaj wtedy, gdy powierzchnia pomiarowa elektrody nie jest całkowicie zanurzona w roztworze próbki. Zalecane działanie: obniżyć elektrodę tak, aby powierzchnia pomiarowa była całkowicie przykryta ciekłą próbką.
Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół zapewnia solidne podejście oparte na kalibracji w celu ilościowego oznaczania fluorków w różnych macierzach biologicznych i jest odpowiedni do badań nad ekspozycją na fluorki, ich odkładaniem się w tkankach oraz skutkami toksykologicznymi w modelach mysich.

Fluorek jest naturalnie występującym anionem, a jego optymalny poziom jest skuteczny w zapobieganiu próchnicy zębów1,2,3,4,5. W Stanach Zjednoczonych (U.S.) fluoryzacja wody w społecznościach na poziomie 0,7 ppm została wprowadzona jako strategia zdrowia publicznego w celu zmniejszenia zapadalności na próchnicę i poprawy zdrowia jamy ustnej6. Jednakże przedłużone spożywanie nadmiernych ilości fluorków może niekorzystnie wpływać na wiele tkanek. Wysoka ekspozycja na fluorki zaburza tworzenie się szkliwa7,8,9, zmienia proces kostnienia10 i upośledza integralność szkieletu11.
Na poziomie komórkowym ekspozycja na fluor wywołuje szereg zaburzeń metabolicznych, w tym stres oksydacyjny12, stres retikulum endoplazmatycznego13, modyfikacje epigenetyczne zmieniające ekspresję genów14 oraz apoptozę w ameloblastach15,16,17,18. W skali globalnej podwyższone stężenia fluorków w wodach gruntowych (&#62;1.5 ppm) stanowią istotny problem zdrowotny. Niedawne badanie z wykorzystaniem modelowania predykcyjnego wykazało, że około 180 milionów ludzi na całym świecie jest potencjalnie narażonych na nadmierną ekspozycję na fluor, przy czym największe obciążenie występuje w Azji i Afryce1. Poza wodą pitną ekspozycja na fluor następuje również poprzez żywność (np. owoce morza; ~1.9 ppm), napoje (np. herbata; 0.5–6 ppm19) oraz produkty stomatologiczne, takie jak pasta do zębów20 (1,000–1,500 ppm).
Zrozumienie ekspozycji na fluor, jego metabolizmu i depozycji w tkankach jest zatem niezbędne do oceny zarówno korzyści terapeutycznych, jak i potencjalnych skutków toksykologicznych. Precyzyjne oznaczenie ilości fluoru w próbkach biologicznych — w tym w moczu, surowicy, kościach i zębach — stanowi krytyczny element tych badań. Pomiar ten jest jednak trudny analitycznie ze względu na właściwości chemiczne fluoru oraz jego silne powinowactwo do macierzy bogatych w wapń. Około 99% fluoru w organizmie znajduje się w tkankach zmineralizowanych, takich jak kości i zęby21. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano szereg technik analitycznych, w tym potencjometrię z użyciem elektrody jonoselektywnej (ISE), chromatografię jonową, testy kolorymetryczne, procedury miareczkowe oraz metody jądrowe lub aktywacyjne22. Wśród nich technika dyfuzji wspomaganej heksametyldisiloksanem (HMDS) w połączeniu z pomiarem za pomocą elektrody selektywnej wobec jonów fluorkowych stała się jednym z najniezawodniejszych i najszerzej stosowanych podejść w przypadku macierzy biologicznych ze względu na swoją czułość, powtarzalność i kompatybilność z różnymi typami próbek23,24,25,26,27,28,29.
Mimo dostępności wielu metod analitycznych, każde podejście posiada ograniczenia, które mogą zawężać jego zastosowanie w badaniach eksperymentalnych lub klinicznych. Chromatografia jonowa zapewnia wysoką czułość i selektywność, lecz wymaga specjalistycznej aparatury i rozbudowanego przygotowania próbek30,31. Metody kolorymetryczne, takie jak metoda SPADNS (sód 2‑(parasulfofenyloazo)‑1,8-dihydroksynaftaleno-3,6‑disulfonian), są proste i niedrogie, ale są podatne na interferencje wywołane mętnością i endogennymi chromoforami, co ogranicza ich wiarygodność w złożonych próbkach biologicznych22,32,33. Metody miareczkowe są kosztowo efektywne i proste, lecz brakuje im czułości wymaganej do wykrywania śladowych ilości fluorków w większości preparatów biologicznych34. Techniki jądrowe lub oparte na aktywacji oferują wyjątkową czułość, ale wymagają dostępu do reaktorów lub źródeł neutronów opartych na akceleratorach, co czyni je niepraktycznymi do rutynowego użytku laboratoryjnego35. W przeciwieństwie do nich, dyfuzja wspomagana przez HMDS, a następnie pomiar ISE, zapewnia praktyczną równowagę między czułością, kosztem a dostępnością, zapewniając jednocześnie całkowite uwolnienie fluorków zarówno z tkanek miękkich, jak i zmineralizowanych. Jest to szczególnie korzystne w badaniach z udziałem małych zwierząt, gdzie dostępność tkanek jest ograniczona, a struktury zmineralizowane, takie jak siekacze myszy, dostarczają jedynie 3–5 mg popiołu na ząb.
Zdolność metody dyfuzyjno-ISE do koncentracji całego uwolnionego fluorku w małej, określonej objętości umożliwia dokładne oznaczanie ilościowe nawet w niezwykle małych próbkach. Dzięki temu metoda ta jest dobrze dostosowana do badań toksykokinetycznych, eksperymentów dawka-odpowiedź oraz badań metabolizmu fluorków na różnych etapach rozwoju. Małe gryzonie, w szczególności myszy C57BL/6J, są szeroko stosowane jako modele zwierzęce do badania efektów działania fluorków7,9,12,29,36.
W niniejszym protokole autorzy stosują technikę dyfuzji wspomaganej przez HMDS, a następnie pomiar za pomocą elektrody selektywnej wobec fluorków w celu ilościowego oznaczenia poziomu fluorków w surowicy, kościach i zębach pobranych od myszy eksponowanych na wysoką dawkę fluorków (125 ppm) w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Autorzy porównują ponadto akumulację fluorków u myszy w wieku młodzieńczym (6 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia) i dojrzałym (18 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia), aby ocenić zależne od wieku różnice w metabolizmie fluorków i ich odkładaniu się w tkankach. Jako reprezentatywną tkankę zębną wybrano siekacze żuchwy, ponieważ siekacze gryzoni wyrastają w sposób ciągły i osiągają stan równowagi między wyrastaniem a ścieraniem okluzyjnym mniej więcej w 7. tygodniu życia. Ten wzorzec ciągłego wzrostu zapewnia spójny i dostępny gradient rozwoju szkliwa, co czyni siekacze mysie powszechnie stosowanym i dobrze zwalidowanym modelem do badania formowania się szkliwa oraz fluorozy zębów.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>Tygle tlenkowe</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm średnicy zewnętrznej &amp;times; 25 mm H, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0,1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Homogenizator kulowy</td><td>Wzorzec odniesienia</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Igła do strzykawki z tępym zakończeniem</td><td>Amazon</td><td>Przemysłowa igła z tępym zakończeniem, 14 G &amp;times; 0,5 cala</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Dygestorium chemiczne</td><td>Mott Manufacturing</td><td>Model 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>D(+)-Sacharoza</td><td>Thermo Scientific</td><td>99,7% dla biochemii</td><td>177142500</td></tr><tr><td>Roztwór wypełniający elektrodę</td><td>Thermo Scientific</td><td>Roztwór wypełniający Orion IonPlus</td><td>900061</td></tr><tr><td>Roztwór alkoholu etylowego</td><td>Koptec</td><td>140 Proof</td><td>2401</td></tr><tr><td>Zamrażarka, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Seria Revco RDE</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Rękawice odporne na wysoką temperaturę</td><td>Fisher Scientific</td><td>Rękawice do autoklawa Bel-Art Clavies Biohazard</td><td>H13201</td></tr><tr><td>Heksametylodysiloksan (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, 30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>Elektroda jonoselektywna</td><td>Thermo Scientific</td><td>Dwukanałowa elektroda jonoselektywna (ISE) do fluorków Orion</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>VWR</td><td>Mieszadło 360</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Amazon</td><td>Szpatułka do rzeźbienia w wosku nr 7A, stal nierdzewna</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>Piec muflowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Mały piec muflowy laboratoryjny Thermolyne, 1,3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>Pieczarka/Inkubator (depending on context, typically "Piec" or "Inkubator" in a lab setting)</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu w PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>4% paraformaldehyd w PBS</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, niepoddane działaniu czynnika</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Thermo Scientific</td><td>Wazelina biała, czysta</td><td>417090010</td></tr><tr><td>Papier wskaźnikowy pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4,5&amp;ndash;10.0</td><td>92120.3</td></tr><tr><td>Tygiel porcelanowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Tygiel Fisherbrand, 5 ml, wysokość 20 mm, forma wysoka</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>Potencjometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>Miernik pH/ISE Orion Dual Star</td><td>2115102</td></tr><tr><td>Statyw laboratoryjny z uchwytem</td><td>VWR</td><td>Zacisk pierścieniowy, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>Dieta dla gryzoni</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; Osady</td><td>F1515</td></tr><tr><td>Podnośnik nożycowy</td><td>Amazon</td><td>Laboratoryjny podnośnik nożycowy</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Lejek rozdzielczy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, szkło borokrzemowe, 2 l</td><td>S89285</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certyfikowany ACS, krystaliczny</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certyfikowany ACS, proszek</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Białe granulki</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>Kule ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100 szt.</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>czystość stopnia ACS</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Roztwór aplikacyjny Orion IonPlus</td><td>940909</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Próżniowy deskryptor oszczędzający miejsce Bel-Art Space Saver, 10 cali</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>Filtr próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Filtr nakrętkowy Flow, PES, 90 mm, 0.2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>Wstrząsarka oscylacyjna z regulacją prędkości</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

Ilościowe oznaczenie poziomu fluorków w tkankach biologicznych jest niezbędne do zrozumienia ekspozycji, metabolizmu i toksyczności fluorków. Niniejszy protokół opisuje czułą i powtarzalną metodę pomiaru masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametyldisiloksanem (HMDS), a następnie analizy za pomocą elektrody jonoselektywnej (ISE). Próbki biologiczne, w tym surowica, kość udowa i siekacze żuchwy, są pobierane od myszy poddanych kontrolowanym zabiegom z użyciem fluorków. Próbki kości i zębów są popielane, mielone i nawadniane, natomiast surowica jest przetwarzana bezpośrednio. Każda próbka jest przenoszona do naczynia dyfuzyjnego zawierającego wodę ultraczystą i uszczelniana pokrywką wyłożoną wazeliną, na której znajdują się krople wodorotlenku sodu służące jako pułapki na fluorki. Wstrzyknięcie kwasu siarkowego nasyconego HMDS inicjuje uwalnianie i dyfuzję fluorków, co pozwala na ilościowe wychwycenie uwolnionych jonów fluorkowych w pułapkach. Po całonocnej dyfuzji krople z pułapek na fluorki są łączone w jedną próbkę, zakwaszane do wymaganego zakresu pH i doprowadzane do określonej objętości w celu pomiaru ISE. Naczynia dyfuzyjne do kalibracji, przygotowane z zastosowaniem znanych mas fluorków, służą do wygenerowania krzywej wzorcowej dla kwantyfikacji, a próbki kontroli jakości weryfikują stabilność elektrody. Reprezentatywne wyniki uzyskane od młodocianych i dojrzałych myszy eksponowanych na 0 lub 125 ppm fluorków demonstrują zdolność metody do wykrywania różnic w poziomach fluorków w surowicy, kościach i zębach, zależnych od wieku i dawki. Niniejszy protokół zapewnia solidne, oparte na kalibracji podejście do ilościowego oznaczania fluorków w różnorodnych macierzach biologicznych i jest odpowiedni do badań nad ekspozycją na fluorki, ich odkładaniem się w tkankach oraz skutkami toksykologicznymi w modelach mysich. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość dokładnej kwantyfikacji fluorków w niezwykle małych próbkach, w tym w 3–5 mg popiołu uzyskanego z pojedynczych siekaczy mysich, ponieważ proces dyfuzji koncentruje wszystkie uwolnione fluorki w mierzalnej objętości próbki mniejszej niż 100&#160;µL.

Aby zademonstrować zastosowanie niniejszego protokołu do pomiaru stężeń fluorków (F-) w materiałach biologicznych, przygotowano próbki z surowicy, kości oraz siekaczy dolnych pobranych od myszy poddanych kontrolowanym zabiegom z użyciem fluorków. Samce myszy C57BL/6J przydzielono do dwóch kategorii wiekowych: młodzieńczych (6 tygodni) i dojrzałych (18 tygodni), a następnie podawano im albo zdejonizowaną wodę wolną od fluorków (0 ppm F⁻), albo wodę pitną z dodatkiem fluorku sodu (125 ppm F⁻) przez 6-tygodniowy okres ekspozycji. W każdej grupie wiekowej i warunkach traktowania znajdowało się pięć zwierząt. Po zakończeniu okresu ekspozycji pobrano surowicę, kości udowe oraz siekacze dolne, a następnie przygotowano i przeanalizowano próbki zgodnie z protokołem. Reprezentatywne stężenia fluorków zmierzone w surowicy, kościach i zębach podsumowano poniżej.
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
Rycina 4Stężenia fluorków zmierzone w surowicy, kości udowej oraz siekaczach żuchwy. Samce myszy szczepu C57BL/6J przydzielono do dwóch kategorii wiekowych: młodzieńczych (6. tydzień, pusty słupek) oraz dojrzałych (18. tydzień, wypełniony słupek) i zapewniono im albo beztlenową wodę dejonizowaną wolną od fluorków (0 ppm F&#8315;) lub wodę pitną wzbogaconą fluorkiem sodu (125 ppm F&#8315;) przez 6-tygodniowy okres ekspozycji. Po zakończeniu okresu ekspozycji zmierzono poziom fluorków w (A) surowicy, (B) kości udowej oraz (C) siekaczach żuchwy u osobników z tych samych grup badawczych. Wartości w surowicy poniżej granicy wykrywalności (&#60;(0,02 ppm) naniesiono na wykres w celu wizualizacji, lecz wykluczono z analizy statystycznej. Dane przedstawiono jako średnie &#177; OD. Porównania między grupą młodzieńczą a dojrzałą przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
Stężenia fluorków w surowicy 
W obu grupach (młodzieńczych i dojrzałych) traktowanych 0 ppm fluorków stężenia fluorków w surowicy znajdowały się poniżej granicy wykrywalności elektrody jonoselektywnej (&lt;0,02 ppm). W grupach traktowanych 125 ppm stężenie fluorków w surowicy wzrosło do 0,3 ± 0,2 ppm w grupie młodzieńczej oraz do 0,7 ± 0,2 ppm w grupie dojrzałej (p = 0,06). Porównanie między grupą młodzieńczą a dojrzałą traktowanymi 125 ppm przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 (N = 5/grupa). Grupy traktowane 0 ppm zostały wykluczone z analizy statystycznej. (Rycina 4A, Tabela 1).
Stężenia fluorków w kości udowej 
W grupach traktowanych 0 ppm stężenia fluorków w kości udowej były znacząco niższe u osobników młodocianych (292 ± 39 ppm) w porównaniu z osobnikami dojrzałymi (896 ± 55 ppm) (p &#60; 0,01). W przeciwieństwie do tego, w grupach 125 ppm stężenia fluorków u osobników młodocianych (4 108 ± 482 ppm) były znacząco wyższe niż u osobników dojrzałych (2 966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Porównania między grupami młodocianymi i dojrzałymi przeprowadzono przy użyciu testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla wielokrotnych porównań. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupa). (Rysunek 4B, Tabela 1). Rysunek 5A przedstawia krotność zmiany stężenia fluorków w kości udowej pomiędzy traktowaniem 0 ppm a 125 ppm dla każdej grupy wiekowej. U osobników młodocianych odnotowano 14-krotny wzrost poziomu fluorków przy 125 ppm, podczas gdy u myszy dojrzałych wzrost ten był 3-krotny.
Stężenia fluorków w siekaczach żuchwy 
W grupach 0 ppm stężenia fluorków w siekaczach żuchwy były znacznie niższe u młodzieńczych osobników (35 ± 4 ppm) w porównaniu z dorosłymi zwierzętami (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). W grupach leczonych dawką 125 ppm stężenia fluorków w siekaczach wzrosły do 5641 ± 955 ppm u młodzieńczych osobników oraz 4392 ± 1694 ppm u dorosłych zwierząt. Porównania między grupą młodzieńczych a dorosłych osobników przeprowadzono przy użyciu testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/grupa). (Rycina 4C, Tabela 1). Chociaż bezwzględne stężenia fluorków przy 125 ppm nie różniły się istotnie między grupami wiekowymi, krotność zmiany z 0 ppm do 125 ppm była znacznie większa u myszy młodzieńczych (wzrost 161-krotny) niż u dorosłych (wzrost 36-krotny) (Rycina 5B).
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: U adolescentów obserwuje się większy krotny wzrost akumulacji fluorków w kościach i siekaczach niż u myszy dorosłych.Krotna zmiana stężeń fluorków przy przejściu z traktowania 0 ppm na 125 ppm fluorkami u myszy adolescentów (słupek pusty) i dorosłych (słupek wypełniony). (A) Kość udowa i (B) siekacz żuchwy z tych samych grup traktowania. Dane przedstawiono jako średnie ± SD. Porównania między grupami adolescentów i dorosłych wykonano za pomocą nieparzystego testu t. * p &#60; 0,05, (N = 5/grupa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td >
			<td colspan="4" >Surowica</td >
			<td colspan="4" >Kość udowa</td >
			<td colspan="4" >Siekacz żuchwowy</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Grupa wiekowa</td >
			<td colspan="2" >Młodzieńcza</td >
			<td colspan="2" >Dojrzała</td >
			<td colspan="2" >Młodzieńcza</td >
			<td colspan="2" >Dojrzała</td >
			<td colspan="2" >Młodzieńcza</td >
			<td colspan="2" >Dojrzała</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Grupa badawcza</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm&#160;</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm&#160;</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm</td >
			<td >0 ppm</td >
			<td >125 ppm</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.2</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.8</td >
			<td >324</td >
			<td >4576</td >
			<td >933</td >
			<td >3081</td >
			<td >37</td >
			<td >4824</td >
			<td >161</td >
			<td >3229</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.1</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.8</td >
			<td >229</td >
			<td >3778</td >
			<td >924</td >
			<td >3326</td >
			<td >39</td >
			<td >5451</td >
			<td >127</td >
			<td >2654</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.7</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >1.0</td >
			<td >300</td >
			<td >4683</td >
			<td >877</td >
			<td >3713</td >
			<td >31</td >
			<td >5544</td >
			<td >112</td >
			<td >6997</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.4</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.5</td >
			<td >323</td >
			<td >3832</td >
			<td >807</td >
			<td >2519</td >
			<td >35</td >
			<td >5114</td >
			<td >103</td >
			<td >4169</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.3</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.5</td >
			<td >283</td >
			<td >3669</td >
			<td >937</td >
			<td >2192</td >
			<td >N/A</td >
			<td >7271</td >
			<td >111</td >
			<td >4909</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średnia</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.3</td >
			<td >&#60; 0.02</td >
			<td >0.7</td >
			<td >292</td >
			<td >4108</td >
			<td >896</td >
			<td >2966</td >
			<td >35</td >
			<td >5641</td >
			<td >123</td >
			<td >4392</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >SD</td >
			<td >NA</td >
			<td >0.2</td >
			<td >NA</td >
			<td >0.2</td >
			<td >39</td >
			<td >482</td >
			<td >55</td >
			<td >612</td >
			<td >3</td >
			<td >955</td >
			<td >23</td >
			<td >1694</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Indywidualne pomiary fluorków w surowicy, kości udowej i siekaczach żuchwy. Tabela 1 przedstawia indywidualne stężenia fluorków (ppm F⁻) zmierzone w próbkach surowicy, kości udowej i siekaczy żuchwy u myszy młodocianych i dojrzałych, wystawionych na działanie 0 ppm lub 125 ppm fluorków. Dla każdego rodzaju tkanki dane przedstawiono w kolumnach odpowiadających czterem grupom badawczym: młodociane 0 ppm, młodociane 125 ppm, dojrzałe 0 ppm oraz dojrzałe 125 ppm. Każda kolumna zawiera pięć indywidualnych wartości pomiarowych (N = 5), a następnie obliczoną średnią i odchylenie standardowe (SD). W grupie surowicy myszy młodocianych 0 ppm wszystkie odnotowane wartości znajdowały się poniżej granicy wykrywalności elektrody jonoselektywnej (&lt;0,02 ppm). Tabela zawiera surowe dane liczbowe stanowiące podstawę wartości podsumowujących i porównań statystycznych przedstawionych na Rysunku 4.

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie naczyń dyfuzyjnych wspomaganych heksametylodisiloksanem (HMDS), a następnie pomiary za pomocą elektrody jonowo-selektywnej w celu ilościowego oznaczenia masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach myszy. Metoda ta stanowi czułe, oparte na kalibracji podejście do oceny akumulacji fluorków w próbkach biologicznych.

Oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną

Ilościowe oznaczenie poziomu fluorków w tkankach biologicznych jest niezbędne do zrozumienia ekspozycji na fluorek, jego metabolizmu oraz toksyczności. Niniejszy protokół opisuje ...

Nasze badania koncentrują się na ilościowym oznaczeniu stężenia fluorków w surowicy, kościach i zębach myszy poddanych działaniu fluorków. Istniejące metody wymagają dużych próbek lub kosztownej aparatury. Niniejszy protokół umożliwia pomiar poziomu fluorków w próbkach o objętości mikrolitrów lub masie miligramów.W pierwszej kolejności należy wyciąć kości kończyn u młodocianych i dorosłych myszy C57BL/6J, którym podawano wodę pitną z dodatkiem fluorku sodu lub wodę wolną od fluorków. Po wysuszeniu kości należy przenieść do tygla z tlenku glinu, a następnie spopielić je w piecu muflowym w temperaturze 600 °C przez sześć godzin, stosując szybkość wzrostu temperatury 150 °C na godzinę.Umieść nieobrobioną szalkę Petriego o wymiarach 60x15 mm na czystej powierzchni. Za pomocą podgrzanej igły do strzykawki o rozmiarze 18 G wypal mały otwór w pokrywce szalki Petriego. Następnie, używając strzykawki 10 ml z założoną tępą igłą 14 G, pokryj wewnętrzną krawędź pokrywki szalki Petriego ciągłą warstwą wazeliny w celu uszczelnienia. Za pomocą mikroszpatułki rozetrzyj spopielone kości znajdujące się w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml na drobny proszek, a następnie niezwłocznie przystąp do obróbki sproszkowanego popiołu kostnego. Zużyte materiały zanieczyszczone popiołem kostnym zutylizuj w instytucjonalnym strumieniu odpadów chemicznych. Przenieś zmielony popiół kostny do małego naczynia porcelanowego, aby zminimalizować ładunek elektrostatyczny i zapobiec rozprzestrzenianiu się proszku. Następnie umieść pustą podstawę szalki Petriego na wadze analitycznej o rozdzielczości co najmniej 0,1 mg. Za pomocą mikroszpatułki odważ około 5 mg popiołu kostnego i zapisz dokładną masę. Odważony popiół natychmiast zalej 3 ml wody ultrapure.Nanieś 50 µL 0,05 N wodorotlenku sodu, w trzech kroplach, na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego, z dala od krawędzi, aby utworzyć pułapkę na fluorki. Odwróć pokrywkę szalki Petriego, nie naruszając kropli wodorotlenku sodu. Szczelnie zamocuj pokrywkę do dna szalki Petriego za pomocą wazeliny. Przygotuj 3 N roztwór kwasu siarkowego nasyconego HMDS, mieszając równe objętości 6 N kwasu siarkowego nasyconego HMDS oraz wody ultrapure. Bezzwłocznie nabierz 3 mL przygotowanego roztworu do strzykawki o pojemności 10 mL z igłą o rozmiarze 20G. Wstrzyknij roztwór przez otwór w pokrywce do wody znajdującej się na dnie naczynia dyfuzyjnego. Ostrożnie wyjmij igłę, uważając, aby nie rozpryskać kwasu na wewnętrzną powierzchnię pokrywki. Szybko i całkowicie uszczelnij otwór wstrzykiwania kropelką wazeliny. Umieść naczynia dyfuzyjne na wytrząsarce platformowej ustawionej na niską prędkość i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.Przed rozpoczęciem pomiarów należy umieścić napełnioną elektrodę jon-selektywną w uchwycie i podłączyć ją do potencjometru. Na podnośniku nożycowym, pod powierzchnią pomiarową elektrody, ustaw niepotraktowaną szalkę Petriego, dbając o to, aby powierzchnia pomiarowa była równoległa do dna szalki. Podnieś blat podnośnika nożycowego, aż szalka Petriego niemal dotknie elektrody. Po okresie inkubacji wyjmij naczynie dyfuzyjne z kołyski. Ostrożnie zdejmij pokrywkę, przełamując uszczelnienie z wazeliny. Następnie odwróć pokrywkę na płaskiej powierzchni, nie naruszając trzech kropel pułapki fluorkowej. Następnie, używając pipety P20, dodaj od 15 do 20 µL 0,2 N kwasu octowego do jednej z kropel pułapki fluorkowej, a następnie połącz wszystkie trzy krople w jedną, nie wymieniając końcówki pipety. Pozostaw połączoną próbkę na odwróconej pokrywce. Ustaw pipetę P100 na 75 µL. Pobierz całą objętość pułapki fluorkowej, unikając wprowadzenia powietrza, a objętość próbki uzupełnij do dokładnie 75 µL wodą ultrapure. Przejdź bezzwłocznie do pomiaru. Nanieś próbkę pomiędzy powierzchnię pomiarową elektrody selektywnej na fluorki a szalkę Petriego. Upewnij się, że cała powierzchnia pomiarowa jest zanurzona w cieczy, nie dotykając szalki Petriego. Odczekaj do ustabilizowania się odczytu, a następnie zapisz potencjał elektrody w mV z wyświetlacza potencjometru.U myszy otrzymujących wodę pitną wolną od fluorków efemeryczne stężenie fluorków było znacznie niższe u osobników młodzieńczych niż u myszy dojrzałych. Z kolei ekspozycja na 125 ppm fluorków odwróciła ten wzorzec, prowadząc do znacznie wyższych stężeń fluorków w kościach udowych u osobników młodzieńczych w porównaniu z myszami dojrzałymi. Po ekspozycji na fluorki u myszy młodzieńczych odnotowano 14-krotny wzrost stężenia fluorków w kościach udowych, podczas gdy u myszy dojrzałych wzrost ten był mniejszy i wyniósł trzykrotność wartości wyjściowej.Niniejszy protokół pozwala na dokładny pomiar stężeń fluorków w surowicy i tkankach zmineralizowanych przy zastosowaniu bardzo małych objętości próbek. Kluczowe jest, aby precyzyjnie odważony popiół został w całości przeniesiony do naczynia dyfuzyjnego, ponieważ jakakolwiek strata obniża wiarygodność wyników. Mamy nadzieję, że przyszłe badania wykorzystają to podejście, aby odkryć, w jaki sposób akumulacja fluorków wpływa na stan zdrowia tkanek, ryzyko wystąpienia chorób oraz procesy starzenia.

quantification-fluoride-serum-bone-teeth-murine-model-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi.  Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Poznaj metodę oznaczania fluorków w surowicy, kościach i zębach myszy z wykorzystaniem dyfuzji HMDS oraz elektrody jonoselektywnej. Protokół umożliwia precyzyjną analizę małych próbek biologicznych w badaniach toksykologicznych.

Oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną

Przeglądaj więcej filmów