ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez grant pilotażowy od Einstein-Rockefeller-CUNY Center for AIDS Research, finansowany przez National Institutes of Health (NIH): P30 AI124414. Einstein FACS Core Facility oraz wspólne użytkowanie instrumentów były wspierane przez następujące granty NIH: P30CA013330, S10OD026833 i S10OD032169.

Niniejsze badanie wykorzystuje anonimowe ludzkie materiały biologiczne uzyskane z biobanku na podstawie protokołu zatwierdzonego przez Komisję Etyczną Instytucjonalną – “Biologia molekularna dobroczynnych i złośliwych zaburzeń hematologicznych” (Protokół IRB nr 200536) w Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etyki instytucjonalnej. Wszystkie reagenty i sprzęt wymieniono w ​Tabeli Materiałów. 
1. Przygotowanie pochodzących od pacjenta komórek szpiku kostnego lub obwodowego krwi mononuklearnej
UWAGA: Zgodnie z powszechnymi wytycznymi dotyczącymi postępowania z próbkami pacjentów, zaleca się noszenie pełnej laboklautki i rękawic oporny na rozdarcie oraz pracę pod komorą hodowlany w celu ochrony osobistej przed narażeniem na zakażenia przenoszone drogą krwi. Wszystkie końcówki pipet i pipety serologiczne, które mają kontakt z komórkami pacjenta, powinny być moczone w 10% roztworze chloru przez co najmniej 30 minut przed wyrzuceniem w odpady biologicznie niebezpieczne.
<ol>
	<li>Przygotowanie eksperymentalne
	<ol>
		<li>Podgrzej media IMDM, surowicę położniczą (FBS) i antybiotyki penicylina-streptomycyna (Pen-strep) do 37 °C przez co najmniej 30 min.</li>
		<li>Roztapiaj półsztywne media w 4 °C przez noc. W dniu wysiewu, podgrzej butelkę do temperatury pokojowej (RT) przez co najmniej 30 min.</li>
		<li>Sterylizuj komorę hodowlaną za pomocą UV przez 15 min, następnie spryskaj powierzchnie komory, pipety i stojaki na probówki 70% alkoholem etylowym (EtOH).</li>
		<li>Przygotuj becher z odpadami zawierający 10% roztworu chloru, wystarczająco duży, aby zebrać zanieczyszczone końcówki pipet i pipety serologiczne.</li>
		<li>Uzyskaj komórki szpiku kostnego lub obwodowego krwi mononuklearnej izolowane metodami centryfugacyjnymi w gradientzie gęstości. Komórki można użyć w tym samym dniu po pobraniu lub z mrożonych próbek zbiorczych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli próbki są mrożone, szybko je rozmroź w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż większość lodu się stopi, a pozostanie tylko mały kryształ lodu. Natychmiast umieść próbki na lodzie po rozmrożeniu. 
	UWAGA: Próbki pacjentów są bardzo wrażliwe na rozmrożenie. Ważne jest, aby szybko i w partiach rozmrożać próbki, aby zminimalizować śmierć komórek.</li>
	<li>Zawieś komórki w 5 mL podgrzanego pełnego medium wzrostowego (media IMDM uzupełnione o 4% FBS i 1% Pen-Strep).</li>
	<li>Wyznacz stężenie komórek i żywotność za pomocą barwnika AO/PI i automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Centryfuguj komórki przez 350 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby utworzyć pellet komórek. Odłóż nadstan.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 5 mL sterylnego buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS). Powtórz centryfugacje, aby utworzyć pellet komórek i odłożyć nadstan.</li>
	<li>Zawieś komórki w pełnym medium wzrostowym w stężeniu 2 milionów żywych komórek/mL. Przygotuj wystarczającą ilość komórek na 100 tys. komórek/dołku 6-dołkowej płytki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie leków i podawanie leczenia. 
UWAGA: Pyrymetamina jest uzyskiwana jako liofilizowano proszek i jest rekonstytuowana w domu w dimetylosulfonie (DMSO) w stężeniu 100 mM; alikwoty są przechowywane w -80 °C. Venetoklaks jest kupowany w postaci roztworu w DMSO w stężeniu 10 mM i jest przechowywany w -20 °C. W tym eksperymencie venetoklaks i pyrimetamina są podawane jako pojedyncza dawka poprzez swobodne przyjęcie równolegle z warunkiem kontrolnym pojazdu DMSO. 
OSTROŻNOŚĆ: Pyrymetamina, venetoklaks i DMSO są substancjami biologicznie niebezpiecznymi. Obsługiwać tylko pod komorą, nosząc PPE i stosować z dodatkową ostrożnością.
<ol>
	<li>W dniu wysiewu, rozmroź alikwotę leku na lodzie, wymieszaj w wirówce i wiruj z maksymalną prędkością na stołowej mini-wirówce przez 30 s.</li>
	<li>Wymieszaj i energicznie szarpnij butelkę półsztywnego media, aż wszystkie składniki będą zhomogenizowane. Pozostawić w spokoju w komorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby pęcherzyki wzniosły się na powierzchnię.</li>
	<li>Przygotuj 3 mL alikwot półsztywnego media w sterylnych 15 mL stożkowych probówkach. Pozostawić probówki w spokoju przez 30 min, aby pęcherzyki wzniosły się na powierzchnię. Dodatkowe alikwoty półsztywnego media można ponownie zamrozić i przechowywać w -20 °C do późniejszego użytku.</li>
	<li>Dodaj nie więcej niż 10 μL objętości leku do półsztywnego media. W tym eksperymencie stężenia venetoklaksu i pyrimetaminy są dostosowywane zgodnie z empirycznie określonymi warunkami synergistycznymi. Do grupy kontrolnej pojazdu dodaj odpowiednie objętości DMSO. Przygotuj podwójne 3 mL alikwoty dla każdego warunku. 
	UWAGA: Ważne jest, aby objętość do

<ol>
	<li>Papaemmanuil E, Gerstung M, Malcovati L, Tauro S, Gundem G, Van Loo P, et al. Clinical and biological implications of driver mutations in myelodysplastic syndromes. Blood. 2013;122(22):3616-27.</li>
	<li>Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov O, Simon MS, Cheang G, Lee S, et al. Somatic mutations precede acute myeloid leukemia years before diagnosis. Nat Med. 2018;24(7):1015-23.</li>
	<li>Gaulin C, Kelemen K, Arana Yi C. Molecular pathways in clonal hematopoiesis: from the acquisition of somatic mutations to transformation into hematologic neoplasm. Life (Basel). 2022;12(8):1135.</li>
	<li>Menssen AJ, Walter MJ. Genetics of progression from MDS to secondary leukemia. Blood. 2020;136(1):50-60.</li>
	<li>Fabre MA, de Almeida JG, Fiorillo E, Mitchell E, Damaskou A, Rak J, et al. The longitudinal dynamics and natural history of clonal haematopoiesis. Nature. 2022;606(7913):335-42.</li>
	<li>Purton LE, Scadden DT. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 2007;1(3):263-70.</li>
	<li>Yusoff NA, Abd Hamid Z, Budin SB, Taib IS. Hematopoietic stem cell discovery: unveiling the historical and future perspective of colony-forming units assay. PeerJ. 2025;13:e18854.</li>
	<li>Franken NAP, Rodermond HM, Stap J, Haveman J, van Bree C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 2006;1(5):2315-9.</li>
	<li>Cho JH, Kim JS, Kim ST, Hong JY, Park JO, Park YS, et al. Selective colony area method for heterogeneous patient-derived tumor cell lines in anti-cancer drug screening system. PLoS One. 2019;14(4):e0215080.</li>
	<li>Mayani H, Dragowska W, Lansdorp PM. Cytokine-induced selective expansion and maturation of erythroid versus myeloid progenitors from purified cord blood precursor cells. Blood. 1993;81(12):3252-8.</li>
	<li>STEMCELL Technologies. Human colony-forming unit (CFU) assays using MethoCult. Technical manual version 4.6.0. Vancouver (BC): STEMCELL Technologies; 2019.</li>
	<li>Gribaldo L, Casati S, Castoldi AF, Pessina A. Comparison of in vitro drug-sensitivity of human granulocyte-macrophage progenitors from two different origins: umbilical cord blood and bone marrow. Exp Hematol. 1999;27(11):1593-8.</li>
	<li>Brown JI, Persaud R, Iliev P, Karmacharya U, Attarha S, Sahile H, et al. Investigating the anti-cancer potential of pyrimethamine analogues through a modern chemical biology lens. Eur J Med Chem. 2024;264:115971.</li>
	<li>Liu H, Qin Y, Zhai D, Zhang Q, Gu J, Tang Y, et al. Antimalarial drug pyrimethamine plays a dual role in antitumor proliferation and metastasis through targeting DHFR and TP. Mol Cancer Ther. 2019;18(3):541-55.</li>
	<li>Khan MW, Saadalla A, Ewida AH, Al-Katranji K, Al-Saoudi G, Giaccone ZT, et al. The STAT3 inhibitor pyrimethamine displays anti-cancer and immune stimulatory effects in murine models of breast cancer. Cancer Immunol Immunother. 2018;67(1):13-23.</li>
	<li>Rivera-Pe&#241;a B, Chakraborty S, Shi Y, Zhang H, Desai SR, Patel PP, et al. Pyrimethamine overcomes resistance to hypomethylating agents by reducing de novo pyrimidine synthesis. Exp Hematol. 2026;156:105382.</li>
	<li>DiNardo CD, Pratz KW, Letai A, Jonas BA, Wei AH, Thirman M, et al. Safety and preliminary efficacy of venetoclax with decitabine or azacitidine in elderly patients with previously untreated acute myeloid leukaemia: a non-randomised, open-label, phase 1b study. Lancet Oncol. 2018;19(2):216-28.</li>
	<li>Konopleva M, Pollyea DA, Potluri J, Chyla B, Hogdal L, Busman T, et al. Efficacy and biological correlates of response in a phase II study of venetoclax monotherapy in patients with acute myelogenous leukemia. Cancer Discov. 2016;6(10):1106-17.</li>
	<li>Armstrong Lumley M, Burgess R, Billingham LJ, McDonald DF, Milligan DW. Colony counting is a major source of variation in CFU-GM results between centres. Br J Haematol. 1997;97(2):481-4.</li>
	<li>Lamana M, Albella B, Rodr&#237;guez F, Regidor C, Bueren JA. Conclusions of a national multicenter intercomparative study of in vitro cultures of human hematopoietic progenitors. Bone Marrow Transplant. 1999;23(4):373-80.</li>
	<li>Moroff G, Eichler H, Brand A, Kekom&#228;ki R, Kurtz J, Letowska M, et al. Multiple-laboratory comparison of in vitro assays utilized to characterize hematopoietic cells in cord blood. Transfusion. 2006;46(4):507-15.</li>
	<li>Morrison SJ, Scadden DT. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 2014;505(7483):327-34.</li>
	<li>Shlush LI, Zandi S, Mitchell A, Chen WC, Brandwein JM, Gupta V, et al. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature. 2014;506(7488):328-33.</li>
	<li>Becker AJ, McCulloch EA, Till JE. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature. 1963;197(4866):452-4.</li>
	<li>Bradley TR, Metcalf D. The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Aust J Exp Biol Med Sci. 1966;44(3):287-99.</li>
	<li>Pamphilon D, Selogie E, McKenna D, Cancelas-Peres J, Szczepiorkowski ZM, Sacher R, et al. Current practices and prospects for standardization of the hematopoietic colony-forming-unit (CFU) assay: a report by the Cellular Therapy Team of the Biomedical Excellence for Safer Transfusion (BEST) Collaborative. Cytotherapy. 2013;15(3):255-62.</li>
	<li>Marzec-Schmidt K, Ghosheh N, Stahlschmidt SR, K&#252;ppers-Munther B, Synnergren J, Ulfenborg B. Artificial intelligence supports automated characterization of differentiated human pluripotent stem cells. Stem Cells. 2023;41(9):850-61.</li>
</ol>

Autorzy nie mają innych interesów konfliktowych do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę przeprowadzania badań CFU z wykorzystaniem pierwotnych próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej pacjentów, ze szczególnym uwzględnieniem utrzymania żywotności komórek i zapewnienia reproduktywalnego wzrostu kolonii. Kilka kroków w protokole jest kluczowych dla uzyskania niezawodnego tworzenia kolonii podczas pracy z próbkami pochodzącymi od pacjentów. Szybkie rozmrażanie krioprzechowywanych komórek jednojądrzastyh wraz z natychmiastowym schłodzeniem jest niezbędne ...

Krątkoczenie jest ściśle regulowanym procesem, w którym komórki macierzyste krwiotwórcze (HSC) znajdujące się w niszach rdzenia kręgowego dają początek wszystkim dojrzałym liniom komórek krwi. Poprzez hierarchiczną serię zdarzeń różnicowania, HSC wytwarzają wielopotatne prądniki, które stopniowo angażują się w linie erytrocytów, mieloidalne i limfoidalne przed końcowym dojrzewaniem do funkcjonalnych krążących komórek krwi. Ten proces jest rządzony przez skoordynowane sygnalizację w środowisku rdzenia kręgowego i przez wewnętrzne mechanizmy regulacji transkrypcyjnych i epigenetycznych. Zakłócenia tych ścieżek regulacyjnych, szczególnie poprzez akumulację mutacji genetycznych lub somatycznych w HSC, mogą upośledzić normalne różnicowanie i prowadzić do klonalnej ekspansji nieprawidłowych prądników. Takie zmiany mogą ostatecznie prowadzić do zaburzeń hematologicznych charakteryzujących się nieefektywnym krątkoczeniem i cytopeniami, w tym zespołami mielodysplastycznymi (MDS) i ostrą białaczką szpikową (AML)1,2,3,4,5.
Test jednostki kolonii (CFU) jest dobrze ugruntowaną techniką in vitro do oceny potencjału różnicowania komórek macierzystych i prądników krwiotwórczych (HSPC). Oryginalnie opracowany jako krótkoterminowy test do pomiaru zdolności proliferacyjnej i różnicowania prądników krwiotwórczych6,7,8, test CFU stał się od tego czasu powszechnie stosowanym narzędziem zarówno w hematologii klinicznej, jak i eksperymentalnej9. W przedklinicznych ustawieniach laboratoryjnych test jest często stosowany do oceny wpływu zaburzeń genetycznych lub kandydatów na leki na różnicowanie krwiotwórcze. W kontekście badań nad MDS i AML, testy CFU zapewniają funkcjonalne odczyty do zrozumienia, jak zmiany molekularne i genetyczne wpływają na zdolność różnicowania komórek pochodzących od pacjentów z rdzenia kręgowego lub krwi obwodowej.
Test CFU polega na hodowlanom HSPC w półstałym podłożu na bazie metyloceluozy uzupełnionym o określone czynniki wzrostu, które wspierają ekspansję i różnicowanie linii komórkowych. W tych warunkach prądniki proliferają i dają początek osobnym koloniom, które mogą być morfologicznie sklasyfikowane według tożsamości linii. W tym protokole stosuje się komercyjnie dostępne półstałe podłoże na bazie metyloceluozy zoptymalizowane pod kątem różnicowania erytrocytów i mieloidalnych, które zawiera kombinację cytokin, w tym interleukiny-3 (IL-3), interleukiny-6 (IL-6), czynnika komórki macierzystej (SCF), erytropoetyny (EPO), czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF) oraz czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF). Razem czynniki te wspierają wzrost prądników erytrocytów, takich jak jednostka kolonii-erytrocyt (CFU-E) i jednostka tworząca wybuch erytrocytów (BFU-E), prądników granulocytów-makrofagów (CFU-GM) oraz wielopotatnych prądników, takich jak prądniki granulocytów, erytrocytów, monocytów, megakariocytów (CFU-GEMM)10,11.
Mimo szerokiego zastosowania, powyższe półstałe podłoże jest ograniczone w swojej zdolności różnicowania, ponieważ nie wspomaga odpowiednio różnicowania megakariocytów i płytek. W tych zastosowaniach bardziej specjalistyczne formuły zawierające czynniki wzrostu płytek są bardziej odpowiednie; jednak są one poza zakresem opisanego protokołu. Ogólnie, poprzez staranne dobór formuły podłoża w połączeniu z oceną morfologiczną i analizą bieżącą, taką jak cytometria przepływowa, naukowcy mogą efektywnie ocenić wrażliwość na leki poprzez analizę zobowiązania linii i potencjału różnicowania12.
W niniejszym badaniu test CFU jest stosowany do zbadania potencjału terapeutycznego terapii skojarzonych w leczeniu nawrotowych/odpornych wysokiego ryzyka MDS. Pyrymetamina jest klinicznie zatwierdzonym antyfolikiem stosowanym w leczeniu toksoplazmozy oraz malarii pasożytniczej i została niedawno przebadana jako środek przeciwnowotworowy13,14,15. Ostatnie badania wykazały, że leczenie pyrimetaminą może działać poprzez hamowanie kluczowych szlaków regulujących de novo syntezę pirymidyn16. W niniejszym protokole testy CFU są wykorzystywane do zbadania klinicznej skuteczności pyrimetaminy jako monoterapii i jako terapii skojarzonej z Venetoclax, który jest obecnie pierwszoliniową terapią w leczeniu MDS i AML17,18.
Mimo szerokiego zastosowania, test CFU ma kilka ograniczeń technicznych. Identyfikacja i klasyfikacja kolonii opierają się w dużej mierze na kryteriach morfologicznych, co może wprowadzać zmienność między

<table><tbody><tr><td>Blunt-End 16 G needles</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>28110</td><td>do dozowania i wysiewu MethoCult media</td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexelcom Bioscience</td><td>26407</td><td>licznik komórek</td></tr><tr><td>CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)</td><td>Revvity</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>szlabanki do licznika komórek</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td>używany do rekonstytucji leków i mediów do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories, Inc. </td><td>2701</td><td>do sterylizacji powierzchni kultur komórkowych</td></tr><tr><td>EVOS M7000 imaging system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>do obrazowania kolonii i płytek</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td>suplement do mediów do hodowli i zamrażania komórek</td></tr><tr><td>IMDM Modified Culture media</td><td>Cytiva</td><td>SH30228.01</td><td>wzbogacone medium kulturowe nadające się do przetwarzania próbek pacjentów</td></tr><tr><td>LuerLok Tip 3 mL Syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td>do dozowania i wysiewu MethoCult media</td></tr><tr><td>MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>04435</td><td>półstałe medium oparte na metylocelulozie do badania kolonii</td></tr><tr><td>Multiwell 6-well plate</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>do wysiewu badań kolonii</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope</td><td>Coastal Microscopes</td><td>51623</td><td>Do obrazowania i charakteryzacji morfologii kolonii</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>suplement antybiotyczny do hodowli komórek</td></tr><tr><td>pyrimethamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46706</td><td>zatwierdzony przez FDA antyfoliant</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled water&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>do wysiewu badań kolonii</td></tr><tr><td>venetoclax</td><td>Selleck Chemical LLC&nbsp;</td><td>50-136-6419</td><td>chemioterapia zatwierdzona przez FDA</td></tr><tr><td>ViaStain AOPI Staining Solution</td><td>Revvity</td><td>CS2-0106</td><td>barwnik do liczenia żywych komórek</td></tr></tbody></table>

test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Colony-Forming Unit Assay Adapted For Patient-Derived Bone Marrow and Peripheral Blood Mononuclear Cells

Ocena jednostek tworzących kolonie (CFU) jest techniką podstawową do badania chorób hematologicznych, w tym zespołów mielodysplastycznych (MDS) i ostrej białaczki szpikowej (AML). Ta ocena wykorzystuje półsztywne podłoża uzupełnione o określone kombinacje cytokin w celu wsparcia trójwymiarowego wzrostu i różnicowania komórek prątkowo-progenitorowych krwiotwórczych i mieloidalnych. Jednak próbki krwi obwodowej i szpiku kostnego pobrane od pacjentów stanowią wyzwanie techniczne ze względu na obniżoną żywotność, zwiększoną wrażliwość na manipulacje oraz różnorodność wzrostu kolonii. Ponadto istniejące wytyczne dotyczące identyfikacji i liczenia kolonii wykazują znaczną różnorodność w definiowaniu wielkości kolonii i typów linii, co ogranicza powtarzalność między badaniami. Protokół opisany niżej jest zoptymalizowany pod kątem wzrostu i różnicowania komórek macierzystych i progenitorowych krwiotwórczych izolowanych od pacjentów z MDS i AML. Protokół podkreśla delikatne manipulowanie komórkami, sterylne przetwarzanie próbek pacjentów, zoptymalizowane warunki hodowli oraz okresy wzrostu dostosowane do komórek pochodzących od pacjentów. Ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla testów CFU wykorzystujących próbki pobrane od pacjentów i ustanawia standardową metrykę dla spójnego liczenia i analizy kolonii w badaniach nad złośliwymi chorobami krwi.

Rysunek 1 przedstawia schemat badania kolonii, od izolacji próbki pacjenta po analizę liczby i morfologii kolonii. Rysunek 2 prezentuje kluczowe ustawienia obrazowania kolonii pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Rysunek 3 oraz Rysunek 4 pokazują reprezentatywne obrazy tworzenia kolonii z pojedynczej próbki pochodzącej od pacjenta 13 dni po wysiewie. Na ...

Ten protokół opisuje procedurę indukowania różnicowania ludzkich komórek macierzystych i prądkotworzycznych krwiotwórczych pochodzących z szpiku kostnego pacjenta i komórek jednojądrzasty składnik krwi obwodowej. Test wykorzystuje półsztywne medium kulturowe wspierające zobowiązanie do linii erytrocytarnej i mieloidalnej oraz zawiera standaryzowane metryki umożliwiające reprodukowalną klasyfikację kolonii w celu charakteryzacji przedklinicznego leku.

Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

The colony-forming unit (CFU) assay is a foundational technique for studying hematologic diseases, including myelodysplastic syndromes (MDS) and acute ...

colony-forming-unit-assay-adapted-for-patient-derived-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek białaczkowych od szpiku kostnego chorych na białaczkę i analizy ich stanu metabolicznego. Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej może pomóc w lepszym scharakteryzowaniu zapotrzebowania na komórki pierwotne i może prowadzić do bardziej spersonalizowanej medycyny.

Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Albert Einstein College of Medicine.  This protocol outlines a procedure for inducing differentiation of human hematopoietic stem and progenitor cells derived from patient bone marrow and peripheral blood mononuclear cells. The assay uses a semisolid culture medium supporting erythroid and myeloid lineage commitment and incorporates standardized metrics for reproducible colony classification for preclinical drug characterization.

Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Przeglądaj więcej filmów