Name: Przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-07T15:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji białek błonowych w pęcherzykach polimerowych PDMS-g-PEO i hybrydowych LUV/GUV. Technika umożliwia tworzenie stabilnych systemów do zastosowań w biomedycynie i biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to przeprowadzono w ramach Max Planck School Matter to Life, wspierane przez Fundację Dieter Schwarz we współpracy z Towarzystwem Maxa Plancka. Jesteśmy wdzięczni Claudii Bednarz za izolację i oczyszczenie cytochromu bo3 oksydazy oraz Anne Christin Weinrich za pomoc w przygotowaniu wezykuł i mikroskopii.

<ol>
	<li>Maru&#353;i&#269; N, et al. Constructing artificial respiratory chain in polymer compartments: Insights into the interplay between bo3 oxidase and the membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(26):15006-17.</li>
	<li>Bermudez H, Brannan AK, Hammer DA, Bates FS, Discher DE. Molecular Weight Dependence of Polymersome Membrane Structure, Elasticity, and Stability. Macromolecules. 2002;35(21):8203-8.</li>
	<li>Otrin L, et al. Toward Artificial Mitochondrion: Mimicking Oxidative Phosphorylation in Polymer and Hybrid Membranes. Nano Lett. 2017;17(11):6816-21.</li>
	<li>Otrin L, et al. En route to dynamic life processes by SNARE-mediated fusion of polymer and hybrid membranes. Nat Commun. 2021;12(1):4972.</li>
	<li>Itel F, Najer A, Palivan CG, Meier W. Dynamics of Membrane Proteins within Synthetic Polymer Membranes with Large Hydrophobic Mismatch. Nano Lett. 2015;15(6):3871-8.</li>
	<li>Goers R, et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Commun Chem. 2018;1(1):35.</li>
	<li>Nardin C, Thoeni S, Widmer J, Winterhalter M, Meier W. Nanoreactors based on (polymerized) ABA-triblock copolymer vesicles. Chem Commun. 2000;(15):1433-4.</li>
	<li>Einfalt T, et al. Stimuli-Triggered Activity of Nanoreactors by Biomimetic Engineering Polymer Membranes. Nano Lett. 2015;15(11):7596-603.</li>
	<li>Ranquin A, Vers&#233;es W, Meier W, Steyaert J, Van Gelder P. Therapeutic Nanoreactors:&#8201; Combining Chemistry and Biology in a Novel Triblock Copolymer Drug Delivery System. Nano Lett. 2005;5(11):2220-4.</li>
	<li>Ihle S, et al. Nanocompartments with a pH release system based on an engineered OmpF channel protein. Soft Matter. 2011;7(2):532-9.</li>
	<li>Kumar M, et al. Highly permeable polymeric membranes based on the incorporation of the functional water channel protein Aquaporin Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(52):20719-20724.</li>
	<li>Choi HJ, Montemagno CD. Artificial Organelle: ATP Synthesis from Cellular Mimetic Polymersomes. Nano Lett. 2005;5(12):2538-42.</li>
	<li>Khan S,et al. Durable proteo-hybrid vesicles for the extended functional lifetime of membrane proteins in bionanotechnology. Chem Commun. 2016;52(73):11020-3.</li>
	<li>Kleineberg C, et al. Light-Driven ATP Regeneration in Diblock/Grafted Hybrid Vesicles. Chembiochem. 2020;21(15):2149-60.</li>
	<li>Otrin N, et al. Protein-Rich Rafts in Hybrid Polymer/Lipid Giant Unilamellar Vesicles. Biomacromolecules. 2024;25(2):778-91.</li>
	<li>Maru&#353;i&#269; N, et al. Increased efficiency of charge-mediated fusion in polymer/lipid hybrid membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(20):e2122468119.</li>
	<li>Maru&#353;i&#269; N,et al. Fusion-Induced Growth of Biomimetic Polymersomes: Behavior of Poly(dimethylsiloxane)-Poly(ethylene oxide) Vesicles in Saline Solutions Under High Agitation. Macromol Rapid Commun. 2022;43(5):2100712.</li>
	<li>Rigaud JL, Pitard B, Levy D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta. 1995;1231(3):223-46.</li>
	<li>Catania R,et al. Detergent-Free Functionalization of Hybrid Vesicles with Membrane Proteins Using SMALPs. Macromolecules. 2022;55(9):3415-22.</li>
	<li>Otrin L. Bottom-up construction of the artificial mitochondrion [dissertation]. Magdeburg: Otto-von-Guericke-University; 2021.</li>
	<li>Manneville JB, Bassereau P, Ramaswamy S, Prost J. Active membrane fluctuations studied by micropipet aspiration. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2001;64(2 Pt 1):021908.</li>
	<li>Dezi M, Di Cicco A, Bassereau P, L&#233;vy D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(18):7276-81.</li>
	<li>Sjoholm J, et al. The lateral distance between a proton pump and ATP synthase determines the ATP-synthesis rate. Sci Rep. 2017;7(1):2926.</li>
	<li>Biner O, Schick T, Muller Y, von Ballmoos C. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 2016;590(14):2051-62.</li>
	<li>Girard P,et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 2004;87(1):419-29.</li>
	<li>Nordlund G, Brzezinski P, von Ballmoos C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 2014;5(1):4303.</li>
	<li>Otrin N. A Modular Platform for Growth of Hybrid and Polymer Membrane Systems by Vesicle Fusion [dissertation]. Magdeburg: Otto-von-Guericke-University; 2022.</li>
	<li>Otrin L, et al. Artificial Organelles for Energy Regeneration. Adv Biosyst. 2019;3(6):1800323.</li>
	<li>Frericks HL, Zhou DH, Yap LL, Gennis RB, Rienstra CM. Magic-angle spinning solid-state NMR of a 144 kDa membrane protein complex: E. coli cytochrome bo3 oxidase. J Biomol NMR. 2006;36(1):55-71.</li>
	<li>Seneviratne R, et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. 2018;147:142-9.</li>
	<li>Aimon S,et al. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS One. 2011;6(10):e25529.</li>
	<li>Dolder N, M&#252;ller P, von Ballmoos C. Experimental platform for the functional investigation of membrane proteins in giant unilamellar vesicles. Soft Matter. 2022;18(31):5877-93.</li>
	<li>Zhao Z,et al. Super-Resolution Imaging of Highly Curved Membrane Structures in Giant Vesicles Encapsulating Molecular Condensates. AdvMater. 2022;34(4):2106633.</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Polimerosomy i hybrydowe pęcherzyki polimer/lipid wykazują zwiększoną stabilność chemiczną i mechaniczną w porównaniu z konwencjonalnymi pęcherzykami lipidowymi, co sprawia, że są bardzo atrakcyjne w zastosowaniach, począwszy od dostarczania leków i biosensorystyki, aż po nano- i mikroreaktory oraz sztuczne komórki. Jednak ich charakterystyczna architektura błony i właściwości biofizyczne często uniemożliwiają bezpośrednie przeniesienie protokołów zoptymalizowanych dla pęcherzyków lipidowych do systemów opartych na polim...

Kopolimery blokowe amfifilne mogą samoistnie łączyć się w roztworze wodnym w membrany, które spontanicznie krzywią się i zamykają na siebie, tworząc sferyczne, otoczone membranami przedziały zwane polimerozomami (polimerowymi pęcherzykami). W porównaniu z membranami lipidowymi, przedziały na bazie polimerów oferują większą chemiczną wszechstronność i zwiększoną stabilność chemiczną1 i mechaniczną2, co sprawia, że są bardzo atrakcyjne w zastosowaniach takich jak dostarczanie leków, nano- i mikreaktory oraz budowa trwałych sztucznych komórek. Zarówno nasza grupa, jak i inne, funkcjonalizowali membrany polimerowe poprzez wstawienie białek membranowych, aby stworzyć sztuczne organelle i komórki1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Polimery zawierające hydrofobowy rdzeń poli(dimetyloksylan) (PDMS) są szczególnie dobrze przystosowane do wbudowywania białek membranowych ze względu na wysoką elastyczność łańcucha i możliwość dostosowania hydrofobowej grubości membrany, aby lepiej dopasować się do domeny transbłonowej białka5. Podczas gdy nasze laboratorium koncentrowało się głównie na skopolimerze szczepionym poli(dimetyloksylan)-szczepiony-poli(tlenek etylenu) (PDMS-g-PEO), który tworzy wysoce dynamiczne membrany4,16,17, które są bardziej miękkie niż konwencjonalne dwuwarstwowce lipidowe i mają grubość około 5,3 nm1, inne grupy z powodzeniem stosowały skopolimery na bazie PDMS, takie jak PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA5,6,7,8,9,10,11 oraz PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz12 do rekonstytucji białek membranowych. Nawet stosunkowo sztywne skopolimery dwuwarstwowowe, takie jak PBD-b-PEO, szczególnie w systemach hybrydowych zmieszanych z lipidami, zostały wykorzystane do pomyślnej inkorporacji białek13. Te przykłady podkreślają wszechstronność membran na bazie polimerów jako platform rekonstytucyjnych, które mogą dodatkowo zapewnić zwiększoną stabilność chemiczną1 i wydłużony czas działania funkcjonalnego14 dla wkomponowanych białek membranowych. Chociaż hybrydowe membrany polimer/lipid nie zawsze mogą odpowiadać stabilności chemicznej czystych systemów polimerowych1, oferują atrakcyjny kompromis poprzez łączenie mechanicznej wytrzymałości polimerów z biologiczną istotnością lipidów. Prowadzi to do otoczenia membranowego, które bardziej naśladuje rodzime membrany biologiczne, zachowując jednocześnie kluczowe zalety materiałów syntetycznych. Takie hybrydowe architektury mogą oferować dodatkowe zalety, w tym zmniejszoną przenikalność dla protonów wynikającą z nanoskalowych przekształceń1 i formowanie domen wewnątrz membrany15.
Istnieje kilka technik rekonstytucji białek membranowych w nanoskalowych pęcherzykach (LUV), w tym rekonstytucja z otoczenia organicznego (np. odwrotna faza parowania, nawadnianie warstw lipid-białko), podejścia mechaniczne (np. sonikowanie, prasa francuska, mrożenie i rozmrażanie) oraz rekonstytucja z użyciem detergentów (poprzez usunięcie detergentu, rozcieńczenie lub bezpośrednie wkomponowanie)18, a także nowsze strategie, takie jak bezpośredni transfer z nanodysków kopolimeru styrenu i kwasu maleinowego19. Podczas gdy poriny zostały pomyślnie wkomponowano w polimerowe LUV poprzez bezpośrednie wstawienie, na przykład poprzez dodanie białka do warstwy polimerowej podczas nawadniania8. To podejście ogólnie prowadzi do niskiej wydajności wkomponowania dla większych lub bardziej złożonych białek membranowych i często prowadzi do losowej orientacji białka. W związku z tym rekonstytucja z użyciem detergentu, która polega na kontrolowanym dodaniu detergentu z następującym usunięciem, pozostaje najczęściej stosowaną metodą. Jest to również preferowana strategia wkomponowania większych białek membranowych w polimerowe LUV, szczególnie dla białek asymetrycznych, w których kontrolowana orientacja jest kluczowa dla funkcji. W tym podejściu membrany pęcherzyków są najpierw nasycone wybranym detergentem (koncentracja detergentu nasycającego oznaczana jest jako Rsat), częściowo solenizujące się (współistnienie pęcherzyków i miceli) lub całkowicie solenizujące, czyli rozkładające na micele (koncentracja detergentu oznaczana jest jako R<

<table><tbody><tr><td>&Auml;KTA pure&trade; chromatography system</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>18:1 Liss Rhod PE</td><td>Avanti Research</td><td>810150</td><td></td></tr><tr><td>8 well chambered coverglass</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC5030</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 643 NHS ester</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 643-31</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)</td><td>Serva</td><td>361-09-1</td><td></td></tr><tr><td>Coenzyme Q1</td><td>TargetMol</td><td>TGM-T19594</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope STELLARIS 5</td><td>Leica Microsystems</td><td>603810</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Fine Tip Ultra Micro Pastette</td><td>Pastette</td><td>LW4243</td><td></td></tr><tr><td>HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6358-69-6</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated glass slides (25&times;75&times;1.1 mm, &le;20 Ohm/sq.)</td><td>pgo</td><td>CEC020S</td><td></td></tr><tr><td>LAS X software</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge MCF-2360</td><td>LMS</td><td>24572</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extruder</td><td>Avanti Research</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm+P system</td><td>Hansatech Instruments</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner (benchtop)</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate membranes 0.1 &mu;m</td><td>Avanti Research</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>41161502</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)</td><td></td><td></td><td>laboratory-made, cut from silicone sheet</td></tr><tr><td>Soy PC (95%)</td><td>Avanti Research</td><td>441601</td><td></td></tr><tr><td>Specord 50 PLUS spectrophotometer</td><td>Analytik Jena</td><td>823-0200P-3</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column (column L &times; I.D. 30 cm &times; 10 mm)</td><td>Cytiva</td><td>28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Test tube shaker (2800 rpm)</td><td>IKA Lab Dancer</td><td>3365000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort 5355</td><td>Eppendorf</td><td>5355000.011</td><td></td></tr><tr><td>Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)</td><td>Dow Corning</td><td>000000000004109892</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych

Preparation of Membrane Protein&#8211;Functionalized Polymer and Polymer/Lipid Hybrid Large and Giant Unilamellar Vesicles

Wezykle utworzone z amfifilowych kopolimerów, samodzielnie lub zmieszane z fosfolipidami, oferują lepszą stabilność mechaniczną i chemiczną w porównaniu do konwencjonalnych wezykulipidowych. Czyni to je atrakcyjnym podwoziem, które można dalej rozwijać i rozszerzać, aby umożliwić konkretne zastosowania, takie jak dostarczanie leków, diagnostyczne bioczujniki, budowanie sztucznych komórek oraz bioinspirowane mikro- i nanoreaktory. W szczególności funkcjonalizacja poprzez włączenie białka błonowego jest niezbędna dla wielu z tych zastosowań. Przedstawiamy protokół przygotowywania białko-błonowych funkcjonalnych dużych jednobłonkowych wezykułów (LUVs) z kopolimeru przyszczepowego PDMS-g-PEO za pomocą rekonstytucji z mediatorem detergentowym. Ponadto opisujemy, jak te duże wezyki mogą być przekształcane w gigantyczne jednobłonkowe wezyki (GUVs) przy użyciu podejścia fuzyjno-elektroformacyjnego. Protokół obejmuje fluorescencyjne oznakowanie białek błonowych, przygotowanie polimerowych i hybrydowych LUVs, rekonstytucję białka błonowego, analizę rozkładu wielkości za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), ocenę aktywności białka za pomocą pomiarów zużycia tlenu, przygotowanie funkcjonalnych białkowo GUVs oraz analizę wstawiania białka i aktywności pompowania protonów w GUVs za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyniki reprezentatywne demonstrują tworzenie monodyspersyjnych proteo-LUVs o indeksie polidyspersyjności (PDI) poniżej 0,2 oraz pomyślne generowanie proteo-GUVs o średnicach od 5 do 35 µm. Aktywność białka potwierdzona jest pomiarami zużycia tlenu zarówno w polimerowych LUVs (18,2 nmol/min/mL), jak i hybrydowych LUVs (26,9 nmol/min/mL). Wstawianie białka do GUVs jest mierzone za pomocą intensywności fluorescencji, z wynikiem 20,6 ± 3,7 a.u. dla polimerowych GUVs i 26,2 ± 5,0 a.u. dla hybrydowych GUVs. Aktywność pompowania protonów w GUVs, monitorowana za pomocą uwięzionego pH-czułego barwnika, jest zgodna z funkcjonalnością białka, przy czym przeważa pompowanie protonów do wewnątrz. Mechaniczna miękkość kopolimeru i lipidowa grubość dwuwarstwy (~5,3 nm) wspierają efektywne wstawianie białka i zachowanie jego funkcjonalności.

Oksydaza cytochromowa bo3 z E. coli została wyekspresowana z plazmidu pETcyo w szczepie E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE i oczyszczona zgodnie z wcześniejszym opisem29. Oczyszczoną oksydazę bo3 wykorzystano bezpośrednio do rekonstytucji i pomiarów aktywności lub znakowano barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak ATTO 643 (niniejsze badanie) lub innymi barwnikami ATTO1,15. W przypadku bar...

Ten protokół demonstruje rekonstytucję z otoczenia detergentowego białka błonowego, cytochromu bo3 ubichinol oksydazy, do dużych unilamelarnych wezykuł zrobionych z PDMS-g-PEO i ich konwersję do gigantycznych wezykuł poprzez fuzję–elektroformację. Powstałe funkcjonalne przegrody oparte na polimerach są odpowiednie dla zaawansowanych badań biochemicznych i biofizycznych.

Przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych

Vesicles formed from amphiphilic copolymers, alone or blended with phospholipids, offer superior mechanical and chemical stability compared to ...

Our research focuses on building artificial cells from the bottom up, combining natural and synthetic materials to form fully functional biomimetic systems. Our protocol for building protein-functionalized polymer vesicles applies to drug delivery, construction of artificial cells, nanoreactors and biosensors.To begin, use positive-displacement pipettes with solvent-resistant tips or gas-tight glass syringes to transfer the polymer, lipid and fluorescent dye solutions dissolved in a 2-to-1 mixture of chloroform and methanol into a clean glass vial. Mix the solution thoroughly by gentle vortexing while holding the glass vial upright to ensure homogeneity. Evaporate the organic solvents under a gentle stream of nitrogen in the fume hood for approximately one hour, until a uniform thin film forms on the glass vial wall. If polymersomes are used for reconstitution, supplement the rehydration buffer with 0.1% sodium cholate, then rehydrate the dried film with 1 milliliter of rehydration buffer to obtain a final amphiphile concentration of 5mg/ml. Vortex the glass vial vigorously until the film is completely detached and suspended, forming multilamellar vesicles. Subject the hybrid multi

preparation-membrane-proteinfunctionalized-polymer-polymerlipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Celem protokołu jest przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka metodą hydrolizy alkaliczno-enzymatycznej oraz sprawdzenie, czy dodanie hydrolizatu keratyny do bazy maści kosmetycznej poprawia funkcję bariery skórnej (zwiększając nawilżenie i zmniejszając przeznaskórkową utratę wody). Testy przeprowadza się na ochotnikach i ochotniczkach.

Przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka i jego zastosowanie w kosmetyce

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisano krok po kroku procedurę bezznacznikowego unieruchamiania egzosomów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek płynnych oraz ich obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Obrazy AFM służą do oszacowania wielkości pęcherzyków w roztworze i scharakteryzowania innych właściwości biofizycznych.

Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Poznaj metodę rekonstytucji białek błonowych w pęcherzykach polimerowych PDMS-g-PEO i hybrydowych LUV/GUV. Technika umożliwia tworzenie stabilnych systemów do zastosowań w biomedycynie i biologii syntetycznej.

Przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych

Przeglądaj więcej filmów