Name: Bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów. Te metody umożliwiają analizę zmian morfologicznych w odpowiedzi na czynniki międzygatunkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez stypendium DBT-Wellcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/19/1/504294) przyznane RNP. KBSS otrzymał wsparcie z Ahmedabad University Special Research Grant (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) oraz SERB-Core Research Grant (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27). Ikony użyte na Rysunku 1 zostały dostosowane z Servier Medical Art (https://smart.servier.com/), licencjonowane na podstawie CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), oraz z BioArt Source, NIAID, NIH.

<ol>
	<li>Peleg AY, Hogan DA, Mylonakis E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat Rev Microbiol. 2010;8(5):340-349.</li>
	<li>Waters CM, Bassler BL. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005;21:319-346.</li>
	<li>Foster KR, Bell T. Competition, not cooperation, dominates interactions among culturable microbial species. Curr Biol. 2012;22(19):1845-1850.</li>
	<li>Carolus H, Van Dyck K, Van Dijck P. Candida albicans and Staphylococcus species: a threatening twosome. Front Microbiol. 2019;10:2162.</li>
	<li>Pasman R, et al. Candida albicans and Staphylococcus aureus reciprocally promote their virulence factor secretion and pro-inflammatory effects. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1629373.</li>
	<li>Grandcl&#233;ment C, Tanni&#232;res M, Mor&#233;ra S, Dessaux Y, Faure D. Quorum quenching: role in nature and applied developments. FEMS Microbiol Rev. 2016;40(1):86-116.</li>
	<li>Goers L, Freemont P, Polizzi KM. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J R Soc Interface. 2014;11(96):20140065.</li>
	<li>Burmeister A, Gr&#252;nberger A. Microfluidic cultivation and analysis tools for interaction studies of microbial co-cultures. Curr Opin Biotechnol. 2020;62:106-115.</li>
	<li>Kapoore RV, Padmaperuma G, Maneein S, Vaidyanathan S. Co-culturing microbial consortia: approaches for applications in biomanufacturing and bioprocessing. Crit Rev Biotechnol. 2022;42(1):46-72.</li>
	<li>Kalluri R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):582-598.</li>
	<li>Deveau A, et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiol Rev. 2018;42(3):335-352.</li>
	<li>Temkin MI, Carlson CM, Stubbendieck AL, Currie CR, Stubbendieck RM. High throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions. J Vis Exp. 2019;(152). doi:10.3791/60275.</li>
	<li>Cecchelli R, et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 2014;9(6):e99733.</li>
	<li>Wodzanowski KA, Cassel SE, Grimes CL, Kloxin AM. Tools for probing host-bacteria interactions in the gut microenvironment: from molecular to cellular levels. Bioorg Med Chem Lett. 2020;30(10):127116.</li>
	<li>Luo Y, McAuley DF, Fulton CR, Pessoa JS, McMullan R, Lundy FT. Targeting Candida albicans in dual-species biofilms with antifungal treatment reduces Staphylococcus aureus and MRSA in vitro. PLoS One. 2021;16(4):e0249547.</li>
	<li>Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Transwell in vitro cell migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.</li>
	<li>McCarty NS, Ledesma-Amaro R. Synthetic biology tools to engineer microbial communities for biotechnology. Trends Biotechnol. 2019;37(2):181-197.</li>
	<li>Virgo M, Mostowy S, Ho BT. Emerging models to study competitive interactions within bacterial communities. Trends Microbiol. 2025;33(6):688-700.</li>
	<li>Moutinho TJ, Panagides JC, Biggs MB, Medlock GL, Kolling GL, Papin JA. Novel co-culture plate enables growth dynamic-based assessment of contact-independent microbial interactions. PLoS One. 2017;12(8):e0182163.</li>
	<li>Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 2008;103(11):1204-1219.</li>
	<li>Hogan DA, Vik &#197;, Kolter R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 2004;54(5):1212-1223.</li>
	<li>Poon Y, Hui M. Inhibitory effect of lactobacilli supernatants on biofilm and filamentation of Candida albicans, Candida tropicalis, and Candida parapsilosis. Front Microbiol. 2023;14. doi:10.3389/fmicb.2023.1105949.</li>
	<li>Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668.</li>
	<li>Huh D, et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 2013;8(11):2135-2157.</li>
	<li>Bhatia SN, Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 2014;32(8):760-772.</li>
	<li>Itani A, Shida Y, Ogasawara W. A microfluidic device for simultaneous detection of enzyme secretion and elongation of a single hypha. Front Microbiol. 2023;14:1125760.</li>
	<li>Beneyton T, Thomas S, Griffiths AD, Nicaud JM, Drevelle A, Rossignol T. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microb Cell Fact. 2017;16:18.</li>
	<li>Xu XL, et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host Microbe. 2008;4(1):28-39.</li>
	<li>Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) medium (liquid or solid). Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(8):pdb.rec090563.</li>
	<li>Parnandi VA, Trivedi PM, Panchal H, Suryawanshi G, Patkar RN. A small Candida glabrata protein promotes hyphal growth in C. albicans during mixed-species invasive candidiasis. Curr Biol. 2026;36(1):1-15.e9.</li>
	<li>Davis-Hanna A, Piispanen AE, Stateva LI, Hogan DA. Farnesol and dodecanol effects on the Candida albicans Ras1-cAMP signalling pathway and the regulation of morphogenesis. Mol Microbiol. 2008;67(1):47-62.</li>
	<li>Polke M, et al. A functional link between hyphal maintenance and quorum sensing in Candida albicans. Mol Microbiol. 2017;103(4):595-617.</li>
	<li>Su C, Yu J, Sun Q, Liu Q, Lu Y. Hyphal induction under the condition without inoculation in Candida albicans is triggered by Brg1-mediated removal of NRG1 inhibition. Mol Microbiol. 2018;108(4):410-423.</li>
	<li>Senesi N, Wilkinson KJ. Biophysical Chemistry of Fractal Structures and Processes in Environmental Systems. Chichester: John Wiley &#38; Sons; 2008: ISBN: 978-0-470-01474-5.</li>
	<li>Bayry J, Aimanianda V, Guijarro JI, Sunde M, Latg&#233; JP. Hydrophobins&#8212;unique fungal proteins. PLoS Pathog. 2012;8(5):e1002700.</li>
	<li>Ojkic N, Serbanescu D, Banerjee S. Surface-to-volume scaling and aspect ratio preservation in rod-shaped bacteria. eLife. 2019;8:e47033.</li>
	<li>Li X, de Souza RA, Heinemann M. The rate of glucose metabolism sets the cell morphology across yeast strains and species. Curr Biol. 2025;35(4):788-798.e4.</li>
	<li>Mochizuki S, Minami E, Nishizawa Y. Live-cell imaging of rice cytological changes reveals the importance of host vacuole maintenance for biotrophic invasion by blast fungus, Magnaporthe oryzae. MicrobiologyOpen. 2015;4(6):952-966.</li>
	<li>Fernandez J, Orth K. Rise of a cereal killer: the biology of Magnaporthe oryzae biotrophic growth. Trends Microbiol. 2018;26(7):582-597.</li>
	<li>Wengler MR, Talbot NJ. Mechanisms of regulated cell death during plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Cell Death Differ. 2025;32(5):793-801.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konkurencyjne lub sprzeczne interesy.

Poprzedni raport, w którym wykorzystano płytkę z wkładkami membranowymi oraz test oparty na CFS, wykazał, że C. albicans rozwija strzępki w odpowiedzi na komórki C. glabrata lub ich CFS. Odpowiedź ta nie była jednak indukowana przez inne drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae i Candida dubliniensis30. Co więcej, reakcja strzępkowa nie była ograniczona wyłącznie do laboratoryjnego szczepu referencyjnego C. albicans SC5314, lecz wystąpiła również w innych tła genomicznych, w tym w izolacie klinicznym WUM5A30. W niniejszym protokole, w oparciu o te odkrycia, opracowano zstandaryzowany schemat postępowania w celu ilościowego określenia trzech parametrów morfologicznych: długości strzępek, objętości strzępek oraz grubości strzępek. Ponadto czynniki morfologiczne te zostały wykorzystane do oceny, w jaki sposób zmienność ploidalności i status locus typu kojarzenia wpływają na charakterystykę morfologiczną C. albicans w odpowiedzi na wydzielaną cząsteczkę induktora.
Opisane tutaj metody bezkontaktowe zapewniają prostą strukturę eksperymentalną do wizualizacji i analizy efektów morfometrycznych rozpuszczalnych sygnałów komunikacyjnych międzygatunkowych. Podczas gdy płytka z wkładkami membranowymi umożliwia dwukierunkową dyfuzję między aktywnymi kulturami, test oparty na CFS zapewnia skalowalny format, ponieważ wymagane komponenty indukcyjne są pozyskiwane niezależnie od docelowej kultury. W celu zapewnienia spójności testu w układzie z płytką z wkładkami membranowymi wymagane jest utrzymanie stosunku około 1:50 (C. albicans do C. glabrata). Taki gradient stężeń zapewnia odpowiedni strumień rozpuszczalnych cząsteczek indukcyjnych przez barierę membranową, pozostając jednocześnie poniżej progów akumulacji endogennych inhibitorów quorum sensing, takich jak farnezol, który może hamować kinetykę filamentacji C. albicans31,32. Podobnie, krytycznym etapem w teście opartym na CFS jest 18-godzinny okres inkubacji, niezbędny do tego, aby kultura wyjściowa C. glabrata jednolicie osiągnęła późną fazę stacjonarną wzrostu. Jeśli okres inkubacji kultury C. glabrata jest krótszy niż 12 h lub dłuższy niż 24 h, pozyskany CFS z mniejszym prawdopodobieństwem będzie posiadał optymalne stężenie badanej tutaj specyficznej cząsteczki induktora, co prowadzi do suboptimalnej indukcji strzępek. Odpowiedni stopień wzrostu do pozyskania CFS lub stosunek kultur musi zostać wystandaryzowany dla każdego nowego celu eksperymentalnego i/lub nowych kombinacji gatunków drobnoustrojów.
Aby zmaksymalizować powtarzalność testu w różnych warunkach laboratoryjnych, zaleca się następujące kluczowe ulepszenia proceduralne. Do nocnej hodowli wszystkich diploidalnych szczepów C. albicans zaleca się stosowanie minimalnego podłoża glukozowego (GMM). Stosowanie GMM hamuje tło autofilamentacji często obserwowane w bogatym w składniki odżywcze podłożu YPD. Taka autofilamentacja została zaobserwowana również w innych badaniach, choć mechanizm leżący u jej podstaw pozostaje niejasny33. Zaleca się również całkowite fizyczne usunięcie wkładki z membrany poliwęglanowej przed akwizycją obrazu, aby wyeliminować rozpraszanie światła i aberracje optyczne, które mogą zakłócać obrazowanie podczas mikroskopii w polu jasnym przy dużym powiększeniu.
Choć te konfiguracje bezkontaktowe pomagają w oddzieleniu roli rozpuszczalnych komponentów sygnałowych, wiążą się one ze specyficznymi trudnościami eksperymentalnymi. Na przykład testy bezkontaktowe są podatne na niewielkie ryzyka, takie jak przerwanie membrany w wyniku niewłaściwej obsługi, a tym samym na przenikanie drobnoustrojów. Należy zatem zachować ostrożność podczas pozycjonowania końcówek pipet, dbając o to, aby podczas pobierania próbek końcówki dotykały ścianek komór wkładek, a nie membrany. Ponadto do fizycznej kontaminacji krzyżowej między przedziałami może dojść z powodu niewłaściwego (zbyt dużego) rozmiaru porów, co można łatwo rozwiązać, stosując wkładki z membraną o odpowiedniej wielkości porów. Nadmierny wzrost grzybów lub rozległe osadzanie się biofilmu mogą pokryć porowatą membranę. Problem ten rozwiązuje się poprzez ograniczenie początkowych inokulacji do OD600 = 0.1 i nieprzekraczanie czasu inkubacji powyżej 12 h. Dodatkowo mikroby mogą nie rozkładać się homogenicznie w dołkach urządzenia, często skupiając się lub przywierając w pobliżu membrany, co może prowadzić do nieoczekiwanych błędów w pomiarach gęstości optycznej. Co więcej, ponieważ systemy te fizycznie oddzielają dwie populacje, nie mogą one odtworzyć ani ocenić oddziaływań zależnych od bezpośredniego kontaktu fizycznego komórka-komórka. Przykładem są: dojrzewanie biofilmu wielogatunkowego, mechaniczna koagregacja lub sygnalizacja napędzana przez zakotwiczone na powierzchni adhezyny ściany komórkowej. Choć te testy płytkowe zapewniają skuteczny obraz końcowy wczesnej kinetyki filamentacji (w 3 h), nie oddają one długoterminowej dynamiki wzrostu ani zachowania przestrzennego. Dla badaczy wymagających ciągłego śledzenia w czasie rzeczywistym przez dłuższe okresy, bardziej odpowiednią alternatywą mogą być specjalistyczne mikrofluidyczne kanały perfuzyjne lub zautomatyzowane komory do obrazowania żywych komórek.
Geometria komórki jest fundamentalnie powiązana z wydajnością metaboliczną, przy czym stosunek powierzchni do objętości (SA/V) stanowi kluczowy czynnik determinujący pobieranie składników odżywczych i transport wewnątrzkomórkowy. U grzybów dimorficznych i nitkowatych przejście w wydłużony morfotyp strzępkowy funkcjonuje jako adaptacja strukturalna mająca na celu utrzymanie zoptymalizowanego stosunku SA/V. Pozwala to na rozproszone wchłanianie składników odżywczych wzdłuż rozciągniętej ściany strzępki przy jednoczesnym podtrzymaniu procesów metabolicznych skierowanych w stronę wierzchołka strzępki34,35,36,37. Jednak nasze badanie pokazuje, że skalowanie morfometryczne nie jest jednolicie proporcjonalne w różnych stanach ploidii i konfiguracjach loci typu zapłodnienia.
Zbiory danych morfometrycznych wygenerowane via niniejszy protokół śledzenia ujawniają wyraźne trendy skalowania strukturalnego skorelowane z ploidią, przy czym linie haploidalne konsekwentnie wykazują mniejsze wartości bezwzględne we wszystkich metrykach geometrycznych niż odpowiadające im szczepy diploidalne (Rysunek 5). W obrębie tła diploidalnego konfiguracja homozygotyczna MATα/α wykazała przyspieszoną kinetykę filamentacji (długość i objętość) w porównaniu do szczepów MATa/a lub MATa/α w tych warunkach in vitro. Biorąc pod uwagę, że nasilona filamentacja jest często powiązana ze zwiększoną zdolnością penetracji, nie jest jasne, dlaczego izolaty kliniczne C. albicans są izolowane głównie jako diploidy heterozygotyczne (MATa/α). Jest możliwe, że w organizmie gospodarza o sprawnej odporności stan heterozygotyczny zapewnia szerszą przewagę adaptacyjną w kontekście długotrwałej kolonizacji komensalnej. Innymi słowy, cechy strukturalne morfotypu MATa/α są zoptymalizowane pod kątem przetrwania w obliczu nadzoru immunologicznego gospodarza. Dlatego przyszłe badania powinny wykorzystać te zestandaryzowane systemy kokultury do systematycznej oceny porównawczej przystosowania różnych homozygot typów kojarzenia pod wpływem zróżnicowanych presji selekcyjnych.
Poprzednie badania wykazały, że morfologia wakuol, dynamika podziału i łączenia oraz ekspansja strukturalna odgrywają istotną rolę w regulacji objętości wewnętrznej i turgoru wydłużających się filamentów grzybni. Na przykład u patogenu wywołującego zarazę ryżu Magnaporthe oryzaewyraźne przejścia między smukłymi strzępkami wegetatywnymi a cebulowatymi strukturami inwazyjnymi są ściśle skoordynowane ze zmianami w organizacji wakuol38,39,40Jednakże obecny protokół nie monitorował bezpośrednio dynamiki wakuolar podczas C. albicans filamentację, śledzenie tych zmian w obrębie organelli w odniesieniu do całkowitej objętości strukturalnej stanowi obiecujący kierunek przyszłych badań. Ponadto niezbędne są dalsze analizy w celu ustalenia, dlaczego konkretne komponenty sekretomu pochodzenia grzybowego indukują inną kinetykę skalowania morfologicznego niż chemiczne induktory pochodzenia gospodarza, takie jak surowica.
Metody bezkontaktowej kokultury opisane w niniejszym protokole mogą zostać zaadaptowane do badania interakcji międzygatunkowych i międzykrólestwami, takich jak dynamika sygnalizacji między oportunistycznymi populacjami bakterii a grzybami dimorficznymi. Ponadto, ze względu na skalowalność formatów 96- i 24-dołkowych, ta platforma ilościowa może być wykorzystywana do przesiewów chemicznych. Przykładami takich zastosowań jest identyfikacja małocząsteczkowych inhibitorów lub nowych związków przeciwgrzybiczych w celu selektywnego zaburzenia szlaków filamentacji stymulowanej przez sekretom, bez bezpośredniego wpływu na podstawową żywotność komórek.

W ekosystemach naturalnych i klinicznych mikroorganizmy zazwyczaj bytują w obrębie ustrukturyzowanych społeczności polimikrobowych, którymi rządzą złożone sieci komunikacji wewnątrz- i&#160;międzygatunkowej&#160;1. Konsorcja te wykorzystują różnorodne sygnały chemiczne, w tym cząsteczki quorum sensing, lotne związki organiczne oraz wydzielane peptydy i białka, aby koordynować zachowania na poziomie populacyjnym2. Mapowanie tej dynamiki komunikacyjnej jest kluczowe, ponieważ kooperacyjne, konkurencyjne lub drapieżne interakcje niszowe znacząco zmieniają metabolizm mikrobów, architekturę przestrzenną oraz adaptację do stresu3. W warunkach klinicznych sieci polimikrobowe (takie jak dwugatunkowe konsorcja bakteryjno-grzybowe lub międzygatunkowe konsorcja grzybowe) często wykazują synergistyczną wirulencję, przyspieszoną kolonizację tkanek i podwyższoną oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu do monokultur4,5. Rozszyfrowanie molekularnych determinantów komunikacji mikrobiologicznej jest zatem niezbędne, aby wyjść poza tradycyjne modele i opracować innowacyjne strategie przeciwinfekcyjne mające na celu zaburzenie stabilności społeczności6.
Aby przeanalizować odrębne tryby komunikacji mikrobiologicznej, badacze wykorzystują różnorodne konfiguracje eksperymentalne, stosowane głównie w biologii komórki ssaków, immunologii i onkologii7,8,9. Na przykład modele kokultur z bezpośrednim kontaktem stanowią standard w badaniu sygnalizacji &#160;jukstakrynowej&#160;oraz fizycznych oddziaływań międzykomórkowych10. Podobne układy z modyfikacjami są również stosowane do badania fizycznych interakcji między mikrobami, co pozwala zrozumieć wzajemne hamowanie mikrobiologiczne lub odpowiedź na leki9,11,12. Trudno jest jednak rozróżnić mechanizmy leżące u podstaw tych zjawisk, ponieważ zarówno sygnały zależne od kontaktu, jak i sygnały dyfundujące przyczyniają się do obserwowanej odpowiedzi. Choć tradycyjne testy oparte na kontakcie mogą dostarczać informacji przestrzennych, są one pracochłonne i/lub wymagają odrębnego znakowania szczepów, co może być uciążliwe w przypadku organizmów niemodelowych. Z kolei testy Transwell (płytki z wkładkami membranowymi) są stosowane, głównie w badaniach nad ssakami, aby rozróżnić wkład sygnałów zależnych od kontaktu i dyfundujących13,14,15,16. Metoda ta jest szczególnie użyteczna, gdy komunikacja komórkowa jest zapośredniczona przez cząsteczki wydzielane, co umożliwia analizę dynamiki sygnalizacji między populacjami komórek w czasie rzeczywistym17. Ponadto testy bezkontaktowe oferują zaletę separacji membranowej, która może być zintegrowana z modelami obliczeniowymi w celu dynamicznego śledzenia mikrobów, których tradycyjne metody nie wykrywają18. Podejście to jest sporadycznie wykorzystywane do jednoczesnego badania kinetyki rozwojowej różnych gatunków bakterii19.
Tańszą, wysokoprzepustową alternatywą dla testu z użyciem płytki wielodołkowej z wkładkami membranowymi jest test oparty na nadsączu bezkomórkowym (CFS) lub pożywce warunkującej. Metoda ta jest znana z zastosowań w medycynie regeneracyjnej i biologii naczyniowej w celu izolacji sekretomów niezbędnych do zrozumienia naprawy tkanek pośredniczonej przez komórki macierzyste i/lub angiogenezy indukowanej przez nowotwór20. Podobnie w badaniach mikrobiologicznych systemy CFS okazały się przydatne w analizie konkurencji polimikrobowej. Na przykład filtraty bakteryjne (takie jak&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;acyl-homoserynowe laktony lub&#160;Lactobacillus&#160;metabolity) były wykorzystywane do modulacji dojrzewania biofilmu grzybowego21,22.&#160;W ostatnim czasie platformy mikroprzepływowe umożliwiły wierną biomimikrę fizjologiczną dzięki technologiom organów na chipie (organ-on-a-chip)23,24. Chociaż systemy mikroprzepływowe wdrożono do jednoczesnego wykrywania odpowiedzi społeczności mikrobiologicznej na ich sekretomy, wymagają one specjalistycznej aparatury i wiedzy i nie mogą być łatwo zaimplementowane we wszystkich warunkach25,26,27. Zatem testy z użyciem płytek wielodołkowych z wkładkami membranowymi oraz testy oparte na CFS wydają się być metodami pierwszego wyboru w większości przypadków. Wybór między tymi dwoma testami zależy od natury cząsteczki wydzielniczej. Jeśli cząsteczka wydzielnicza jest niestabilna, t.j. ma krótki okres półtrwania i wymaga pomiaru aktywności w czasie rzeczywistym, bardziej odpowiedni jest test z użyciem płytki wielodołkowej z wkładkami membranowymi. Z drugiej strony, jeśli cząsteczka wydzielnicza jest stabilna, a eksperyment prowadzony jest na dużą skalę, bardziej ekonomiczny będzie test oparty na CFS.
Głównym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie krok po kroku metodologii śledzenia jakościowego i ilościowego do oceny cech morfologicznych z wykorzystaniem płytek wielodołkowych z wkładkami membranowymi oraz platform CFS (Rysunek 1). W niniejszym opracowaniu zaprezentowano to na przykładzie komunikacji sterowanej czynnikami wydzielniczymi między Candida albicans a Candida glabrata. Ponadto narzędzia te mogą służyć do ilościowego określenia wpływu wewnętrznych zmiennych genetycznych (ploidalności i statusu locus sprzężonego z typem strzępkowania) na zmiany w absolutnym rozwoju geometrycznym (długości, objętości i średnicy) filamentów &#160;C. albicans&#160;pod wpływem ekspozycji na sygnałowe cząsteczki wydzielnicze. Ten ugruntowany protokół zapewnia prostą i przystępną cenowo platformę bezkontaktową, odpowiednią do badania dynamiki sygnalizacji międzygatunkowej.

<table><tbody><tr><td>Filtr strzykawkowy PES 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 24-well Carrier Plate z wkładkami do hodowli komórkowej (0.4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96 Well Multidish, traktowany do hodowli komórkowej, płaskie dno</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Pepton proteozowy</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base, z siarczanem amonu, bez aminokwasów</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

Zachowanie i morfologia komórek w społeczności mikrobowej są zazwyczaj pod wpływem różnych czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Różne podejścia dostępne do badania komunikacji mikrobowej mogą być żmudne i/lub wymagać specjalistycznego zaplecza oraz wiedzy.&#160;W niniejszej pracy opisano dwa komplementarne bezkontaktowe podejścia do kokultury: test kokultury z wykorzystaniem wkładki membranowej w płytce wielodołkowej oraz test oparty na nienasyconym supernatancie (CFS), które bazują na transformacji morfologicznej jako mierzalnej odpowiedzi w celu zbadania roli różnych czynników w danej interakcji międzygatunkowej. System z wkładką membranową, umożliwiając dyfuzję cząsteczek zewnątrzkomórkowych, pozwala na interakcję w czasie rzeczywistym między gatunkami oddzielonymi fizycznie. W porównaniu do niego, test oparty na CFS stanowi uproszczone, skalowalne podejście do oceny odpowiedzi na pożywki kondycjonowane. Przedstawiony tutaj protokół obejmuje zestandaryzowane procedury przygotowania kultur, otrzymywania kondycjonowanych supernatantów, konfiguracji testu, mikroskopii, pozyskiwania obrazów, ilościowej analizy morfometrycznej z użyciem programu Fiji oraz ewaluacji statystycznej. Zostało to zademonstrowane na przykładzie morfologicznej odpowiedzi grzybów na czynniki wewnętrzne i zewnętrzne. Zaprezentowane metody oferują dostępne i adaptowalne, alternatywne narzędzia do badania nowych interakcji mikrobowych w społeczności i mogą być łatwo rozszerzone w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw współistnienia wielu gatunków w obrębie jednej społeczności.

Bezkontaktowe testy kokultury do badania oddziaływań międzygatunkowych
Rozpuszczalne, występujące w niskim stężeniu pozakomórkowe cząsteczki sygnałowe często pośredniczą w kluczowych zdarzeniach komunikacyjnych podczas mieszanego współbytowania drobnoustrojów. Dynamikę tę oceniono przy użyciu dwóch bezkontaktowych układów opartych na komórkach, zaprojektowanych w celu analizy wzorców interakcji między C. albicans a C. glabrata, przy jednoczesnym zapobieganiu bezpośredniemu fizycznemu kontaktowi między komórkami. W pierwszej konfiguracji wykorzystano zintegrowany system hodowli w płytkach z wkładkami membranowymi, w którym dwie populacje były fizycznie rozdzielone obojętną, porowatą membraną z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,4 µm, co umożliwiało swobodną, dwukierunkową dyfuzję wydzielanych cząsteczek przez barierę. W drugim układzie monitorowano wzrost komórek drożdżowych C. albicans hodowanych bezpośrednio w płytkach mikrotitracyjnych zawierających bezkomórkowy nadsącz pozyskany z kultur C. glabrata w fazie stacjonarnej (CgCFS).
Zgodnie z poprzednimi przesiewami30, diploidalne heterozygotyczne komórki C. albicans typu dzikiego (SC5314) łatwo rozwijały prawdziwe strzępki w odpowiedzi na komórki C. glabrata oddzielone barierą w postaci wkładki membranowej lub na przefiltrowany CgCFS. Natomiast komórki utrzymywane w czystym medium kontrolnym negatywnym (GMM lub YPD) pozostawały głównie w formie pączkującej i pseudostrzępkowej (Rysunek 2A). Analizy porównawcze wykazały spójność między dwoma układami testowymi. Oba testy dały porównywalne wartości we wszystkich parametrach strukturalnych, w tym w długości, objętości i grubości strzępek (Rysunek 2). Różnicę w parametrach morfologicznych uznano za istotną, jeśli wartość p z odpowiednich testów statystycznych, a następnie testów post-hoc dla porównań wielokrotnych, spełniała kryterium 0,05. Obserwacje te wykazały, że u komórek C. albicans nie wystąpiła istotna różnica w długości prawdziwych strzępek indukowanych przez komórki C. glabrata w układzie z płytką z wkładką membranową (39,66 µm ± 6,81 µm) oraz w przypadku ekspozycji na przefiltrowany CgCFS (37,13 µm ± 6,50 µm; Rysunek 2B). Podobnie, objętości tych indukowanych filamentów w systemie z płytką z wkładką membranową (112,10 µm3± 22,59 µm3) również nie różniły się istotnie od tych w medium kondycjonowanym CgCFS (109,78 µm3± 34,69 µm3; Rysunek 2C). Ponadto pomiary średnicy strzępek potwierdziły, że średnia grubość strzępek pozostała spójna w obu układach, osiągając wartości 1,89 ± 0,10 µm dla konfiguracji z płytką z wkładką membranową i 1,92 µm ± 0,23 µm dla traktowania CgCFS (Rysunek 2D).
Stany ploidalności i konfiguracje typu kojarzenia zmieniają wymiary morfologiczne in vitro
Role poziomu ploidalności oraz architektury locus mating w kierowaniu przejściami dimorficznymi została ustalona w różnych grzybowych systemach modelowych. W niniejszej pracy zastosowano analityczny potok śledzenia w celu ilościowego określenia parametrów filamentacji, a konkretnie długości strzępek, objętości strukturalnej, grubości oraz odpowiadającej im objętości macierzystej komórki drożdżowej, w panelu haploidalnych (MATa lub MATα) i diploidalnych (MATa/a, MATα/α lub MATa/α) szczepów C. albicans.
Profilowanie strukturalne wykazało, że po ekspozycji na indukcyjny sekretom CgCFS lub pozytywną kontrolę surowiczą, diploidalny szczep alfa homozygotyczny (MATα/α) tworzył filamenty o znacznie dłuższych osiach (45.56 µm ± 9.24 µm oraz 46.62 µm ± 9.07 µm) i większej objętości (125.24 µm3 ± 39.94 µm3 oraz 119.45 µm3 ± 37.32 µm3) w porównaniu do diploidalnego szczepu MATa/a homozygotycznego (Rysunek 3A,C). Choć standardowe izolaty kliniczne C. albicans występują głównie jako diploidy heterozygotyczne, referencyjny szczep MATa/α wykazywał dłuższe filamenty i większe objętości w stosunku do szczepu MATa/a po indukcji (szczególnie surowicą). Były one jednak znacznie mniejsze niż w przypadku homozygotycznego szczepu MATα/α (Rysunek 3B,D).
Jednocześnie szczepy haploidalne wykazały odwrotny wzorzec, w którym haploidalny szczep MATa wykazał istotny wzrost długości strzępek w porównaniu ze szczepem haploidalnym MATα w obu warunkach indukcji (CgCFS: 22,06 µm ± 5,41 µm w stosunku do 17,58 µm ± 4,12 µm; Serum: 23,71 µm ± 6,59 µm w stosunku do 21,00 µm ± 5,29 µm; Rycina 4A). Co ciekawe, ten wzrost długości w tle haploidalnym przełożył się na zwiększenie objętości strzępek (38,84 µm3 ± 19,58 µm3 w stosunku do 34,25 µm3 ± 19,62 µm3) wyłącznie w odpowiedzi na CgCFS (Rycina 4B). Te wstępne pomiary in vitro sugerują złożoną interakcję między stanami ploidalności a konfiguracjami loci typu mating, co wskazuje, że loci MATa i MATα prawdopodobnie w różny sposób wpływają na dynamikę filamentacji.
W celu zbadania zależności statystycznych między tymi parametrami strukturalnymi w połączonych zbiorach danych przeprowadzono analizy korelacji rang Spearmana (ρ) oraz liniowej regresji Pearsona (R2), obejmujące wszystkie badane warianty ploidii i typów kopulacyjnych. Pozytywne korelacje zaobserwowano dla wszystkich analizowanych par: długość strzępni względem objętości strzępni, długość strzępni względem grubości strzępni, długość strzępni względem objętości komórki macierzystej oraz całkowita objętość strzępni względem objętości macierzystej komórki drożdżowej (Rycina 5, Tabela uzupełniająca 1 oraz Tabela uzupełniająca 2).
Najsilniejszy związek zaobserwowano pomiędzy długością strzępki a obliczoną objętością strzępki (ρ = 0,91; Rysunek 5A). Z kolei najsłabsza korelacja występowała pomiędzy początkową objętością macierzystej komórki drożdży a objętością wyrastającej strzępki (ρ = 0,63; Rysunek 5C). Ponadto grubość strzępki nie korelowała z jej długością tak silnie, jak robiła to objętość strzępki (Rysunek 5A,D). Objętość komórki macierzystej, długość strzępki oraz grubość strzępki nie wykazywały statystycznie istotnych różnic w swoich korelacjach (Rysunek 5B,D). Te rozkłady geometryczne sugerują, że większa początkowa objętość macierzystej komórki drożdży nie musi skutkować powstaniem dłuższych strzępek lub większej objętości.
Podsumowując, wyniki te demonstrują użyteczność zarówno płytki z wkładkami membranowymi, jak i testów opartych na CFS w wizualizacji i kwantyfikacji wariacji morfogenetycznych u C. albicans bez kontaktu fizycznego. Dane uzyskane przy użyciu tego protokołu ujawniają różne cechy morfologiczne w zależności od ploidii oraz konfiguracji typu kojarzenia. Te bezkontaktowe konfiguracje testowe oferują elastyczną i skalowalną metodologię, którą można dostosować do badania dynamiki sygnalizacji międzygatunkowej w różnych kombinacjach mikrobiologicznych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja kokultury w płytce z wkładkami membranowymi oraz testów indukcji strzępek opartych na CFS z gatunkami Candida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Porównanie morfologii strzępek zaobserwowanej w płytce z insertem membranowym oraz w testach bezkontaktowych opartych na CFS. (A) Reprezentatywne mikrografie w jasnym polu przedstawiające odpowiedź morfologiczną C. albicans na YPD (kontrola), C. glabrata w układzie z płytką z insertem membranowym lub na pożywkę warunkowaną bezkomórkowym nadpłynem (CFS) z C. glabrata. Różowe, czarne i białe groty strzałek oznaczają odpowiednio drożdże, pseudostrzępki i prawdziwe strzępki. Pasek skali, 10 µm. Długości strzępek (B), objętości strzępek (C) i grubość strzępek (D) heterozygotycznego szczepu diploidalnego C. albicans (SC5314) zaobserwowane w odpowiedzi na komórki C. glabrata w układzie z płytką z insertem membranowym lub CFS z C. glabrata. Dane przedstawiają medianę ± 95% przedział ufności z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych, przy n = 50 komórek. ns, brak istotności: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Typ kopulacyjny i zygotyczność mają istotny wpływ na morfologię strzępek w diploidalnym C. albicans.Wykresy przedstawiające porównanie długości strzępek w odpowiedzi na wskazaną cząsteczkę induktora pomiędzy diploidami homozygotycznymi (A) oraz pomiędzy diploidami hetero- i homozygotycznymi (B) C. albicans. Podobnie, porównanie objętości strzępek w odpowiedzi na wspomniane cząsteczki induktora przedstawiono dla diploidów homozygotycznych (C) oraz diploidów hetero- i homozygotycznych (D). Kontrola: YPD, kontrolna pożywka nieindukująca tworzenia strzępek. Dane przedstawiają medianę ± 95% przedziały ufności z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych, przy n = 50 komórek. Wskazane liczby na górze wykresu to wartości p, wyznaczone za pomocą testu sum rang Wilcoxona. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, istotne statystycznie; ns, nieistotne: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Charakterystyka strzępek u haploidalnych C. albicans w odpowiedzi na różne induktory molekularne. Wykresy przedstawiają długość strzępek (A) oraz objętość strzępek (B) u haploidalnych szczepów C. albicans w odpowiedzi na wskazany induktor. Kontrola: YPD, kontrolna pożywka nieindukująca wzrostu strzępek. Dane przedstawiają medianę ± 95% przedziały ufności z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych, przy n = 50 komórkach. Wskazane liczby oznaczają wartości p, wyznaczone za pomocą testu sum rang Wilcoxona. **: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001, istotność statystyczna; ns, brak istotności: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Korelacja parametrów morfologicznych odpowiadających ploidii C. albicans. Wykresy przedstawiają korelację Spearmana oraz regresję liniową między parametrami morfologicznymi użytymi w niniejszym badaniu, tj. objętością i długością strzępek (A), objętością komórki i długością strzępek (B), objętością komórki i objętością strzępek (C) oraz grubością i długością strzępek (D). ρ: współczynnik korelacji Spearmana; R2: współczynnik determinacji z analizy regresji liniowej; p: wartość p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Szczep</td>
			<td >Gatunek</td>
			<td >Ploidia</td>
			<td >Genotyp</td>
			<td >Źródło</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CBS138</td>
			<td >Candida glabrata</td>
			<td >Haploidalny (1n)</td>
			<td >MATα</td>
			<td >ATCC 2001</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >SC5314</td>
			<td >Candida albicans</td>
			<td >Diploidalny (2n)</td>
			<td >Heterozygotyczny (MATa/α)</td>
			<td >ATCC MYA-2876</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >RBY1132</td>
			<td >Candida albicans</td>
			<td >Diploidalny (2n)</td>
			<td >Homozygotyczny (MATa/a); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >RBY1133</td>
			<td >Candida albicans</td>
			<td >Diploidalny (2n)</td>
			<td >Homozygotyczny (MATα/α); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GZY896</td>
			<td >Candida albicans</td>
			<td >Haploidalny (1n)</td>
			<td >Homozygotyczny (MATa); ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GZY803</td>
			<td >Candida albicans</td>
			<td >Haploidalny (1n)</td>
			<td >Homozygotyczny (MATα); his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Szczepy Candida albicans i Candida glabrata wykorzystane w niniejszym badaniu. Tabela przedstawia oznaczenia, dokładne genotypy, stopień ploidii oraz zygotyczność typu kojarzenia dla szczepów grzybowych ocenianych w bezkontaktowych testach kokultury w płytkach z wkładkami membranowymi oraz w testach opartych na nadianadczynie bezkomórkowym (CFS).
Tabela uzupełniająca 1: Dane z analiz statystycznych przeprowadzonych dla różnych parametrów morfologicznych C. albicans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Surowe wartości wszystkich powtórzeń biologicznych dla różnych parametrów morfologicznych C. albicans ocenianych w niniejszym badaniu.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Lista pożywek użytych w tym badaniu wraz z ich składami.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisano dwie bezkontaktowe metody kokultury do jakościowej i ilościowej oceny odpowiedzi morfologicznych grzybów podczas oddziaływań międzygatunkowych. Protokół demonstruje, w jaki sposób czynniki wewnętrzne wpływają na wzrost strzępek, posługując się przykładem testu międzygatunkowego *Candida*. Metody te można łatwo zaadaptować do badania komunikacji międzygatunkowej drobnoustrojów u różnych organizmów.

Bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów

Zachowanie i morfologia komórek w społecznościach mikrobiologicznych są zazwyczaj determinowane przez różne czynniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. Różne podejścia...

Badamy komunikację molekularną w interakcjach gospodarz-patogen oraz międzygatunkowych interakcjach grzybów, analizując, w jaki sposób wydzielane sygnały kształtują morfologię i zachowanie drobnoustrojów. Istniejące metody mogą być żmudne, kosztowne lub niejednoznaczne. Niniejszy protokół oferuje prosty, adaptacyjny i bezkontaktowy test do badania nowych międzygatunkowych interakcji drobnoustrojów. Protokół ten wspiera badania podstawowe i translacyjne nad interakcjami międzygatunkowymi i międzykrólestwowymi w różnych systemach biologicznych i klinicznych.Zacznij od umieszczenia w komorze z laminarnym przepływem powietrza płytki z agarem z minimalnym podłożem glukozowym z koloniami Candida glabrata CBS 138, sterylnej pętli oraz probówki zawierającej sterylny bulion z ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy (YPD). Pobierz pojedynczą, odizolowaną kolonię z płytki i zaszczep ją w 10 mililitrów bulionu YPD. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu przy 200 rpm przez 18 godzin. Pobierz kulturę nocną. Zweryfikuj morfologię drożdży oraz brak zanieczyszczeń za pomocą mikroskopii świetlnej. Przenieś kulturę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 5 000 x g przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Ostrożnie odlej supernatant i zachowaj osad komórkowy do testu z wkładką membranową. W przypadku docelowego szczepu Candida albicans, zaszczep pojedynczą kolonię w 5 mililitrów bulionu GMM dla szczepu diploidalnego lub w bulionie YPD dla szczepu haploidalnego. Inkubuj zaszczepioną kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy mieszaniu przy 200 rpm przez 12 godzin. Sprawdź gęstość optyczną kultury nocnej przy 600 nanometrach. Następnie rozcieńcz kulturę uprzednio ogrzanym GMM do końcowej objętości 1 mililitra i końcowej wartości OD przy 600 nanometrach wynoszącej 0,1.Należy użyć sterylnej 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Do każdego wybranego dolnego dołka lub komory brzusznej dwukomorowej płytki do hodowli komórek należy dodać 1 ml zawiesiny Candida albicans o OD przy 600 nm wynoszącej 0,1. Następnie należy pobrać osad Candida glabrata i resuspendować go w 1 ml bulionu GMM. Próbki należy odwirować przy 5 000 x g przez 3 minuty, a następnie odlać nadsącz. Procedurę płukania należy powtórzyć dwukrotnie. Końcowy osad należy resuspendować w świeżym bulionie GMM i dostosować OD zawiesiny komórek przy 600 nm do wartości pięciu. Następnie, za pomocą sterylnej pincety, należy umieścić sterylny wkład membranowy z poliwęglanową membraną o porach 0,4 µm w każdym roboczym dołku. Wkład należy mocno osadzić w dołkach, a następnie do każdej górnej komory lub komory światła wlać 750 µl przygotowanej zawiesiny Candida glabrata. Złożoną płytkę należy przykryć i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po inkubacji należy za pomocą sterylnej pincety wyjąć każdy górny wkład i bezpiecznie go zutylizować. Płytkę 24-dołkową należy umieścić na mikroskopie odwróconym wyposażonym w optykę DIC oraz obiektywy 10x, 20x i 40x o zwiększonej odległości roboczej w celu oceny morfologicznej.Po wymaganym czasie inkubacji zeskanuj dno studzienki przy użyciu obiektywu 10x, aby zweryfikować jednorodność rozkładu komórek oraz zidentyfikować błędy śledzenia lub anomalne skupiska. Przechwyć co najmniej 10 oddzielnych pól widzenia przy użyciu skalibrowanego obiektywu 20x w celu uzyskania zestawu danych dotyczących liczby filamentów i rozkładu populacji. Do szczegółowej analizy fenotypowej i pomiarów granic komórkowych wykonaj mikrofotografie przy użyciu obiektywu 40x o zwiększonej odległości roboczej. Następnie zapisz wszystkie surowe pliki obrazów. Uruchom najnowszą wersję oprogramowania Fiji. Otwórz docelową mikrofotografię, wybierając File, a następnie Open. Aby zmierzyć długość strzępki, kliknij ikonę Line selection i wybierz narzędzie Segmented line. Umieść kursor w miejscu, w którym filament wyłania się ze ściany komórki macierzystej drożdży. Obrysuj centralną oś podłużną strzępki, dodając punkty zakotwiczenia w celu odwzorowania krzywizn i zagięć, kończąc pomiar na wierzchołku apikalnym. Uruchom polecenie pomiaru za pomocą Control + M w systemie Windows lub command + M w systemie Mac OS, aby zarejestrować całkowitą długość, L, w mikrometrach w oknie Results. Użyj narzędzia Brush, aby zaznaczyć zmierzoną komórkę i zapobiec powielonej analizie. Zlokalizuj przynależną do niej macierzystą komórkę drożdży. Za pomocą narzędzia Segmented line narysuj i zmierz linię prostą wzdłuż maksymalnej osi podłużnej komórki, aby zapisać oś główną, A. Następnie narysuj i zmierz linię prostopadłą do osi głównej w najszerszym przekroju poprzecznym, aby zapisać oś mniejszą, B. Oblicz objętość macierzystej komórki drożdży, CV, w mikrometrach sześciennych, korzystając z modelu sferoidy wydłużonej dostępnego w oprogramowaniu. Aby zmierzyć grubość strzępki, użyj narzędzia Segmented line do narysowania linii od zewnętrznej ściany do zewnętrznej ściany, prostopadłej do osi długości strzępki. Zapisz średnicę w trzech równoodległych punktach wzdłuż filamentu. Oblicz średnią arytmetyczną trzech średnic, aby uzyskać średnią grubość, d, i podziel ją przez 2, aby otrzymać promień, r. Oblicz całkowitą objętość strzępki, HV, w mikrometrach sześciennych, traktując nierozgałęziony filament jako walec.Oblicz średnią lub medianę pomiarów komórek dla każdego powtórzenia biologicznego, a następnie wykorzystaj te wartości na poziomie powtórzeń do dalszych porównań statystycznych. Przed zastosowaniem metod parametrycznych oceń rozkład danych z powtórzeń biologicznych pod kątem normalności, używając testu Shapiro-Wilka lub testu D'Agostino-Pearsona. W przypadku porównania dwóch grup zastosuj nieparzysty dwustronny test t studenta, jeśli zbiór danych wykazuje rozkład normalny. Po przeprowadzeniu analiz statystycznych i przygotowaniu reprezentacji graficznych zastosuj spójne oznaczenia statystyczne we wszystkich figurach.Komórki Candida albicans wykształciły prawdziwe strzępki w dwóch bezkontaktowych systemach testowych, zarówno w przypadku ekspozycji na oddzielone membraną komórki Candida glabrata, jak i na przefiltrowany supernatant wolny od komórek Candida glabrata. Komórki kontrolne natomiast zachowały przeważnie morfologię drożdżakową i pseudostrzępkową. Nie zaobserwowano istotnych różnic między testami z kokulturą oddzieloną membraną a testami z przefiltrowanym CFS; w obu przypadkach uzyskano porównywalne długości, objętości i grubości strzępek.Protokół ten umożliwia badaczom analizę współistnienia wielu gatunków poprzez pomiar odpowiedzi morfologicznych na sygnalizację międzygatunkową w obrębie społeczności mikrobiologicznych. Kluczowym wyzwaniem jest zapewnienie wymiany molekularnej przez błonę, co można osiągnąć poprzez wstrząsanie płytkami i utrzymanie odpowiedniego ciśnienia hydrostatycznego. Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki organelli może ujawnić mechanizmy, dzięki którym komunikacja molekularna kształtuje interakcje międzygatunkowe.

contactless-co-culture-assays-for-morphometric-studies-during-inter

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niniejszy artykuł ma na celu opisanie w sposób etapowy powszechnie stosowanych testów in vitro wykorzystywanych w badaniu oddziaływań między komórkami Schwanna a astrocytami.

Analiza interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

W niniejszym filmie zaprezentowano podejście z wykorzystaniem kontrolowanego środowiska do badania degradacji lignocelulozowych tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe. Możliwość kontrolowania źródeł składników odżywczych oraz wilgotności jest kluczową zaletą mikrokosmosów w blokach agarowych, jednak podejście to często przynosi niejednoznaczne rezultaty. Omówiliśmy krytyczne pułapki, aby umożliwić uzyskanie powtarzalnych wyników o niskiej zmienności.

Mikrokosmy z bloków agarowych do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Związki terapeutyczne są często najpierw badane in vitro za pomocą testów żywotności. Zliczanie ślepych komórek przez ludzkiego obserwatora może być bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany liczby komórek, ale nie ocenia funkcji. Komputerowe testy żywotności, jak opisano tutaj, mogą ocenić zarówno strukturę, jak i funkcję w obiektywny sposób.

Testy żywotności komórek w hodowli

Ten manuskrypt przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w obrębie kłykcia żuchwy gryzoni.

Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Przesłany tutaj protokół wyjaśnia kompletny proces in silico potrzebny do przewidywania i funkcjonalnego charakteryzowania circRNA na podstawie danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, badających interakcje gospodarz-patogen.

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Poznaj bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów. Te metody umożliwiają analizę zmian morfologicznych w odpowiedzi na czynniki międzygatunkowe.

Bezstykowe testy kokultury do badań morfometrycznych podczas interakcji międzygatunkowych u grzybów

Przeglądaj więcej filmów