Name: Generowanie neuronów GABAergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ASCL1/DLX2 ekspresji w AAVS1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w neurony GABAergiczne przy użyciu indukowalnego systemu doksycyklinowego z integracją ASCL1/DLX2 w locus AAVS1. Protokół zapewnia wydajną i powtarzalną produkcję neuronów do modelowania chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wsparcie zostało zapewnione przez kanadyjski program sieci komórek macierzystych Jump Start ECR oraz Fonds UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine -Institut Imagine en épilepsie de l’enfant. Théo Rabin otrzymuje wsparcie od sieci Odisé.

UWAGA: kultury ludzkich hiPSC należy trzymać jak potencjalnie niebezpieczny materiał biologiczny zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Przeprowadzaj wszystkie procedury kultury ludzkich hiPSC w certyfikowanym szafie biologicznej klasy II z zachowaniem sterylnej techniki. Wszystkie odpady zawierające ludzkie komórki, medium eksponowane na ludzkie komórki oraz materiał plazmidowy CRISPR/Cas9 należy dezaktywować zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego przed wyrzuceniem. Doksycyklinę, puromycin, DMSO i inne reagenty chemiczne należy obchodzić się z rękawiczkami i odpowiednią ochroną oczu i skóry, a odpady należy wyrzucać zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów chemicznych. Ekstrakt z błony podstawnej (BME) należy przechowywać stosując sterylną technikę i przechowywać na lodzie przed użyciem, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji. Przechowywanie w ciekłym azocie i obsługa kriowiorów powinna być wykonywana z odpowiednimi rękawicami kriogenicznymi, ochroną twarzy i ostrożnością, aby uniknąć poparzeń mrozem lub eksplozji fiolki podczas odmrażania.
UWAGA: Przed edycją za pomocą CRISPR/Cas9 i różnicowaniem neuronów, kultury hiPSC powinny spełniać wcześniej określone kryteria kontroli jakości. Komórki muszą być potwierdzone jako negatywne na mykoplazmę, wyświetlać normalny kariotyp lub akceptowalny profil integralności genomowej oraz utrzymywać mocną ekspresję markerów pluripotencji, w tym OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 i/lub SSEA4. Kultury powinny wykazywać typową zwartą morfologię kolonii hiPSC, z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy, zdefiniowanymi granicami kolonii i minimalną samoistną różnicowaniem. Powinny być używane tylko aktywnie rozmnażające się kultury w zalecanym zakresie przelewów i nie powinny przekraczać maksymalnej liczby przelewów określonej w laboratorium, zwykle poniżej przelew 40, chyba że zostanie to inaczej zweryfikowane. Kultury wykazujące nieprawidłową morfologię, nadmierną samoistną różnicowanie, słaby wzrost, potwierdzone zakażenie lub dowody na niestabilność genomową powinny być wyłączone z eksperymentów edycji i różnicowania. Wszystkie materiały potrzebne do tego protokołu, w tym receptury na media, są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie reagentów i płytek kulturalnych
<ol>
	<li>Przygotuj medium do zamrażania łącząc 40 mL zamiennika surowicy knock-out (KOSR) i 10 mL dimetylosulfonianu (DMSO) w 50 mL stożkowym probówce.</li>
	<li>Wyrównaj medium do zamrażania pipetowaniem w górę i w dół 10 razy. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	<li>Rozcieńczyć ekstrakt z błony podstawnej (BME) w media Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) do końcowej koncentracji 80 μg/mL. 
	UWAGA: Przed rozcieńczeniem, zweryfikuj koncentrację otrzymanego roztworu BME za pomocą numeru partii na stronie internetowej dostawcy.</li>
	<li>Dodaj 1 mL rozcieńczonego BME na dołek do płytki 6-dołkowej. Natychmiast umieść BME w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na całej powierzchni dołków. Upewnij się, że nie ma niepokrytych obszarów.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C przed użyciem. 
	UWAGA: Nie ma maksymalnego czasu inkubacji. Jeśli inkubacja trwa dłużej niż 1 dzień, upewnij się, że DMEM/F-12 nie odparowują się. Roztwór BME użyty do jednego dołka można ponownie użyć tylko raz do powłoki drugiego dołka. Manipulowanie BME w temperaturze pokojowej powinno być krótkie z powodu jego szybkiego polimeryzacji.</li>
</ol>
2. Utrzymanie i przelewanie hiPSC
UWAGA: W tym protokole, medium do utrzymania hiPSC odnosi się do mTeSR plus. mTeSR plus jest zalecanym medium do rutynowego utrzymania, przelewania, odzyskiwania po nukleofekcji i selekcji puromycinu.
<ol>
	<li>Przelew hiPSC wykonuj około co 4-6 dni, gdy komórki osiągną 60% konfluencji.</li>
	<li>Wyssaj medium kulturowe z dołków za pomocą pipety aspirującej.</li>
	<li>Dodaj 1 mL ReLeSR do dołka i inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyssaj środek dysocjujący i inkubować płytkę przez 8 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1 mL medium do utrzymania hiPSC za pomocą pipety 5 mL. Zebraj zawiesinę komórkową w probówce 50 mL.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL niebieskiego trypanu w probówce mikrowirówkowej. Włóż 10 μL mieszanki na ślizg komórkowy, aby określić koncentrację żywych komórek.</li>
	<li>Wyssaj powłokę BME z wcześniej przygotowanego dołka. Dodaj 2 mL medium do utrzymania hiPSC uzupełnione o inhibitor kinazy związanych z Rho (ROCK) (Y-27632; 10 μM końcowa).</li>
	<li>Zasiej 100 000 hiPSC do dołka

<ol>
	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
	<li>Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.</li>
	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
	<li>Wogram E, S&#252;mpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In&#160;Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.</li>
	<li>Mar&#237;n O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107&#8211;20. PubMed PMID: 22251963.</li>
	<li>Yang N, Ng YH, Pang ZP, S&#252;dhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.</li>
	<li>Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.</li>
	<li>Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.</li>
	<li>Gu J, Rollo B, Liu Z, O&#8217;Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Udane generowanie neuronów GABAergicznych w znacznym stopniu opiera się na kilku krytycznych krokach w obrębie tego protokołu. Utrzymanie wysokiej jakości, niediferencjowanych hiPSCs jest kluczowe; spontaniczna dyferencjacja przed nukleofekcją drastycznie zmniejsza efektywność integracji i czystość neuronów na dalszych etapach8. Ponadto, precyzyjne określenie krzywej eliminacji puromycyny jest istotne, aby zapewnić całkowitą eliminację niezintegrowanych komórek bez nadmiernego stresu dla właściwie...

Komórki ludzkie pluripotencjalne indukowane (hiPSC) zapewniają unikalną platformę do modelowania ludzkich chorób neurologicznych in vitro oraz do badania złożonych mechanizmów molekularnych, które napędzają rozwój i zwyrodnienie1. Technologia ta umożliwia generowanie specyficznych dla pacjenta modeli komórkowych w celu zbadania szerokiego zakresu warunków, od wczesnych zaburzeń neurorozwojowych w zespołach rzęskowych2 po subtelne zmiany epigenomiczne obserwowane w sporadycznym chorobie Alzheimera3. W związku z tym, kierowana dyferencjacja hiPSC stała się filarem nowoczesnej molekularnej neurobiologii.
Aby skutecznie uchwycić subtelności ludzkich procesów neurologicznych, konieczne jest generowanie wysoce specyficznych i czystych podtypów neuronów. Na przykład, zdefiniowane populacje neuronów są wymagane, aby wyjaśnić specyficzne role transkrypcyjne białek jak MECP2 w ludzkich neuronach4 lub aby ocenić ukierunkowane podatności obwodowych neuronów czuciowych na infekcje wirusowe, takie jak SARS-CoV-25. Co więcej, konstruowanie złożonych, fizjologicznie istotnych mikrośrodowisk, jak włączenie funkcjonalnych mikrogleju do 3D organizmów mózgowych, opiera się zasadniczo na solidnym, przewidywalnym wytwarzaniu odrębnych linii neuronowych i glejowych6. Wśród tych podtypów, neurony GABAergiczne są szczególnie interesujące ze względu na ich kluczową rolę hamującą w ośrodkowym układzie nerwowym i ich zaangażowanie w różne zaburzenia neurologiczne i psychiatryczne7. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie niezawodnego, wydajnego i powtarzalnego protokołu kierowane dyferencjacji hiPSC w indukowane neurony wyrażające markery linii GABAergicznej. Tradycyjne protokoły kierowane dyferencjacji dla neuronów GABAergicznych, które opierają się na zewnętrznych cząsteczkach sygnałowych, mogą być czasochłonne, bardzo zmienne i prowadzić do heterogenicznych populacji komórek8.
Aby pokonać te ograniczenia, kierownictwo przez czynniki transkrypcyjne stało się potężną alternatywą9. Ten protokół wykorzystuje system ekspresji indukowany doksycykliną do sterowania ekspresją proneuronalnych czynników transkrypcyjnych ASCL1 i DLX210. Poprzez kierowanie tych transgenów do miejsca integracji wirusa adeno-skojarzonego 1 (AAVS1), lokusu safe-harbor za pomocą CRISPR/Cas9, ta metoda omija wspólny problem wyciszenia transgenu związanego z losową integracją lentiwirusową10. Konstrukt donora zawiera fluorescujący reporter, taki jak mCherry, aby monitorować komórki pozytywne na transgen po selekcji. Ta strategia ma na celu wsparcie bardziej jednorodnej ekspresji transgenów niż losowe podejście integracyjne, chociaż stabilność ekspresji i powtarzalność dyferencjacji powinny zostać zweryfikowane dla każdej inżynierowanej linii. Ta standaryzowana metoda generuje wzbogacone populacje indukowanych neuronów wyrażających markery linii GABAergicznej w około 21 dni, czyli krótszy czas w porównaniu z tradycyjnymi podejściami opartymi na małych cząsteczkach8,10. Ten protokół jest wysoce odpowiedni dla badaczy, którzy wymagają skalowalnych, spójnych populacji neuronów do zastosowań dółstrumienia, takich jak mikroskopia wysokozawartościowa, transkryptyka pojedynczych komórek lub funkcjonalne badania fizjologiczne.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>Do elektroporacji/nukleofekccji hiPSC.</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>Plate wymagające kultury tkankowej do utrzymania i różnicowania hiPSC.</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>Cell counter (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Używany do liczenia komórek.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Do osiadania komórek.</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i lub równoważny</td><td>Inkubator do kultury komórek utrzymujący 37 &deg;C, wilgotne powietrze i 5% CO2.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Sterylne naczynia kriogeniczne do zamrażania hiPSC; mogą być użyte odpowiednie zewnętrznie gwintowane 1,8–2,0 mL naczynia kriogeniczne.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Standardowa macierz powłoki BME używana w protokole. Zweryfikuj stężenie magazynowe dla danej partii z certyfikatu analitycznego Bio-Techne i rozcieńcz w DMEM/F-12 do stężenia roboczego 80 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>Podstawowe medium używane do rozcieńczania BME.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Kryoprotektor używany w przygotowaniu medium zamrażającego.</td></tr><tr><td>Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette</td><td>Custom plasmid</td><td>Addgene accession pending</td><td>Niestandardowy plazmid AAVS1 zawierający indukowany doksycykliną ASCL1-P2A-DLX2 kasecie i elementy selekcji/reportera. Podaj mapę plazmidu i pełną sekwencję jako plik dodatkowy lub na żądanie.</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Używany do indukcji ekspresji ASCL1-P2A-DLX2. Przygotuj sterylny skoncentrowany roztwór, porcje, chronić przed światłem, przechowywać zamrożony i używać w końcowej koncentracji 1 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Do sterylizacji wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego; używaj zatwierdzonego przez instytucję 70% alkoholu lub równoważnego.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Mikroskop używany do fazokontrastowego i fluorescencyjnego obrazu ekspresji reportera i morfologii neuronów.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>hiPSC line PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 human iPSC line</td><td>Dostępna komercyjnie ludzka linia hiPSC z otwartą zgodą używaną w tym protokole; zarejestruj numer przejścia i status QC przed edycją i różnicowaniem.</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Open-source; version used should be reported</td><td>Do kwantyfikacji fluorescencji i przetwarzania reprezentatywnych obrazów.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Replacement (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Używany w przygotowaniu medium zamrażającego.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Tylko opcjonalny reagent do rozwiązywania problemów. Nie jest częścią standardowego protokołu powłoki; może być użyty jako alternatywa lub podwójna warstwa powłokowa, jeśli trwa odczepianie neuronów.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus lub równoważny</td><td>Długotrwała przechowywanie zamrożonych hiPSC w fazie pary lub ciekłym azocie zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa kriogenicznego.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Do kontrolowanego zamrażania komórek w -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Medium bez karmy dla hiPSC.</td></tr><tr><td>Neuro-induction medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Komercyjne medium neuro-indukcyjne używane do wczesnej indukcji neuronów.</td></tr><tr><td>Neuro-maturation base medium (BrainPhys&trade; Neuronal Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Podstawowe medium dla dojrzewania neuronów; uzupełnić z BDNF, GDNF, NT-3, doksycykliną i PluriSln-1 jak opisano w protokole.</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotrophic Factor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Zestaw zawierający roztwór P3 i kubeczki do nukleofekcji hiPSC.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Opcjonalny antybiotyk do zmniejszenia ryzyka skażenia bakteryjnego.</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade; prophylactic</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>Opcjonalny antybiotyk do zapobiegania skażeniu mykoplazmą.</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>Inhibitor przeżycia komórek pluripotentnych do eliminacji niezróżnicowanych hiPSC; przygotuj skoncentrowany roztwór zgodnie z instrukcjami producenta i u

generowanie neuronów gabaergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ascl1/dlx2 ekspresji w aavs1

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

Ludzkie komórki macierzyste wielopotencjalne indukowane (hiPSCs) oferują bezprecedensową możliwość modelowania ludzkich chorób neurologicznych in vitro. Niezawodne generowanie określonych populacji neuronów, takich jak neurony kwasu gamma-aminomasłowego (GABAergiczne), jest niezbędne do tych badań. Ten protokół szczegółowo opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSCs na neurony GABAergiczne przy użyciu systemu indukowanego doksycykliną. Podejście opiera się na stabilnej integracji transgenów kodujących czynniki transkrypcyjne ASCL1 i DLX2 w lokusu miejsca integracji adeno-skojarzonego wirusa safe-harbor 1 (AAVS1) poprzez knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Ta ukierunkowana integracja unika wyciszenia transgenów często obserwowanego przy losowej integracji lentiwirusowej. Protokół obejmuje utrzymanie hiPSCs, proces nukleofekcji w celu integracji transgenów, selekcję puromycinem w celu wzbogacenia pomyślnie inżynieryzowanych komórek oraz krok po kroku procedurę różnicowania. Po indukcji doksycykliną, inżynieryzowane hiPSCs szybko opuszczają cykl komórkowy, nabierają morfologii neuronów i wyrażają markery linii GABAergicznej w ciągu 21 dni. Kluczowe kroki obejmują neuroindukcję i następującą po niej dojrzałość za pomocą specyficznych czynników wzrostu, a także potencjalne podejścia do poprawy adhezyjności komórkowej podczas dojrzewania. Ta standaryzowana metoda daje wzbogacone populacje indukowanych neuronów wyrażających markery linii GABAergicznej, zapewniając cenne narzędzie do badań nad neurologią i modelowaniu komórkowego.

Pomyślne zastosowanie tego protokołu prowadzi do uzyskania wzbogaconej populacji indukowanych neuronów o cechach molekularnych charakterystycznych dla neuronów GABAergicznych. Strategia ta opiera się na celowanej insercji kasety ASCL1-P2A-DLX2 indukowalnej doksycykliną do locus AAVS1 (Rysunek 1A). Po selekcji zmodyfikowanych hiPSC, indukcja doksycykliną jest wykorzystywana do stymulacji różnicowania w neurony GABAergiczne, zgodnie z harmonogramem przedstawionym na ...

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania neuronów GABAergicznych z ludzkich komórek pluripotencjalnych indukowanych poprzez integrację transgenów indukowanych doksycykliną do AAVS1. bezpiecznego lokusu. Stabilne, jednorodne ekspresja transgenów zapewnia efektywne podejście do bezpośredniego różnicowania się w neurony GABAergiczne, ograniczając jednocześnie wyciszenie transgenów, co jest częstym problemem w przypadku podejść lentiwirusowych.

Generowanie neuronów GABAergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ASCL1/DLX2 ekspresji w AAVS1

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

Nasze badania koncentrują się na generowaniu czystej populacji neuronów GABAergicznych z hiPSC w celu modelowania ludzkiej różnorodności neuronalnej oraz chorób. Istniejące protokoły wymagają powtarzalnej transdukcji wirusowej przy każdej różnicowaniu. Niniejszy protokół rozwiązuje to ograniczenie z wykorzystaniem linii komórkowej AAVS1.W celu rozpoczęcia przygotować medium do mrożenia, łącząc 40 ml zamiennika surowicy knock-out (KOSR) oraz 10 ml DMSO w 50-mililitrowej probówce stożkowej. Homogenizować medium do mrożenia, pipetując ciecz w górę i w dół 10 razy, a następnie przechowywać roztwór w temperaturze 4°C. Następnie rozcieńczyć ekstrakt błony podstawnej (BME) w medium DMEM/F12 do stężenia końcowego 80 µg/ml. Do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodać 1 ml rozcieńczonego BME. Przechylić płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór po całej powierzchni dołków, upewniając się, że nie pozostały obszary niepokryte, a następnie inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37°C.Za pomocą pipety aspiracyjnej odessaj pożywkę z dołków zawierających ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs). Do dołka dodaj 1 mililitr ReLeSR i inkubuj przez 30 sekund

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w neurony GABAergiczne przy użyciu indukowalnego systemu doksycyklinowego z integracją ASCL1/DLX2 w locus AAVS1. Protokół zapewnia wydajną i powtarzalną produkcję neuronów do modelowania chorób neurologicznych.

Generowanie neuronów GABAergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ASCL1/DLX2 ekspresji w AAVS1 (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie neuronów GABAergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ASCL1/DLX2 ekspresji w AAVS1

Przeglądaj więcej filmów