Name: Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym hydrożelu. Technika ta odtwarza morfogenezę sutka i umożliwia badanie plastyczności nabłonkowej oraz wczesnych etapów karcynogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Z ogromnym wdzięcznością dziękujemy Karli Murga, Danieli Requena i Megan Maloney z Tufts Biomedical Repository za wsparcie w zakresie tkanek. Badania te były wspierane przez Fundację Find The Cause Breast Cancer oraz Nagrodę NIH Clinical and Translational Science Award (UM1TR0043, G.R.) nadaną przez Tufts CTSI.

Tkanki pierwotne, które w przeciwnym razie zostałyby zutylizowane jako odpady medyczne po zabiegu chirurgicznym, pozyskano zgodnie ze wszystkimi właściwymi przepisami, stosując protokoły zatwierdzone przez instytucjonalne rady przeglądowe (IRB) w Maine Medical Center oraz Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały zanonimizowane przed przekazaniem i nie można ich było powiązać z konkretnymi pacjentami. Z tego powodu badania te otrzymały status zwolnienia z nadzoru od Komitetu ds. Wykorzystania Ludzi jako Podmiotów Eksperymentalnych w Massachusetts Institute of Technology oraz w Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci włączeni do badania podpisali formularz świadomej zgody, zgadzając się na udział w badaniu oraz na publikację wyników.
1. Obróbka i przygotowanie tkanek
UWAGA: Wszystkie procedury z wykorzystaniem tkanek ludzkich należy przeprowadzać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi biobezpieczeństwa i etyki. Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się ze schematami przebiegu prac przedstawionymi na Ryc. 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd etapów protokołu i procesu przygotowania organoidów.
<ol>
	<li>Przygotować MEGM, wykorzystując podstawową pożywkę dla nabłonka gruczołu piersiowego uzupełnioną o 52 µg/mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ng/mL ludzki czynnik wzrostu naskórka, 5 µg/mL insulinę, 500 ng/mL hydrokortyzon, 1% (v/v) GlutaMAX oraz 1% (v/v) Antibiotic-Antimycotic (100X).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do dysocjacji, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) oraz 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do pożywki wzrostowej dla nabłonka gruczołu piersiowego (MEGM).</li>
	<li>Otrzymać ludzką tkankę piersi pobraną podczas profilaktycznych mastektomii i redukcyjnych plastyk piersi w ciągu 24 h po wycięciu, nieutrwaloną, w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), utrzymywaną w temperaturze 4°C. Zważyć tkankę na wadze precyzyjnej, aby określić całkowitą masę tkanki.</li>
	<li>Umieścić tkankę w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o wielkości 3–5 mm3 za pomocą sterylnych skalpeli. Przenieść około 2–3 g rozdrobnionej tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Do każdej probówki dodać 10 mL pożywki do dysocjacji.</li>
	<li>Inkubować probówki w 37°C na rotatorze orbitalnym przy 8 rpm przez 12–18 h w celu enzymatycznego trawienia tkanki. Trawienie uznaje się za zakończone, gdy nie pozostaną żadne duże fragmenty tkanki, a w całej pożywce widoczna będzie jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału.</li>
	<li>Pozostawić fragmenty nabłonka do osiadania pod wpływem grawitacji przez 5 min. Potwierdzić, że w pożywce nie pozostają żadne widoczne zawieszone fragmenty i że obecny jest wyraźny osad. Ostrożnie odlać i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu. 
	UWAGA: Nadsącz zawiera komórki zrębu i komponenty macierzy; można go przemyć i wykorzystać lub zachować do innych badań.</li>
	<li>Resuspendować osad w 10 mL pożywki do przemywania składającej się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS. Centryfugować przy 250 × g przez 5 min w wirówce z koszem wahadłowym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórzyć etap przemywania trzy kolejne razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się przejrzysty i wolny od widocznych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Resuspendować końcowy osad w pożywce do mrożenia składającej się z 10% dimetylosulfoksydu (DMSO) w MEGM, przy objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki. 
	OSTRZEŻENIE: DMSO jest szkodliwy w przypadku kontaktu ze skórą lub inhalacji. Należy go używać z odpowiednimi środkami ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem chemicznym, jeśli wymagają tego wytyczne instytucjonalne.</li>
	<li>Rozdzielić zawiesinę w ilościach 1 mL do każdej krioprobówki. Umieścić krioprobówki w temperaturze −80°C w pojemniku do mrożenia przed długoterminowym przechowywaniem w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Ten krok stanowi punkt przerwania procedury. Próbki należy przechowywać w −80°C przed przeniesieniem do warunków długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>
2. Odzyskiwanie i opcjonalne przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Rozmrażanie i wstępna regeneracja
	<ol>
		<li>Wyjąć kriokonserwowaną tkankę z przechowywania w temperaturze −80°C po zamrożeniu przez co najmniej 24 h lub z długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Natychmiast zanurzyć krioprobowkę do poziomu nakrętki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrozić przez 1 min, aby zminimalizować śmierć komórek. 
		UWAGA: Podczas rozmrażania delikatnie agitować krioprobowkę, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.</li>
		<li>Po całkowitym rozmrożeniu natychmiast przenieść zawartość krioprobowki do probówki stożkowej o objętości 15 mL zawierającej 10 mL MEGM. Wirować przy 250 × g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalne usuwanie fibroblastów 
	UWAGA: Usuwanie fibroblastów poprzez pre-plating jest opcjonalnym etapem wzbogacania, stosowanym w celu zmniejszenia populacji szybko przylegających komórek zrębu lub fibroblastów, gdy pożądana jest populacja startowa bardziej wzbogacona w komórki nabłonkowe. Ten etap nie jest wymagany do tworzenia organoidów i może być dostosowany w zależności od celu eksperymentu.
	<ol>
		<li>Resuspendować osad w 10 mL MEGM.</li>
		<li>Przenieść resuspendowaną tkankę do 10 cm naczynia do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez 90 min, aby umożliwić przyleganie fibroblastów. 
		UWAGA: Nie poruszać naczyniem hodowlanym podczas inkubacji, aby zapewnić efektywne przyleganie fibroblastów.</li>
		<li>Zebrać supernatant zawierający komórki nieprzylegające za pomocą pipety serologicznej 10 mL, delikatnie przechylając naczynie hodowlane pod kątem około 45°. Delikatnie przepłukać płytkę 5 mL PBS i połączyć płukankę z zebranym supernatorem.</li>
		<li>Wirować połączoną zawiesinę przy 250 × g przez 5 min, aby odzyskać materiał wzbogacony w komórki nabłonkowe. 
		UWAGA: Komórki, które przylgnęły do płytki, są wzbogacone w fibroblasty gruczołu mlekowego i mogą być propagowane oddzielnie poprzez dodanie pożywki składającej się z DMEM + 10% FBS oraz antybiotyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalna dysocjacja do pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Resuspendować osad w 500 µL podgrzanego (37°C) roztworu enzymu dysocjującego składającego się z 0,25% trypsyny. Alternatywne odczynniki dysocjujące mogą wymagać optymalizacji. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o objętości 1,5 mL. Triturację próbki wykonać 20 razy za pomocą pipety P1000, aby wspomóc dysocjację. 
		OSTRZEŻENIE: Odczynniki do dysocjacji enzymatycznej mogą być szkodliwe. Należy posługiwać się odpowiednim sprzętem ochrony osobistej i unikać kontaktu ze skórą lub oczami.</li>
		<li>Inkubować probówkę w temperaturze 37°C przez 3-5 min. Natychmiast po inkubacji przeprowadzić mechaniczną dysocjację próbki poprzez triturację 20 razy za pomocą pipety P1000.</li>
		<li>Dodać 1 mL pożywki płuczącej zawierającej surowicę, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną. Wirować przy 500 × g przez 5 min.</li>
		<li>Resuspendować osad w 300 µL roztworu dispazy (5 U/mL) i 30 µL roztworu DNazy (1 mg/mL). Inkubować w temperaturze 37°C przez 3–5 min.</li>
		<li>Przeprowadzić mechaniczną dysocjację próbki poprzez pipetowanie 15–20 razy. Dodać do zawiesiny 700 µL pożywki płuczącej zawierającej surowicę.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm do czystej probówki. Można zastosować standardowe sitko komórkowe 40 µm lub sitko Flowmi na końcówkę pipety. Sitka Flowmi mogą zmniejszyć stratę próbki podczas pracy z ograniczoną liczbą komórek.</li>
		<li>Wyznaczyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Zmieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z błękitem trypanowym w stosunku 1:1 i nanieść 10 µL mieszaniny do komory do liczenia komórek lub na szkiełko do liczenia. Określić żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
		<li>Wirować zawiesinę przy 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Resuspendować osad komórkowy w MEGM do pożądanej koncentracji do siewu w hydrożelu. 
		UWAGA: W przypadku eksperymentów z siewem pojedynczych komórek, typowa liczba komórek wynosi od około 1 000–5 000 komórek na 200 µL hydrożelu, w zależności od celu eksperymentu i charakterystyki próbki od dawcy. Niższe gęstości siewu są zazwyczaj stosowane w badaniach obrazowania na żywo i morfogenezy, aby ułatwić śledzenie rozwoju poszczególnych organoidów, natomiast wyższe gęstości są powszechnie stosowane w końcowych analizach molekularnych, w tym do pozyskiwania RNA i białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów stokowych i obliczenia objętości
	<ol>
		<li>Przed użyciem umieścić na lodzie roztwór lamininy (1,18 mg/mL), roztwór kwasu hialuronowego (1 mg/mL w wodzie sterylnej), roztwór fibronektyny (2 mg/mL w wodzie sterylnej) oraz PBS 1×. Alikwoty lamininy i fibronektyny przechowywać w temperaturze −80°C, a roztwór kwasu hialuronowego w temperaturze 4°C. Zamrożone komponenty rozmrażać powoli na lodzie w temperaturze 0°C–4°C przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować 25-krotny roztwór stokowy suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przygotować 1 mL, połączyć w probówce utrzymywanej na lodzie 425 µL lamininy, 250 µL kwasu hialuronowego, 250 µL fibronektyny i 75 µL PBS. Pomieszać delikatnie, odwracając probówkę 3–4 razy. Roztwór przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przed przygotowaniem określić pożądaną końcową objętość i skład hydrożelu. Przygotować co najmniej 20% nadmiaru objętości, aby uwzględnić straty materiału podczas pipetowania i przenoszenia. 
		UWAGA: Formuła hydrożelu składa się z kolagenu I, końcowego stężenia 1× suplementów macierzy zewnątrzkomórkowej (z roztworu stokowego 25×) oraz 12,5% (v/v) 0,1 N wodorotlenku sodu w stosunku do objętości kolagenu I w celu neutralizacji pH i polimeryzacji. 
		UWAGA: Końcowe stężenia w hydrożelu to 1,7 mg/mL kolagenu I, 20 µg/mL lamininy, 20 µg/mL fibronektyny i 10 µg/mL kwasu hialuronowego.</li>
		<li>Obliczyć wymaganą objętość kolagenu I (Vcollagen) korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie objętości kolagenu Vcollagen=Cfinal×Vtotal/Cstock; wzór na stężenie, rozcieńczenie." src="/files/ftp_upload/71831/71831eq1.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="Równanie 1"> 
		Gdzie Cfinal = 1,7 mg/mL, Vtotal  to pożądana końcowa objętość hydrożelu, a Cstock to stężenie roztworu stokowego kolagenu. Stosować stężenia stokowe kolagenu w zakresie 2–12 mg/mL. 
		UWAGA: Stężenie stokowe kolagenu może różnić się między partiami. Wyższe stężenia zwiększają lepkość, dlatego należy pipetować je powoli.</li>
		<li>Obliczyć objętość 0,1 N wodorotlenku sodu (VNaOH) korzystając z następującego wzoru: 
		VNaOH = 0,125 x Vcollagen 
		Przygotować roboczy roztwór 0,1 N wodorotlenku sodu poprzez rozcieńczenie 1 N wodorotlenku sodu w wodzie sterylnej.</li>
		<li>Obliczyć objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej (VES) korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie potencjału elektrostatycznego, wzór V_ES=V_total/25, narzędzie do nauki." src="/files/ftp_upload/71831/71831eq2.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Obliczyć pozostałą objętość do uzupełnienia pożywką wzrostową korzystając z następującego wzoru: 
		Vgrowth medium = Vtotal - (Vcollagen + VNaOH + VES + Vcells/tissue) 
		UWAGA: Objętość komórek lub fragmentów tkanki określać indywidualnie dla każdego eksperymentu. Stosować typowy zakres 10–100 µL w ramach dopuszczalnej objętości. Nie przeprowadza się precyzyjnego liczenia fragmentów, ponieważ ich rozmiar i skład znacząco różnią się między preparatami. Standaryzować wysiew poprzez wizualną ocenę liczby i rozkładu fragmentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie master mixu hydrożelu
	<ol>
		<li>Umieścić kolagen I, suplement macierzy zewnątrzkomórkowej, wodorotlenek sodu (0,1 N) i pożywkę wzrostową na lodzie w temperaturze 0°C–4°C. Wszystkie komponenty utrzymywać w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość kolagenu I do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość uprzednio schłodzonej pożywki wzrostowej do roztworu kolagenu.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość 0,1 N wodorotlenku sodu w celu zneutralizowania roztworu. 
		UWAGA: Wcześniejsza optymalizacja wykazała, że warunki te zapewniają odpowiednie pH żelu; w związku z tym rutynowe badanie pH mieszaniny hydrożelu nie jest wymagane. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywać szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.</li>
		<li>Wymieszać roztwór, energicznie potrząsając probówką z częstotliwością około jednego wstrząśnięcia na sekundę przez co najmniej 6 wstrząśnięć.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej do mieszaniny.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki za pomocą pipety P1000 lub końcówki pipety o szerokim otworze. Wymieszać natychmiast poprzez potrząsanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.5 i bezzwłocznie przejść do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie hydrożelu
	<ol>
		<li>Nanieść pipetą mieszaninę hydrożelu do naczyń hodowlanych w pożądanej objętości na dołek. Stosować 200 µL hydrożelu na dołek dla szkiełek z komorami 4-dołkowymi, 100 µL na dołek dla szkiełek z komorami 8-dołkowymi i 20 µL na dołek dla płytek 96-dołkowych.</li>
		<li>W przypadku szkiełek z komorami rozprowadzić hydrożel w postaci cienkiej warstwy na powierzchni. Umieścić końcówkę pipety na środku górnej krawędzi dołka komory i przesuwać ją po powierzchni podczas dozowania żelu, aby utworzyć równomierną warstwę. Dla płytek 96-dołkowych umieścić końcówkę pipety w centrum dołka, utrzymując kontakt z powierzchnią, i dozować żel centralnie, aby zachować strukturę kopuły. Unikać wprowadzania powietrza do żelu, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków.</li>
		<li>Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez 60 min, aby umożliwić całkowitą polimeryzację. 
		UWAGA: Opisane tutaj warunki polimeryzacji zostały zoptymalizowane dla formatów hodowli użytych w tym badaniu. W zależności od geometrii naczynia hodowlanego, objętości hydrożelu i warunków inkubacji mogą być wymagane niewielkie korekty czasu polimeryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla i utrzymanie
	<ol>
		<li>Dodać uprzednio ogrzane MEGM do każdego dołka. Dostosować objętość do zastosowanego formatu hodowli.</li>
		<li>Delikatnie oddzielić hydrożel od powierzchni hodowlanej za pomocą końcówki pipety, aby żel mógł pływać. Przesunąć końcówkę pipety wzdłuż obwodu żelu i delikatnie podnieść zpolymeryzowany hydrożel, aby uwolnić go z powierzchni.</li>
		<li>Wymieniać MEGM dwa razy w tygodniu na świeżą, ogrzaną pożywkę. Utrzymywać hodowle w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez około 3–4 tygodnie i zakończyć hodowlę przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Zapadnięte hydrożele rozpoznaje się po pojawieniu się gęstych, nieprzezroczystych struktur przypominających zatyczki, będących wynikiem rozległego przerostu komórkowego wewnątrz żelu (patrz reprezentatywne przykłady na Rysunku uzupełniającym 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rauner G, Gupta PB, Kuperwasser C. From 2D to 3D and beyond: the evolution and impact of in vitro tumor models in cancer research. Nat Methods. 2025;22:1776-87.</li>
	<li>Traugh N, et al. Immune-epithelial interactions via TGF-&#946; orchestrates stem-cell niche formation and morphogenesis [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.1101/2025.05.22.655596. 2025.</li>
	<li>Rauner G, et al. Single-cell organogenesis captures complex breast tissue formation in 3D. Development. 2025. Available from: https://doi.org/10.1242/dev.204813.</li>
	<li>Trepicchio C, et al. DDR1 regulates RUNX1-CBF&#946; to control breast stem cell differentiation [Preprint]. bioRxiv. 2024. Available from: https://doi.org/10.1101/2024.02.21.581255.</li>
	<li>Rauner G, et al. Breast tissue regeneration is driven by cell-matrix interactions coordinating multi-lineage stem cell differentiation through DDR1. Nat Commun. 2021;12:7116.</li>
	<li>Schedin P, Keely PJ. Mammary gland ECM remodeling, stiffness, and mechanosignaling in normal development and tumor progression. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011;3:a003228.</li>
	<li>Fata JE, Werb Z, Bissell MJ. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 2004;6:1-11.</li>
	<li>Sokol ES, et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Res. 2016;18:19.</li>
	<li>Parrish M, et al. Environmental chemical mixtures reprogram mammary epithelial development to epigenetic states associated with breast cancer [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.64898/2026.04.01.715968. 2026.</li>
	<li>Stingl J, Emerman JT, Eaves CJ. Enzymatic dissociation and culture of normal human mammary tissue to detect progenitor activity. Methods Mol Biol. 2005;290:249-63.</li>
	<li>Antoine EE, Vlachos PP, Rylander MN. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20:683-96.</li>
	<li>Ngo P, Ramalingam P, Phillips JA, Furuta GT. Collagen gel contraction assay. Methods Mol Biol. 2006;341:103-9.</li>
	<li>Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.</li>
	<li>Linnemann JR, Meixner LK, Miura H, Scheel CH. An organotypic 3D assay for primary human mammary epithelial cells that recapitulates branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 2017;1612:125-37.</li>
	<li>Bonnans C, Chou J, Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:786-801.</li>
	<li>Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 2009;326:1216-9.</li>
	<li>Hughes CS, Postovit LM, Lajoie GA. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 2010;10:1886-90.</li>
	<li>Sokol ES, et al. Perturbation-expression analysis identifies RUNX1 as a regulator of human mammary stem cell differentiation. PLoS Comput Biol. 2015;11:e1004161.</li>
</ol>

C.K. jest współzałożycielem i konsultantem Naveris.

Opisany protokół umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy sutka3. Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu tej metody. Po pierwsze, przetwarzanie tkanki i enzymatyczne dysocjacja muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka, jednocześnie minimalizując nadmierną trawienie, co może zmniejszyć wydajność komórek i zaburzyć późniejszą morfogenezę<sup class="xre...

Zrozumienie rozwoju ludzkiego gruczołu piersiowego oraz wczesnych zdarzeń predysponujących tkankę do transformacji nowotworowej wymaga systemów eksperymentalnych, które wiernie odtwarzają architekturę tkanki, hierarchię komórkową i sygnalizację mikrośrodowiskową. Choć dwuwymiarowe hodowle nabłonkowe dostarczyły istotnych informacji mechanistycznych, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji i morfogenezy nabłonka1. Istniejące systemy hodowli trójwymiarowych, w tym te oparte na ekstraktach błony podstawnej, przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, lecz pozostają ograniczone przez zmienny skład, niepełną kontrolę nad składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz niespójne wsparcie dla wyższego rzędu architektury tkankowej1. Ponadto wiele systemów organoidowych opartych na ekstraktach błony podstawnej jest ograniczonych przez brak zdolności do spójnego wspierania powstawania organizacji przypominającej tkankę1. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych komponentach zrębu, zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspierających mikrośrodowisk, co ogranicza ich zdolność do modelowania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych, które są kluczowe dla rozwoju tkanki i chorób. Ograniczenia te utrudniają powtarzalne badanie procesów rozwojowych, plastyczności nabłonka oraz wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanki.
Aby wyeliminować te ograniczenia, opracowaliśmy zdefiniowany trójwymiarowy model organoidów piersi ludzkiej oparty na hydrożelu, który umożliwia pierwotnym komórkom nabłonkowym tworzenie zorganizowanych struktur wewnątrz zdefiniowanej macierzy pozakomórkowej2,3,4,5,8. Hydrożel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego – składników wybranych na podstawie ich uznanej roli w rozwoju gruczołu piersiowego i morfogenezie nabłonka. Cząsteczki macierzy pozakomórkowej te wiążą się z odrębnymi receptorami komórkowymi, w tym z integrynami, receptorami domeny discoidyny, CD44 i RHAMM, a według znanych danych regulują polarność nabłonka, morfogenezę rozgałęzień, utrzymanie komórek macierzystych, mechanotransdukcję i organizację tkanki w gruczole piersiowym6,7. Poprzednie badania opisujące ten system hydrożelowy wykazały, że włączenie tych składników macierzy pozakomórkowej znacznie poprawia morfogenezę przewodowo-płacikową i dojrzewanie nabłonka w porównaniu z warunkami opartymi wyłącznie na kolagenie lub Matrigelu3,8. Ponadto właściwości fizyczne tej formulacji hydrożelu zostały wcześniej scharakteryzowane za pomocą mikroskopii sił atomowych, co wykazało, że kompozytowy hydrożel macierzy pozakomórkowej charakteryzował się niższą sztywnością i zwiększonym pęcznieniem w stosunku do żeli zawierających tylko kolagen (moduł Younga: 256,7 ± 20,0 Pa versus 559,2 ± 204,0 Pa), co jest zgodne z miększym i bardziej uwodnionym środowiskiem macierzy8.
Co istotne, model ten wspiera powstawanie przedziału przypominającego mezenchymę, który rozwija się obok struktur nabłonkowych, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnałowe, które dokładniej odzwierciedla organizację tkanki natywnej3. Relewantność fizjologiczną tego systemu hydrożelowego oceniono poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigelu, wykorzystując analizy morfologiczne i transkryptomiczne. Wcześniejsze badania wykazały, że kultury w hydrożelu wspierały tworzenie bardziej zorganizowanej tkanki przewodzikowo-płacowej oraz różnicowanie wieloliniowe niż kultury oparte na Matrigelu, zachowując jednocześnie odpowiedź hormonalną8. Niedawno przeprowadzone zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, porównujące organoidy pochodzące z hydrożelu, organoidy hodowane w Matrigelu oraz pierwotną tkankę piersi człowieka, wykazały, że organoidy hodowane w hydrożelu wierniej odtwarzają hierarchię nabłonkową, różnorodność komórkową oraz interakcje nabłonkowo-mezenchymalne występujące w natywnej tkance piersi człowieka3. W przeciwieństwie do nich, organoidy hodowane w Matrigelu były wzbogacone o proliferujące hybrydowe stany podstawne i pozbawione populacji przypominających stromę, co jest zgodne z procesem samoorganizacji nabłonka, a nie ukierunkowanej organogenezy.
Protokół opisany w niniejszym opracowaniu przedstawia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidów z pierwotnej tkanki ludzkiej, z opcjonalnymi etapami usuwania fibroblastów oraz dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ platforma ta jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem wysokotreściowym (high-content imaging), ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek oraz badaniami nad perturbacjami genetycznymi, może być ona integrowana z późniejszymi podejściami oceniającymi liczbę, wielkość, architekturę i dynamikę wzrostu organoidów. Platforma ta stanowi zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju ludzkiej piersi, plastyczności nabłonka, oddziaływań między nabłonkiem a mikrośrodowiskiem oraz odpowiedzi na poziomie tkankowym na perturbacje rozwojowe, molekularne lub środowiskowe.
Schematyczny przegląd procesu roboczego, obejmujący obróbkę tkanek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, progresję rozwojową oraz analizy końcowe, przedstawiono na Ryc. 1, natomiast reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych przy użyciu tej platformy pokazano na Ryc. 2.
<img alt="Schemat przetwarzania tkanki piersi i hodowli organoidów, obejmujący etapy przygotowania hydrożelu i analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig1.jpg" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd schematu generowania organoidów w oparciu o hydrożel. (A) Schemat blokowy podsumowujący przebieg protokołu, obejmujący pobieranie tkanki, przetwarzanie tkanki, kriokonserwację, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, rozwój organoidów oraz późniejsze zastosowania analityczne. (B) Schemat wizualny przedstawiający główne etapy protokołu generowania organoidów w oparciu o hydrożel, w tym przetwarzanie i przygotowanie tkanki, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek oraz przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie morfologii guza piersi i normalnej tkanki piersi, obraz mikroskopowy; gruczoł ślinowy, komórki nerek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig2.jpg" data-altupdatedat="1790654420000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych w zdefiniowanym systemie hydrożelowym. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów pochodzących z różnych tkanek ludzkich hodowanych w zdefiniowanej macierzy hydrożelowej. Organoidy piersi wytworzone z pojedynczych komórek nabłonkowych pochodzących z redukcyjnej plastyki piersi obrazowano w 21. dniu hodowli. Organoidy typu ksenoprzeszczep pochodzenia pacjenta wytworzone z fragmentów guza obrazowano w 16. dniu hodowli. Organoidy gruczołu ślinowego wytworzone z fragmentów nabłonka obrazowano w 3. dniu hodowli. Organoidy nerek wytworzone z fragmentów nabłonka obrazowano w 17. dniu hodowli. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>Sterile tubes for tissue processing and centrifugation</td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td>Filtration device for single-cell suspension preparation</td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer for low volumes</td><td>Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Filtration device for single-cell suspension preparation</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Device used to count cells and determine viability</td></tr><tr><td>Bovine pituitary extract</td><td>Thermo Scientific</td><td>13028014</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Cell counting slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Dual-chamber slides used for cell counting</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes. </td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Millipore Sigma</td><td>08-115</td><td>Extracellular matrix protein used for hydrogel formation</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088793001</td><td>Enzyme used for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Corning</td><td>976171</td><td>Sterile vials for cryogenic storage of samples</td></tr><tr><td>Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)</td><td>Corning</td><td>354104 354108 3603</td><td>Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>317275</td><td>Cryoprotectant used in freezing medium</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Enzyme used for secondary tissue dissociation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>Enzyme used during cell dissociation.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>Serum supplement used in wash and neutralization media</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>Extracellular matrix protein component</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Hyaluronic acid</td><td>Millipore Sigma</td><td>385908</td><td>Extracellular matrix component for hydrogel formulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Enzyme used for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3598</td><td>Device used for tissue culture incubation</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Extracellular matrix protein component</td></tr><tr><td>Mammary epithelial basal medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>M171500</td><td>Growth medium for epithelial cells</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451</td><td>Tubes used for small-volume reactions</td></tr><tr><td>Orbital rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>400110</td><td>Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation</td></tr><tr><td>P1000 pipette</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td>Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 &mu;L</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Buffer solution used for washing and rinsing</td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML303E</td><td>Balance used for tissue weighing</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Nunc</td><td>170356N</td><td>Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (1 N)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS261</td><td>Reagent used for collagen neutralization</td></tr><tr><td>Sterile scalpels</td><td>Bard-Parker</td><td>372615</td><td>Tools used for mechanical tissue mincing</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Dye used for cell viability assessment</td></tr><tr><td>Trypsin (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Enzymatic reagent used for cell dissociation</td></tr><tr><td>Water bath (37 &deg;C)</td><td>VWR</td><td>10LA</td><td>Device used for controlled thawing of samples</td></tr></tbody></table>

zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

A Defined Hydrogel-Based Method For Generating Three-Dimensional Human Breast Organoids That Recapitulate Mammary Morphogenesis

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich systemów modelowych, które odzwierciedlają architekturę tkanki i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje głównym wyzwaniem w badaniach nad rozwojem piersi i wczesnymi zdarzeniami w karcynogenezie. Konwencjonalne dwuwymiarowej kultury i wiele trójwymiarowych systemów nie są w stanie uchwycić organizacji strukturalnej i mikrośrodowiskowych wskazówek, które definiują ludzką gruczoł piersiowy. Przedstawiamy tutaj metodę, która umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych organizmów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej składającej się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowskiego. System ten wspiera przejście pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy sutka, w tym ekspansję przodków, układanie nabłonka i tworzenie struktur podobnych do końcowych jednostek pęcherzykowo-kanalikowych, a także pojawienie się mezenchymalnego przedziału, w okresie 21 dni kultury. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania hydrożelu, wysiewu komórek oraz warunków kultury. Metoda ta jest zgodna z wysoko zawartościowym obrazowaniem i ilościową analizą liczby organizmów, rozkładu wielkości i złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia badania mechanistyczne nad plastycznością nabłonkową i zaburzeniami środowiskowymi, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanki związanych z ryzykiem raka piersi.

Skuteczna realizacja tego protokołu skutkuje tworzeniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonkową i cechy architektoniczne specyficzne dla tkanki. Organoidy zaczynają tworzyć się w ciągu 3–7 dni po posadzeniu i nadal rozwijają się przez cały okres kultury. Wcześniejsza charakterystyka tego układu organoidalnego w żelu wykazała powtarzalne tworzenie się organoidów w wielu niezależnych pierwotnych ludzkich dawczyń3. W tym badaniu oceniono pierwotne k...

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

The development of physiologically relevant human model systems that recapitulate tissue architecture and cell-state dynamics remains a major challenge in ...

Nasze badania koncentrują się na rozwoju i laktacji ludzkiej piersi, organizacji tkanek, ekspozycjach środowiskowych oraz czynnikach genetycznych prowadzących do zmian biologicznych w nowotworach. Istniejące modele w sposób niedokładny oddają architekturę ludzkiej tkanki piersi, czas rozwoju oraz mikrośrodowisko. Niniejszy protokół stanowi pomost między modelami 2D a modelami zwierzęcymi w systemie ludzkim.Należy pozyskać strawaną tkankę piersi ludzkiej, która była kriokonserwowana przez co najmniej 24 godziny. Natychmiast zanurzyć fiolkę kriogeniczną z zakrętką w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i szybko rozmrozić przez jedną minutę, aby zminimalizować śmierć komórek. Po całkowitym rozmrożeniu przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki do wzrostu nabłonka gruczołu mlekowego (MEGM) i wirować z prędkością 250g przez pięć minut.Po odlaniu nadsączu, zawiesić osad w 500 µL uprzednio podgrzanego do 37 °C roztworu enzymu dysocjującego zawierającego 0,25% trypsyny. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Za pomocą pipety P1000 poddać próbkę trituracji 20 razy, aby wspomóc dysocjację.Inkubować probówkę w

a-defined-hydrogel-based-method-for-generating-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym hydrożelu. Technika ta odtwarza morfogenezę sutka i umożliwia badanie plastyczności nabłonkowej oraz wczesnych etapów karcynogenezy.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka (Wideo) | JoVE Journal

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Przeglądaj więcej filmów