ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z ogromnym wdzięcznością dziękujemy Karli Murga, Danieli Requena i Megan Maloney z Tufts Biomedical Repository za wsparcie w zakresie tkanek. Badania te były wspierane przez Fundację Find The Cause Breast Cancer oraz Nagrodę NIH Clinical and Translational Science Award (UM1TR0043, G.R.) nadaną przez Tufts CTSI.

Tkanki pierwotne, które w przeciwnym razie zostałyby utylizowane jako odpady medyczne po operacjach, pozyskano zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi przepisami, stosując protokoły zatwierdzone przez komisje bioetyczne (institutional review boards) w Maine Medical Center oraz Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały zanonimizowane przed przekazaniem, co uniemożliwiło powiązanie ich z konkretnymi pacjentami. Z tego powodu badanie to otrzymało status zwolnienia z nadzoru od Komitetu ds. Wykorzystania Ludzi jako Obiektów Doświadczalnych (Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects) w Massachusetts Institute of Technology oraz w Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci objęci badaniem podpisali formularz świadomej zgody, wyrażając zgodę na udział w badaniu oraz na publikację jego wyników.
1. Obróbka i przygotowanie tkanek
UWAGA: Wszystkie procedury z wykorzystaniem tkanek ludzkich należy przeprowadzać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi biobezpieczeństwa i etyki. Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się ze schematami przepływu pracy przedstawionymi na Rysunku 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd kroków protokołu i procesu przygotowania organoidów.
<ol>
	<li>Przygotować MEGM, używając podstawowej pożywki dla nabłonka gruczołu mlekowego uzupełnionej o 52 µg/mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ng/mL ludzkiego czynnika wzrostu naskórka, 5 µg/mL insuliny, 500 ng/mL hydrokortyzonu, 1% (v/v) GlutaMAX oraz 1% (v/v) Antibiotic-Antimycotic (100X).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do dysocjacji, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) oraz 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do pożywki wzrostowej dla nabłonka gruczołu mlekowego (MEGM).</li>
	<li>Otrzymać ludzką tkankę piersi pozyskaną z profilaktycznych mastektomii i plastyk redukcyjnych w ciągu 24 h od wycięcia, niefiksowaną, w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i utrzymywaną w temperaturze 4°C. Zważyć tkankę na wadze precyzyjnej, aby określić całkowitą masę tkanki.</li>
	<li>Umieścić tkankę w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o rozmiarze 3–5 mm3 za pomocą sterylnych skalpeli. Przenieść około 2–3 g rozdrobnionej tkanki do stożkowatej probówki o pojemności 15 mL. Do każdej probówki dodać 10 mL pożywki do dysocjacji.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 37°C na rotatorze orbitalnym przy prędkości 8 rpm przez 12–18 h w celu enzymatycznego strawienia tkanki. Uznać trawienie za zakończone, gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanki, a w całej pożywce widoczna będzie jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału.</li>
	<li>Pozostawić fragmenty nabłonka do osadzenia się pod wpływem grawitacji przez 5 min. Potwierdzić, że w pożywce nie pozostały widoczne fragmenty w zawiesinie i że obecny jest wyraźny osad. Ostrożnie zdekantować i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu. 
	UWAGA: Nadsącz zawiera komórki zrębu i komponenty macierzy; może zostać przemyty i wykorzystany lub zachowany do innych badań.</li>
	<li>Resuspendować osad w 10 mL pożywki płuczącej składającej się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS. Wirować przy 250 × g przez 5 min w wirówce z koszykiem wahadłowym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórzyć etap płukania jeszcze trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny i wolny od widocznych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Resuspendować końcowy osad w pożywce do mrożenia składającej się z 10% dimetylosulfoksydu (DMSO) w MEGM w objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki. 
	OSTROŻNIE: DMSO jest szkodliwy w przypadku kontaktu ze skórą lub inhalacji. Należy posługiwać się odpowiednimi środkami ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem chemicznym, jeśli wymagają tego wytyczne instytucjonalne.</li>
	<li>Rozdzielić zawiesinę po 1 mL do każdej krioprobówki. Umieścić krioprobówki w temperaturze −80°C w pojemniku do mrożenia przed długoterminowym przechowywaniem w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Ten etap stanowi punkt przerwania procedury. Próbki należy przechowywać w −80°C przed przeniesieniem do warunków długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>
2. Odzyskiwanie i opcjonalne przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Odmrażanie i wstępna regeneracja
	<ol>
		<li>Wyjąć kriokonserwowaną tkankę z przechowywania w −80°C po zamrożeniu przez co najmniej 24 h lub z długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Natychmiast zanurzyć krioprobówkę aż do zakrętki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrozić przez 1 min, aby zminimalizować śmierć komórek. 
		UWAGA: Podczas rozmrażania delikatnie potrząsać krioprobówką, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.</li>
		<li>Po całkowitym rozmrożeniu natychmiast przenieść zawartość krioprobówki do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL MEGM. Wirować przy 250 × g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalne usuwanie fibroblastów 
	UWAGA: Usuwanie fibroblastów metodą pre-platingu jest opcjonalnym etapem wzbogacania, stosowanym w celu redukcji szybko przylegających populacji stromy lub fibroblastów, gdy pożądana jest populacja startowa o większej zawartości komórek nabłonkowych. Krok ten nie jest wymagany do formowania organoidów i może być dostosowany w zależności od celu eksperymentu.
	<ol>
		<li>Resuspendować osad w 10 mL MEGM.</li>
		<li>Przenieść resuspendowaną tkankę do 10 cm szalki hodowlanej. Inkubować w 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez 90 min, aby umożliwić przyleganie fibroblastów. 
		UWAGA: Nie poruszać szalką hodowlaną podczas inkubacji, aby zapewnić efektywną adhezję fibroblastów.</li>
		<li>Zebrać nadosad zawierający nieprzylegające komórki za pomocą pipety serologicznej 10 mL, delikatnie przechylając szalkę hodowlaną pod kątem około 45°. Delikatnie wypłukać szalkę 5 mL PBS i połączyć płukaninę z zebranym nadosadem.</li>
		<li>Wirować połączoną zawiesinę przy 250 × g przez 5 min, aby odzyskać materiał wzbogacony w komórki nabłonkowe. 
		UWAGA: Komórki, które przylgnęły do szalki, są wzbogacone w fibroblasty gruczołu mlekowego i mogą być namnażane oddzielnie poprzez dodanie medium składającego się z DMEM + 10% FBS i antybiotyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalna dysocjacja do pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Resuspendować osad w 500 µL uprzednio ogrzanego (37°C) roztworu enzymu dysocjującego składającego się z 0,25% trypsyny. Alternatywne odczynniki dysocjujące mogą wymagać optymalizacji. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Triturować próbkę 20 razy za pomocą pipety P1000, aby wspomóc dysocjację. 
		OSTROŻNIE: Odczynniki do dysocjacji enzymatycznej mogą być szkodliwe. Należy z nich korzystać, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej i unikając kontaktu ze skórą lub oczami.</li>
		<li>Inkubować probówkę w 37°C przez 3–5 min. Natychmiast po inkubacji przeprowadzić dysocjację mechaniczną próbki poprzez triturowanie 20 razy za pomocą pipety P1000.</li>
		<li>Dodać 1 mL medium płuczącego zawierającego surowicę, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną. Wirować przy 500 × g przez 5 min.</li>
		<li>Resuspendować osad w 300 µL roztworu dyspazy (5 U/mL) i 30 µL roztworu DNazy (1 mg/mL). Inkubować w 37°C przez 3–5 min.</li>
		<li>Przeprowadzić dysocjację mechaniczną próbki poprzez pipetowanie 15–20 razy. Dodać do zawiesiny 700 µL medium płuczącego zawierającego surowicę.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm do czystej probówki. Można użyć standardowego sitka komórkowego 40 µm lub sitka w końcówce pipety Flowmi. Sitka Flowmi mogą ograniczyć utratę próbki przy pracy z ograniczoną liczbą komórek.</li>
		<li>Określić liczbę żywych komórek metodą wykluczania trypan blue. Wymieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z trypan blue w stosunku 1:1 i nanieść 10 µL mieszaniny do komory licznikowej lub na szkiełko do liczenia. Określić żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
		<li>Wirować zawiesinę przy 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Resuspendować osad komórkowy w MEGM do pożądanej koncentracji do siewu w hydrożelu. 
		UWAGA: W eksperymentach z siewem pojedynczych komórek typowa liczba komórek wynosi od około 1 000 do 5 000 komórek na 200 µL hydrożelu, w zależności od celu eksperymentu i charakterystyki próbki dawcy. Niższe gęstości siewu są zazwyczaj stosowane w badaniach obrazowania na żywo i morfogenezy, aby ułatwić śledzenie rozwoju poszczególnych organoidów, natomiast wyższe gęstości są powszechnie stosowane w końcowych analizach molekularnych, w tym do pozyskiwania RNA i białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów zapasów i obliczenia objętości
	<ol>
		<li>Przed użyciem umieścić na lodzie roztwór lamininy (1,18 mg/mL), roztwór kwasu hialuronowego (1 mg/mL w sterylnej wodzie), roztwór fibronektyny (2 mg/mL w sterylnej wodzie) oraz PBS 1×. Alikwoty lamininy i fibronektyny przechowywać w temperaturze −80°C, a roztwór kwasu hialuronowego w temperaturze 4°C. Zamrożone komponenty rozmrażać powoli na lodzie w temperaturze 0°C–4°C przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować 25-krotny roztwór zapasowy suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przygotować 1 mL, połączyć w probówce utrzymywanej na lodzie 425 µL lamininy, 250 µL kwasu hialuronowego, 250 µL fibronektyny i 75 µL PBS. Wymieszać delikatnie, odwracając probówkę 3–4 razy. Przechowywać roztwór w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc.</li>
		<li>Przed przygotowaniem określić pożądaną końcową objętość i skład hydrożelu. Przygotować co najmniej 20% nadmiaru objętości, aby uwzględnić straty materiału podczas pipetowania i przenoszenia. 
		UWAGA: Formuła hydrożelu składa się z kolagenu I, końcowego 1-krotnego stężenia suplementów macierzy zewnątrzkomórkowej (z zapasu 25×) oraz 12,5% (v/v) 0,1 N wodorotlenku sodu w stosunku do objętości kolagenu I w celu neutralizacji pH i polimeryzacji. 
		UWAGA: Końcowe stężenia w hydrożelu to: 1,7 mg/mL kolagenu I, 20 µg/mL lamininy, 20 µg/mL fibronektyny i 10 µg/mL kwasu hialuronowego.</li>
		<li>Obliczyć wymaganą objętość kolagenu I (Vcollagen) korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór wolumetryczny na stężenie kolagenu, Vcollagen= (Cfinal×Vtotal)/Cstock, w obliczeniach." src="/files/ftp_upload/71831/71831eq1.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
		Gdzie Cfinal = 1,7 mg/mL, Vtotal  to pożądana końcowa objętość hydrożelu, a Cstock to stężenie roztworu zapasowego kolagenu. Stosować stężenia zapasowe kolagenu w zakresie 2–12 mg/mL. 
		UWAGA: Stężenie zapasowe kolagenu może różnić się między partiami. Wyższe stężenia zwiększają lepkość i wymagają powolnego pipetowania.</li>
		<li>Obliczyć objętość 0,1 N wodorotlenku sodu (VNaOH) korzystając z następującego wzoru: 
		VNaOH = 0,125 x Vcollagen 
		Przygotować roboczy roztwór 0,1 N wodorotlenku sodu poprzez rozcieńczenie 1 N wodorotlenku sodu w sterylnej wodzie.</li>
		<li>Obliczyć objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej (VES) korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie stanu równowagi: \( V_{ES} = \frac{V_{total}}{25} \); wzór algebraiczny." src="/files/ftp_upload/71831/71831eq2.jpg" style="margin:auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Obliczyć pozostałą objętość do uzupełnienia pożywką wzrostową korzystając z następującego wzoru: 
		Vgrowth medium = Vtotal - (Vcollagen + VNaOH + VES + Vcells/tissue) 
		UWAGA: Objętość komórek lub fragmentów tkanki określać indywidualnie dla każdego eksperymentu. Stosować typowy zakres 10–100 µL w ramach dopuszczalnej objętości. Nie wykonuje się precyzyjnego liczenia fragmentów, ponieważ ich wielkość i skład znacząco różnią się między preparatami. Standaryzować wysiew poprzez wizualną ocenę liczby i rozmieszczenia fragmentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie głównej mieszaniny (Master Mix) hydrożelu
	<ol>
		<li>Umieścić kolagen I, suplement macierzy zewnątrzkomórkowej, wodorotlenek sodu (0,1 N) i pożywkę wzrostową na lodzie w temperaturze 0°C–4°C. Wszystkie komponenty utrzymywać w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość kolagenu I do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość uprzednio schłodzonej pożywki wzrostowej do roztworu kolagenu.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość 0,1 N wodorotlenku sodu w celu zneutralizowania roztworu. 
		UWAGA: Poprzednia optymalizacja wykazała, że warunki te zapewniają odpowiednie pH żelu; w związku z czym rutynowe badanie pH mieszaniny hydrożelu nie jest wymagane. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywać szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.</li>
		<li>Wymieszać roztwór, energicznie potrząsając probówką z częstotliwością około jednego wstrząśnięcia na sekundę przez co najmniej 6 wstrząśnięć.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej do mieszaniny.</li>
		<li>Dodać obliczoną objętość pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki, używając pipety P1000 lub końcówki do pipety o szerokim wylocie. Wymieszać natychmiast poprzez potrząsanie, zgodnie z opisem w kroku 3.2.5, i niezwłocznie przejść do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakładanie hydrożelu
	<ol>
		<li>Nanieść mieszaninę hydrożelu do naczyń hodowlanych w pożądanej objętości na dołek. Stosować 200 µL hydrożelu na dołek dla szkiełek z komorami 4-dołkowymi, 100 µL na dołek dla szkiełek 8-dołkowych i 20 µL na dołek dla płytek 96-dołkowych.</li>
		<li>W przypadku szkiełek z komorami rozprowadzić hydrożel w postaci cienkiej warstwy na całej powierzchni. Umieścić końcówkę pipety na środkowej górnej krawędzi dołka komory i przesuwać ją po powierzchni podczas dozowania żelu, aby stworzyć równomierną warstwę. Dla płytek 96-dołkowych umieścić końcówkę pipety w centrum dołka, utrzymując kontakt z powierzchnią, i dozować żel centralnie, aby zachować strukturę kopuły. Unikać wprowadzania powietrza do żelu, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków.</li>
		<li>Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 przez 60 min, aby umożliwić pełną polimeryzację. 
		UWAGA: Opisane tutaj warunki polimeryzacji zostały zoptymalizowane dla formatów hodowli użytych w niniejszym badaniu. W zależności od geometrii naczynia hodowlanego, objętości hydrożelu i warunków inkubacji mogą być wymagane niewielkie korekty czasu polimeryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla i utrzymanie
	<ol>
		<li>Dodać uprzednio ogrzaną pożywkę MEGM do każdego dołka. Dostosować objętość do zastosowanego formatu hodowli.</li>
		<li>Delikatnie oddzielić hydrożel od powierzchni hodowlanej za pomocą końcówki pipety, aby żel mógł unosić się w pożywce. Przesunąć końcówkę pipety wokół obwodu żelu i delikatnie podnieść polimeryzowany hydrożel, aby uwolnić go z powierzchni.</li>
		<li>Wymieniać MEGM dwa razy w tygodniu na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę. Utrzymywać hodowle w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ przez około 3–4 tygodnie i zakończyć hodowlę przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Zapadnięte hydrożele rozpoznawać po pojawieniu się gęstych, nieprzezroczystych struktur przypominających korki, wynikających z rozległego wzrostu komórkowego wewnątrz żelu (patrz reprezentatywne przykłady na Ryc. uzupełniającej 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rauner G, Gupta PB, Kuperwasser C. From 2D to 3D and beyond: the evolution and impact of in vitro tumor models in cancer research. Nat Methods. 2025;22:1776-87.</li>
	<li>Traugh N, et al. Immune-epithelial interactions via TGF-&#946; orchestrates stem-cell niche formation and morphogenesis [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.1101/2025.05.22.655596. 2025.</li>
	<li>Rauner G, et al. Single-cell organogenesis captures complex breast tissue formation in 3D. Development. 2025. Available from: https://doi.org/10.1242/dev.204813.</li>
	<li>Trepicchio C, et al. DDR1 regulates RUNX1-CBF&#946; to control breast stem cell differentiation [Preprint]. bioRxiv. 2024. Available from: https://doi.org/10.1101/2024.02.21.581255.</li>
	<li>Rauner G, et al. Breast tissue regeneration is driven by cell-matrix interactions coordinating multi-lineage stem cell differentiation through DDR1. Nat Commun. 2021;12:7116.</li>
	<li>Schedin P, Keely PJ. Mammary gland ECM remodeling, stiffness, and mechanosignaling in normal development and tumor progression. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011;3:a003228.</li>
	<li>Fata JE, Werb Z, Bissell MJ. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 2004;6:1-11.</li>
	<li>Sokol ES, et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Res. 2016;18:19.</li>
	<li>Parrish M, et al. Environmental chemical mixtures reprogram mammary epithelial development to epigenetic states associated with breast cancer [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.64898/2026.04.01.715968. 2026.</li>
	<li>Stingl J, Emerman JT, Eaves CJ. Enzymatic dissociation and culture of normal human mammary tissue to detect progenitor activity. Methods Mol Biol. 2005;290:249-63.</li>
	<li>Antoine EE, Vlachos PP, Rylander MN. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20:683-96.</li>
	<li>Ngo P, Ramalingam P, Phillips JA, Furuta GT. Collagen gel contraction assay. Methods Mol Biol. 2006;341:103-9.</li>
	<li>Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.</li>
	<li>Linnemann JR, Meixner LK, Miura H, Scheel CH. An organotypic 3D assay for primary human mammary epithelial cells that recapitulates branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 2017;1612:125-37.</li>
	<li>Bonnans C, Chou J, Werb Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:786-801.</li>
	<li>Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 2009;326:1216-9.</li>
	<li>Hughes CS, Postovit LM, Lajoie GA. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 2010;10:1886-90.</li>
	<li>Sokol ES, et al. Perturbation-expression analysis identifies RUNX1 as a regulator of human mammary stem cell differentiation. PLoS Comput Biol. 2015;11:e1004161.</li>
</ol>

C.K. jest współzałożycielem i konsultantem Naveris.

Opisany protokół umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy sutka3. Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu tej metody. Po pierwsze, przetwarzanie tkanki i enzymatyczne dysocjacja muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka, jednocześnie minimalizując nadmierną trawienie, co może zmniejszyć wydajność komórek i zaburzyć późniejszą morfogenezę<sup class="xre...

Zrozumienie rozwoju ludzkiego gruczołu mlekowego oraz wczesnych zdarzeń predysponujących tkankę do transformacji złośliwej wymaga systemów eksperymentalnych, które wiernie odwzorowują architekturę tkanki, hierarchię komórkową i sygnalizację mikrośrodowiskową. Chociaż dwuwymiarowe hodowle nabłonkowe dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji i morfogenezy nabłonka1. Istniejące trójwymiarowe systemy hodowli, w tym te oparte na ekstraktach z błony podstawnej, przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, lecz nadal są ograniczone przez zmienny skład, niepełną kontrolę nad składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz niespójne wsparcie dla wyższego rzędu architektury tkankowej1. Ponadto wiele systemów organoidowych opartych na ekstraktach z błony podstawnej jest ograniczone przez brak możliwości stałego wspierania wyłaniania się organizacji przypominającej tkankę1. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych komponentach zrębu, zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspomagających mikrośrodowisk, co ogranicza ich zdolność do modelowania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych, które są kluczowe dla rozwoju tkanek i chorób. Ograniczenia te utrudniają powtarzalne badanie procesów rozwojowych, plastyczności nabłonka oraz wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanki.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy zdefiniowany trójwymiarowy model organoidów ludzkiej piersi oparty na hydrożelu, który umożliwia pierwotnym komórkom nabłonkowym tworzenie zorganizowanych struktur w obrębie zdefiniowanej macierzy pozakomórkowej2,3,4,5,8. Hydrożel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego – komponentów wybranych na podstawie ich udokumentowanej roli w rozwoju gruczołu piersiowego oraz morfogenezie nabłonka. Cząsteczki macierzy pozakomórkowej oddziałują z odrębnymi receptorami komórkowymi, w tym z integrynami, receptorami domeny discoidin, CD44 oraz RHAMM, i wiadomo, że regulują one polaryzację nabłonka, morfogenezę rozgałęzioną, utrzymanie komórek macierzystych, mechanotransdukcję oraz organizację tkanki w gruczole piersiowym6,7. Wcześniejsze badania opisujące ten system hydrożelowy wykazały, że włączenie tych komponentów macierzy pozakomórkowej znacznie poprawiło morfogenezę przewodowo-płacikową oraz dojrzewanie nabłonka w porównaniu z warunkami opartymi wyłącznie na kolagenie lub Matrigelu3,8. Ponadto właściwości fizyczne tej formulacji hydrożelu zostały wcześniej scharakteryzowane za pomocą mikroskopii sił atomowych, wykazując, że kompozytowy hydrożel macierzy pozakomórkowej charakteryzował się niższą sztywnością i zwiększonym pęcznieniem w stosunku do żeli zawierających tylko kolagen (moduł Younga: 256.7 ± 20.0 Pa versus 559.2 ± 204.0 Pa, odpowiednio), co jest zgodne z miękkim i bardziej nawodnionym środowiskiem macierzy8.
Co istotne, model ten wspiera powstawanie przedziału przypominającego mezenchymę, który wyłania się obok struktur nabłonkowych, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnalizacyjne, które dokładniej odzwierciedla organizację tkanki natywnej3. Relewantność fizjologiczna tego systemu hydrożelowego została oceniona poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigelu, z wykorzystaniem analiz morfologicznych i transkryptomicznych. Wcześniejsze badania wykazały, że kultury hydrożelowe wspierały bardziej zorganizowane tworzenie tkanki przewodowo-płaczkowej oraz różnicowanie wieloliniowe niż kultury oparte na Matrigelu, zachowując jednocześnie odpowiedź na hormony8. Niedawno przeprowadzone zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, porównujące organoidy pochodzące z hydrożelu, organoidy hodowane na Matrigelu oraz pierwotną tkankę piersi człowieka, wykazały, że organoidy hodowane w hydrożelu bardziej wiernie odtwarzają hierarchię nabłonkową, różnorodność komórkową oraz oddziaływania nabłonkowo-mezenchymalne występujące w natywnej tkance piersi człowieka3. W przeciwieństwie do nich, organoidy hodowane na Matrigelu były wzbogacone o proliferacyjne hybrydowe stany podstawne i pozbawione populacji przypominających stromę, co jest spójne z samoorganizacją nabłonka, a nie z ukierunkowaną organogenezą.
Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidów z pierwotnej tkanki ludzkiej, z opcjonalnymi etapami usuwania fibroblastów oraz dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ platforma ta jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem wysokoprzepustowym (high-content imaging), ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek oraz badaniami nad zaburzeniami genetycznymi, może zostać zintegrowana z późniejszymi podejściami oceniającymi liczbę, wielkość, architekturę i dynamikę wzrostu organoidów. Platforma ta stanowi zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju ludzkiej piersi, plastyczności nabłonka, oddziaływań między nabłonkiem a mikrośrodowiskiem oraz reakcji na poziomie tkankowym na zaburzenia rozwojowe, molekularne lub środowiskowe.
Schematyczny przegląd przebiegu prac, obejmujący przetwarzanie tkanek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, postępy rozwojowe oraz analizy końcowe, przedstawiono na Rysunku 1, natomiast reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych przy użyciu tej platformy pokazano na Rysunku 2.
<img alt="Proces hodowli organoidów z tkanki piersi, schemat blokowy i diagram; przygotowanie komórek, hydrożel, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd schematu generowania organoidów w oparciu o hydrożel. (A) Schemat blokowy podsumowujący przebieg protokołu, obejmujący pobranie tkanki, przetwarzanie tkanki, krio konserwację, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, rozwój organoidów oraz późniejsze zastosowania analityczne. (B) Schemat wizualny przedstawiający główne etapy protokołu generowania organoidów w oparciu o hydrożel, w tym przetwarzanie i przygotowanie tkanki, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek oraz przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tkanki piersi, ślinianki i nerki pod mikroskopem; porównanie struktury komórek nowotworowych i prawidłowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71831/71831fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych w zdefiniowanym systemie hydrożelowym. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów pochodzących z różnych tkanek ludzkich hodowanych w zdefiniowanej macierzy hydrożelowej. Organoidy piersi wytworzone z pojedynczych komórek nabłonkowych pochodzących z redukcyjnej plastyki piersi zostały zobrazowane w 21. dniu hodowli. Organoidy ksenoprzeszczepów pochodzenia pacjenta wytworzone z fragmentów guza zostały zobrazowane w 16. dniu hodowli. Organoidy ślinianki wytworzone z fragmentów nabłonka zostały zobrazowane w 3. dniu hodowli. Organoidy nerek wytworzone z fragmentów nabłonka zostały zobrazowane w 17. dniu hodowli. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71831/71831fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>Sterile tubes for tissue processing and centrifugation</td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td>Filtration device for single-cell suspension preparation</td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer for low volumes</td><td>Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Filtration device for single-cell suspension preparation</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Device used to count cells and determine viability</td></tr><tr><td>Bovine pituitary extract</td><td>Thermo Scientific</td><td>13028014</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Cell counting slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Dual-chamber slides used for cell counting</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes. </td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Millipore Sigma</td><td>08-115</td><td>Extracellular matrix protein used for hydrogel formation</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088793001</td><td>Enzyme used for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Corning</td><td>976171</td><td>Sterile vials for cryogenic storage of samples</td></tr><tr><td>Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)</td><td>Corning</td><td>354104 354108 3603</td><td>Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>317275</td><td>Cryoprotectant used in freezing medium</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Enzyme used for secondary tissue dissociation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>Enzyme used during cell dissociation.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>Serum supplement used in wash and neutralization media</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>Extracellular matrix protein component</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Hyaluronic acid</td><td>Millipore Sigma</td><td>385908</td><td>Extracellular matrix component for hydrogel formulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Enzyme used for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3598</td><td>Device used for tissue culture incubation</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>Supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Extracellular matrix protein component</td></tr><tr><td>Mammary epithelial basal medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>M171500</td><td>Growth medium for epithelial cells</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451</td><td>Tubes used for small-volume reactions</td></tr><tr><td>Orbital rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>400110</td><td>Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation</td></tr><tr><td>P1000 pipette</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td>Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 &mu;L</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic supplement for epithelial cell media</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Buffer solution used for washing and rinsing</td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML303E</td><td>Balance used for tissue weighing</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Nunc</td><td>170356N</td><td>Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (1 N)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS261</td><td>Reagent used for collagen neutralization</td></tr><tr><td>Sterile scalpels</td><td>Bard-Parker</td><td>372615</td><td>Tools used for mechanical tissue mincing</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Dye used for cell viability assessment</td></tr><tr><td>Trypsin (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Enzymatic reagent used for cell dissociation</td></tr><tr><td>Water bath (37 &deg;C)</td><td>VWR</td><td>10LA</td><td>Device used for controlled thawing of samples</td></tr></tbody></table>

zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

A Defined Hydrogel-Based Method For Generating Three-Dimensional Human Breast Organoids That Recapitulate Mammary Morphogenesis

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich systemów modelowych, które odzwierciedlają architekturę tkanki i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje głównym wyzwaniem w badaniach nad rozwojem piersi i wczesnymi zdarzeniami w karcynogenezie. Konwencjonalne dwuwymiarowej kultury i wiele trójwymiarowych systemów nie są w stanie uchwycić organizacji strukturalnej i mikrośrodowiskowych wskazówek, które definiują ludzką gruczoł piersiowy. Przedstawiamy tutaj metodę, która umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych organizmów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej składającej się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowskiego. System ten wspiera przejście pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy sutka, w tym ekspansję przodków, układanie nabłonka i tworzenie struktur podobnych do końcowych jednostek pęcherzykowo-kanalikowych, a także pojawienie się mezenchymalnego przedziału, w okresie 21 dni kultury. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania hydrożelu, wysiewu komórek oraz warunków kultury. Metoda ta jest zgodna z wysoko zawartościowym obrazowaniem i ilościową analizą liczby organizmów, rozkładu wielkości i złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia badania mechanistyczne nad plastycznością nabłonkową i zaburzeniami środowiskowymi, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanki związanych z ryzykiem raka piersi.

Skuteczna realizacja tego protokołu skutkuje tworzeniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonkową i cechy architektoniczne specyficzne dla tkanki. Organoidy zaczynają tworzyć się w ciągu 3–7 dni po posadzeniu i nadal rozwijają się przez cały okres kultury. Wcześniejsza charakterystyka tego układu organoidalnego w żelu wykazała powtarzalne tworzenie się organoidów w wielu niezależnych pierwotnych ludzkich dawczyń3. W tym badaniu oceniono pierwotne k...

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

The development of physiologically relevant human model systems that recapitulate tissue architecture and cell-state dynamics remains a major challenge in ...

a-defined-hydrogel-based-method-for-generating-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Tufts University School of Medicine.  Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Przeglądaj więcej filmów