Sondowanie aktywności kompleksu mitochondrialnego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Mitochondria Odgrywają liczne role w fizjologii komórki, od metabolizmu i produkcji energii, przez programowanie śmierci komórki, po syntezę hormonów steroidowych. Pomimo znaczenia mitochondriów zarówno w podstawowych funkcjach komórkowych, jak i w chorobie, bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji mitochondriów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i ich zróżnicowanym potomstwie. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy mitochondriów łańcucha oddechowego ludzkich komórek macierzystych amry za pomocą testów aktywności Ingel.

Cześć, nazywam się Ivan OV i pracuję w laboratorium Michaela Tetela na Wydziale Patologii i Medycyny Laboratoryjnej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę oceny funkcji mitochondrialnego kompleksu oddechowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Procedura ta obejmuje izolację surowego podniebienia mitochondrialnego z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, oddzielenie kompleksów mitochondrialnych systemu fosforylacji wysiękowej za pomocą klarownej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wyższej rozdzielczości, a następnie aktywność żelu sa.

Więc zacznijmy. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyizolowanie mitochondriów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Do tego testu użyjemy ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które zostały wyhodowane na płytce pokrytej matryżelem w stanie wolnym od karmnika.

Aby pobrać mitochondria z naszych ludzkich komórek macierzystych amry, zaczynamy od umycia ich ciepłym XPDS pH 7,4, a następnie trypsynujemy komórki przez pięć minut. Możesz użyć jednego milila jednej x trypsyny na studzienkę na płytce z sześcioma dołkami. Po pięciu minutach możesz zatrzymać reakcję, dodając równą objętość świeżego inhibitora trypsyny po jednym miligramie promila do jednego XPBS i zbierając komórki.

Zebrane komórki są następnie wirowane w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i resus, zawieś granulowane komórki w 0,8 do 1,7 mililitra lodowatego buforu do izolacji mitochondriów ze świeżo przygotowanym koktajlem jednego x inhibitora proteazy. To, ile bufora użyjesz, zależy od wielkości otrzymanej osadki komórkowej Po ponownym zawieszeniu osadu inkubuj go na lodzie przez około 10 minut.

Po inkubacji na komórkach za pomocą homogenizatora, może to zająć około 40 do 50 uderzeń. Możemy sprawdzić pełną listę homogenizacji, barwiąc podwielokrotność komórek DOD błękitem trianowym i patrząc przez mikroskop świetlny. Powinno to wyglądać mniej więcej tak.

Jest to pierwszy strzał po 50 uderzeniach z upadkiem. Jest to drugi strzał po 80 uderzeniach z upadkiem. Gdy komórki zostaną zhomogenizowane, odwiruj je w temperaturze 20 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni C. To da nam surowy mito-konspiralny osad, który będzie zawierał również jądra i większe fragmenty komórek.

Przed zebraniem osadu musimy zważyć probówkę zbiorczą w celu oszacowania późniejszej masy osadu, wylać i wyrzucić supernatant, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Odejmując w tym momencie wagę tuby, można przejść do solubilizacji granulki, co zostanie pokazane w następnym kroku. Aby rozpuścić surowy osad mitochondrialny, zaczynamy od trzymania osadu na lodzie i wirowania za pomocą 35 mikrolitrów lodowatego buforu do rozpuszczania.

Na każde 20 miligramów osadu, który posiadamy, szczegółowe informacje na temat związków buforowych są wymienione w dołączonym pisemnym protokole. Po wirowaniu i dodaniu buforu do rozpuszczania, a przed dodaniem toiny cyfrowej, przenosimy zawieszony osad do probówki odpowiedniej do wirowania z dużą prędkością, a następnie dodajemy 20 mikrolitrów 10% wagi na objętość cyfry toiny na 20 miligramów masy osadu i mieszamy, przesuwając rurkę po jej dokładnym wymieszaniu, inkubujemy osad mitochondrialny przez pięć do 10 minut na lodzie. Doil beta D multiside lub DDM lub Triton X 100 można zastąpić toinę cyfrową do rozpuszczonych białek.

Wybór detergentu i jego ilość mogą mieć wpływ na powstawanie kompleksów supra lub multimerycznych form kompleksów mitochondrialnych po inkubacji na lodzie. A kiedy osad zostanie rozpuszczony, odwirujemy go z prędkością stu tysięcy razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni C, a następnie zbierzemy klarowny supernatant. Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania supernatantu do pracy na naszym gradientowym żelu do natywnej gradientowej elektroforezy żelowej mitochondriów.

Zalecamy stosowanie gradientowego żelu akrylowego od pięciu do 13% z żelem do układania w stos 3,5%. Do przygotowania żelu użyjemy mieszanki akrylamidu i akrylamidu zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Roztwór akryloamidu bis akrylamidu przygotowuje się wcześniej i przechowuje w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemnym miejscu.

Akrylamid i bis akryloamid są toksycznymi chemikaliami zarówno w postaci proszku, jak i płynu, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę podczas pracy z nimi. Łączymy roztwór akryloamidu bis akryloamidu z podwielokrotnością trzech x buforu żelowego składającego się z 1,5 molowego sześcioma aminoheksa-kwasów noinowych i 75 milimolowego ole o pH 7,0. Ilość roztworu akryloamidu i akrylamidu, którą dodamy do buforu, będzie zależeć od procentowej zawartości żelu, którą wytwarzamy, aby uzyskać żel gradientowy.

Zrobimy jeden 4% mix i jeden 13% mix, a żel do układania będzie 3,5% mixem. Nie zapomnij dodać glicerolu do 13%mieszanki. Gdy wszystkie trzy mieszaniny są gotowe, dodajemy do mieszanin odpowiednią ilość amonu na siarczan i temid i wlewamy mieszaniny do komory odlewniczej z gradientem.

W lewej części komory znajduje się 5% mieszanki. W prawej części komory znajduje się 13% mieszanka w małym mieszadle magnetycznym. Wlewanie żelu zaczynamy od otwarcia prawej części komory.

Następnie natychmiast otwieramy lewą część komory i pozwalamy, aby 5% roztwór zmieszał się z 13% roztworem, aby uzyskać gradient. Na wierzch żelu dodajemy niewielką ilość izopropanolu, aby po polimeryzacji utworzyć ostrą prostą obwódkę żelu. Około godzinę później, gdy polimeryzacja żelu gradientowego jest zakończona, usuwamy izopropanol i wlewamy żel do układania 3,5 do aparatu i wkładamy grzebień żelowy.

Żele zmontujemy i uruchomimy w chłodni o temperaturze około czterech do siedmiu stopni Celsjusza. Aby uruchomić ten żel, będziemy używać dwóch różnych. W komorze anodowej użyjemy buforu zawierającego 25-milimolowy kwas solny o pH 7,0.

Bufor katodowy będzie zawierał 50 milimetrów tric, 7,5 milimolowego ole kwasu solnego, 0,02% masy na objętość, doil beta D multiside lub DDM i 0,05% masy do objętości, deoxycoate pH 7,0. W celu przygotowania supernatantu do uruchomienia w żelu, który właśnie rozlaliśmy, dodaje się bufor ładujący, aby uzyskać końcowe stężenie 5% wagowo glicerolu do objętości i 0,01% wagowo do objętości. Ponto S, zazwyczaj dodajemy 10 x roztwór podstawowy zawierający glicerol i poncho bezpośrednio do supernatantów.

Teraz jesteśmy gotowi do załadowania próbki żelu na żel. Załadujemy do studzienek żelowych objętość zawierającą od 20 do 40 miligramów surowego białka mitochondrialnego na pas. Natychmiast po załadowaniu żel jest uruchamiany pod napięciem 100 woltów.

Gdy próbka dostanie się do żelu do układania w stosy, napięcie można podnieść do 500 woltów przy prądzie ograniczonym do 15 miliamperów. Chociaż zwykle uruchamiamy żel przez noc przy napięciu od 70 do 100 woltów, przerywamy elektroforezę, gdy ostra linia czerwonego barwnika zos zbliża się do czoła żelu. Teraz, gdy żel został uruchomiony, możemy analizować aktywność różnych kompleksów białkowych bezpośrednio w żelu.

Czas inkubacji dla każdego testu zależy od skuteczności solubilizacji białek i ilości materiału załadowanego na studzienkę. Kompleksy jeden, cztery i pięć zwykle dają silniejsze sygnały niż kompleksy dwa i trzy. Dlatego czas barwienia dla kompleksu drugiego i trzeciego powinien być dłuższy.

Aby przetestować złożoną aktywność, będziemy musieli użyć określonych dla każdego kompleksu. Składniki poszczególnych można znaleźć w pisemnym protokole. Teraz wytniemy poszczególne pasy żelu, aby osobno wykonać testy aktywności Ingel.

Dla wszystkich kompleksów inkubować plasterki żelu w odpowiednich przez kilka godzin w temperaturze pokojowej dla wszystkich kompleksów z wyjątkiem kompleksu piątego. Po inkubacji utrwal żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15 do 45 minut. Utrwalony żel jest zakonserwowany w 10% kwasie octowym.

Widzisz tutaj, jak wygląda zabarwienie złożonego. W plastrze żelu znajduje się jeden ciemnofioletowy pasek, który odpowiada złożonemu. Przezroczyste żele pozwalają na wykonywanie densytometrii na podstawie czynności kompleksu mitochondrialnego i dokonywanie analiz porównawczych.

Po gęstej cytometrii zwykle suszymy plastry żelu do długotrwałego przechowywania i/lub do skanowania w celu uzyskania wysokiej jakości kompleksu obrazu, dwóch plam o tym samym fioletowym kolorze co jeden kompleks trzeci i kompleks cztery. Oba dają pomarańczowy lub żółtawy pas barwiący. Oto przykłady złożonych czynności barwienia dwóch, trzech i czterech.

Właśnie pokazaliśmy, jak analizować aktywność mitochondrialnych kompleksów wysiękowych, które zostały wyekstrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i rozdzielone w wyższej rozdzielczości, w tym natywne elektro żelowe. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.