Name: Sondowanie aktywności kompleksu mitochondrialnego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj analizę aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu natywnych żeli akryloamidowych. Ta metoda pozwala badać funkcje mitochondriów w biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są obecnie wspierane przez grant zalążkowy California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RS1-00313. Dziękujemy dr Carli Koehler (UCLA) oraz członkom laboratorium Koehler za udzielenie porad i wskazówek w ramach tych i dodatkowych badań.

Wysokorozdzielcza elektroforeza w żelu natywnym (hrCNE) do analizy aktywności kompleksów mitochondrialnych w żelu
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) hodowano na monowarstwie naświetlonych ˠ lub potraktowanych mitomycyną C embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs), a następnie przeniesiono na Matrigel na 5 dni w pożywce warunkowanej przez MEF w standardowych warunkach. Aby usunąć zanieczyszczające MEF, hESCs ponownie wysiano na Matrigel i hodowano w pożywce warunkowanej przez MEF przez kolejne 3 dni. W celu potwierdzenia braku różnicowania hESCs zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną dla markerów pluripotencji Oct-4 oraz SSEA-4.
<ol>
<li>Przemyć komórki ciepłym 1x PBS, pH 7.4, a następnie przeprowadzić trypsynizację (1ml 1x trypsyny na dołek w płytce 6-dołkowej) przez 5 min. </li>
<li>Dodać równą objętość świeżego inhibitora trypsyny (1mg/ml w 1x PBS, pH 7.4). Zebrać komórki i odwirować przy 200g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 0,8 – 1,7ml (w zależności od wielkości osadu) lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (83mM sacharozy; 6,6mM imidazolu/HCl, pH 7.0) z dodatkiem świeżo przygotowanego 1´ koktajlu inhibitorów proteaz. Inkubować na lodzie przez 10 min.</li>
<li>Uhomogenizować komórki za pomocą homogenizatora Dounce'a (~40 – 50 pociągnięć). Alikwot uhomogenizowanych komórek zabarwić błękitem trypanu, aby sprawdzić kompletność homogenizacji pod mikroskopem świetlnym. </li>
<li>Odwirować przy 20 000g przez 10 min w 4°C, aby uzyskać surowy osad mitochondrialny, który zawiera również jądra i większe fragmenty komórek. Odlać i usunąć nadsącz, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Osad można przechowywać w -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie, jeśli jest to etap kończący pracę. UWAGA: Do izolacji i zbierania czystej frakcji błon mitochondrialnych można zastosować wirowanie różnicowe lub inne procedury oparte na gradientach. Szczegóły znajdują się w ref. 4. To alternatywne podejście pozwoli na oznaczenie aktywności kompleksów mitochondrialnych na mg białka mitochondrialnego zamiast na mg masy komórkowej lub liczbę komórek. W celu dokonania takiego porównania konieczne będzie oznaczenie stężenia białek mitochondrialnych po oczyszczeniu. W tym podejściu może być również wymagany inny bufor izolacyjny. W kwestii solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej należy zapoznać się z uwagą po kroku 6 poniżej. </li>
<li>Zsolubilizować surowy osad mitochondrialny na lodzie, mieszając w wirówce (vortex) z lodowatym buforem do solubilizacji (50mM NaCl, 50mM imidazolu/HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM kwasu 6-aminoheksanowego). Kwas 6-aminoheksanowy można zastąpić 1x koktajlem inhibitorów proteaz. Zużyć 35µl buforu do solubilizacji na 20mg masy osadu. Dodać 20µl 10% w/v digitoniny na 20mg masy osadu i wymieszać, delikatnie potrząsając probówką. Inkubować przez 5-10 min na lodzie. W celu solubilizacji białek digitoninę można zastąpić dodecyl-β-D-maltosydem lub Tritonem X-100. Wybór detergentu oraz jego ilość mogą wpływać na tworzenie się superkompleksów lub form multimerycznych kompleksów mitochondrialnych. Więcej informacji znajduje się w ref.1. UWAGA: Ilość detergentu wymagana do solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej odpowiada stosunkowi masy detergentu do białka w zakresie 2-6g/g. Optymalny stosunek do solubilizacji błon mitochondrialnych to 2,5g/g dla dodecyl-β-D-maltosydem, 3g/g dla Tritonu X-100 i 6g/g dla digitoniny. </li>
<li>Odwirować zsolubilizowany osad przy 100 000g przez 15 min w 4°C. Zebrać klarowny nadsącz.</li>
<li>Dodać bufor do nakładania do stężenia końcowego 5% w/v glicerolu i 0,01% w/v Ponceau S (użyć roztworu stokowego buforu do nakładania: 50% w/v glicerolu, 0,1% w/v Ponceau S).</li>
<li>Nanieść na dołki żelu objętość zawierającą 20-40mg surowego osadu mitochondrialnego na ścieżkę. Użyć żelu z gradientem akryloamidu (4-13%) z żelem koncentrującym (stacking gel) 3,5%. UWAGA: Przygotowanie żelu i warunki elektroforezy: Do przygotowania żelu należy użyć mieszaniny akryloamidu/bis-akryloamidu (AA/bisAA) 3 w następujący sposób: 48g akryloamidu i 1,5g bisakryloamidu (49,5% T, 3% C, gdzie T to całkowite stężenie AA i bisAA, a C to procentowy udział sieciującego (bisAA) w całkowitej ilości monomeru). Bufor do żelu (3´): 1,5M kwasu 6-aminoheksanowego; 75mM imidazolu, pH 7.0</li>
</ol>

<table style="padding-left: 60px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Żel gradientowy:</td>
<td>4%</td>
<td>13%</td>
<td>Żel nakładający:</td>
<td>3,5%</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina AA/bisAA 3</td>
<td>2 ml</td>
<td>6,5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0,6 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Bufor żelowy 3´</td>
<td>8,3 ml</td>
<td>8,3 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2,7 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
<td>14,7 ml</td>
<td>5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4,7 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Objętość całkowita</td>
<td>25 ml</td>
<td>25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>8 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>10% APS</td>
<td>139 µl</td>
<td>125 µl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>67 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>14 µl</td>
<td>12,5 µl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6,7 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Bufor anodowy: 25mM imidazol/HCl, pH 7.0 Bufor katodowy: 50mM tricyna, 7.5mM imidazol/HCl, 0.02% w/v dodecyl-β-D-maltozyd, 0.05% w/v deoksicholan, pH 7.0 Żele należy wlewać i prowadzić w pomieszczeniu chłodniczym (4-7 °C). Napięcie początkowe wynosi 100V. Po wejściu próbki w żel koncentrujący napięcie zwiększa się do 500V przy ograniczeniu natężenia prądu do 15mA (dla żeli o wymiarach 0.15 × 14 × 14 cm). Elektroforezę przerywa się po 3-4 h, gdy wyraźna linia czerwonego barwnika Ponceau S zbliża się do czoła żelu. Alternatywnie żel można prowadzić przez noc przy stałym napięciu 70-100V.
<ol>
<li>Testy aktywności w żelu. Czas inkubacji dla każdego testu zależy od wydajności solubilizacji białek oraz ilości materiału naniesionego do każdego dołka. Kompleksy I, IV i V zazwyczaj dają silniejsze sygnały niż kompleksy II i III.</li>
</ol>
Kompleks I (CI)
Inkubować plasterek żelu w buforze CI (5mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CI: Na każde 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4 dodać:
0,01 g NADH
0,25g NBT
Utrwal żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15-45 min. Utrwalony żel przechowuje się w 10% kwasie octowym.
Kompleks II (CII)
Inkubować wycinek żelu w buforze CII (20mM bursztynianu sodu; 0,2mM fenazyny metasiarczanu; 2,5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CII: Dodać na 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
200µl 1M bursztynianu sodu
80µl fenazyny metasiarczanu (250mM PMS rozpuszczony w DMSO)
0,25g NBT
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks III (CIII)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIII (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIII: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks IV (CIV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIV (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), 50µM cytochromu c z serca konia) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIV: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
0,1 g cytochromu c z serca konia
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks V (CV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CV (35mM Tris-base, 270mM glicyny, pH 8.3 w 25°C, 14mM MgSO4, 0.2% w/v Pb(NO3)2, 8mM ATP) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CV: Na 100ml roztworu dodać:

<table border="0">
<tbody >
<tr >
<td >Tris-base</td>
<td >0.424g</td>
</tr >
<tr >
<td >Glicyna</td>
<td >2.026g</td>
</tr >
<tr >
<td >MgSO4</td>
<td >0.345g</td>
</tr >
<tr >
<td >Pb(NO3)2</td>
<td >0.29g</td>
</tr >
</tbody >
</table >

Nie ma potrzeby korygowania pH (powinno wynosić 8.3) – nie należy używać kwasu ani zasady. Przefiltrować i dodać

<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>0.441g</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Utrwal żel w 50% metanolu przez 30 min, a następnie przenieś do wody.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

W tym filmie opisaliśmy ekstrakcję kompleksów białek mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ich rozdział za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu natywnym (hrCNE) oraz następującą po tym analizę za pomocą testów aktywności katalitycznej w żelu. hrCNE rozdziela kompleksy białek błon mitochondrialnych z rozdzielczością porównywalną do elektroforezy w żelu Blue Native i jest metodą lepszą w przypadku testów aktywności w żelu. Technikę tę można zastosować nie tylko do ilościowego oznaczeni...

<table><tbody><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M bursztynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy 0,1M pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 i BP329-1</td><td>Wymieszać 68,4 ml 1M Na2HPO4 i 31,6 ml 1M NaH2PO4, aby przygotować bufor fosforanowy 0,1M o pH 7,2 w temperaturze 25 °C</td></tr><tr><td>1M trycyna, pH 7,0 (dostosowane NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>1M imidazol/HCl, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (m/v) dodecyl-b-D-maltozyd (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 1 ml w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>10% (m/v) digitonina (&amp;gt;50% czystości, stosowana bez rekrystalizacji)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 0,1&amp;#8211;1 ml w temperaturze &amp;#8211;20 °C. Przed użyciem należy podgrzać do 95 °C.</td></tr><tr><td>2M kwas 6-aminoheksanowy</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>10x roztwór zapasowy Ponceau S/glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 i G6279-1L</td><td>0,1% Ponceau S, 50% glicerolu (m/v) w wodzie.</td></tr><tr><td>10% m/v deoksycholan sodu</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Rozpuścić w wodzie. Chronić przed światłem. Dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>250 mM fenazyno metosiarczan (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Rozpuścić w DMSO i podzielić na alikwoty. Przechowywać w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Nitro-błękit tetrazoliowy (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzydyna tetrahydrochlorowodorek (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa adenozyno-5&amp;rsquo;-trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Klasa I, minimum 99%</td></tr><tr><td>zredukowana forma beta-nikotynamid adenin dinukleotydu (NADH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca konia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Przechowywać w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik błękit trypanu 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x trypsyna (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria to organelle cytoplazmatyczne, które odgrywają główną rolę w metabolizmie i homeostazie komórkowej, regulacji sieci sygnałowej komórki oraz programowanej śmierci komórki. Mitochondria produkują ATP, regulują redoks stanu cytoplazmy i bilans Ca2+, katabolizują kwasy tłuszczowe, syntetyzują hem, nukleotydy, hormony steroidowe, aminokwasy oraz pomagają w montażu klastrów żelazowo-siarkowych w białkach. Mitochondria pełnią również istotną rolę w termogenezie. Mutacje genomu mitochondrialnego powodują wiele rodzajów schorzeń u ludzi. Akumulacja mutacji mtDNA koreluje ze starzeniem się organizmu i prawdopodobnie odgrywa istotną rolę w rozwoju nowotworów. Ze względu na ich kluczową funkcję we wszystkich typach komórek, działanie mitochondriów musi być również krytyczne dla komórek macierzystych. Dokonano znaczących postępów w rozumieniu żywotności, proliferacji i zdolności różnicowania się komórek macierzystych. Jednak funkcjonalna aktywność komórek macierzystych, w szczególności ich stan energetyczny, nie została jeszcze szczegółowo zbadana. Prawie nic nie wiadomo o właściwościach mitochondrialnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) oraz ich zróżnicowanych potomkach prekursorach. Jednym ze sposobów zrozumienia i oceny roli mitochondriów w funkcjonowaniu i potencjale rozwojowym hESC jest bezpośredni pomiar aktywności kompleksów oddechowych mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy wysokorozdzielczą elektroforezę w żelu natywnym (clear native gel electrophoresis) oraz następującą po niej wizualizację aktywności in situ w żelu jako metodę analizy pięciu kompleksów łańcucha oddechowego w hESC.

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Mitochondria są organellami cytoplazmatycznymi, które odgrywają główną rolę w metabolizmie i homeostazie komórkowej, regulacji sieci sygnalizacji komórkowej oraz ...

Mitochondria pełnią liczne role w fizjologii komórki, od metabolizmu i produkcji energii, przez programowaną śmierć komórki, aż po syntezę hormonów steroidowych. Pomimo znaczenia mitochondriów zarówno w podstawowych funkcjach komórkowych, jak i w patogenezie chorób, niewiele wiadomo o ich funkcji w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych oraz ich zróżnicowanym potomstwie. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów w ludzkich komórkach macierzystych można analizować za pomocą testów aktywności Ingel.Witajcie, nazywam się Ivan OV i pracuję w laboratorium Michaela Tetela w Katedrze Patologii i Medycyny Laboratoryjnej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oceny funkcji kompleksów oddechowych mitochondriów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Ta procedura oceny aktywności w żelu obejmuje izolację surowych frakcji mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, rozdział kompleksów mitochondrialnych układu fosforylacji oksydacyjnej za pomocą wysokorozdzielczej przejrzystej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oraz późniejszy pomiar aktywności w żelu.Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyizolowanie mitochondriów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. W tym badaniu wykorzystamy ludzkie embrionalne komórki macierzyste hodowane na płytce pokrytej matrigelem w warunkach bez użycia komórek dokarmiających.Aby wyizolować mitochondria z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, zaczynamy od ich przemycia ciepłym 1x PBS pH 7,4, a następnie poddajemy komórki trypsynizacji przez pięć minut. W płytce 6-dołkowej można zastosować 1 ml trypsyny 1x na każdą studzienkę. Po pięciu minutach reakcję można zatrzymać, dodając równą objętość świeżego inhibitora trypsyny o stężeniu 1 mg/ml w 1x PBS, a następnie zebrać komórki.Zebrane komórki należy następnie odwirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 0,8 do 1,7 mililitra lodowatego buforu do izolacji mitochondriów z dodaniem świeżo przygotowanego koktajlu inhibitorów proteaz 1×. Ilość użytego buforu zależy od wielkości otrzymanego osadu komórkowego. Po resuspensji osadu należy inkubować go na lodzie przez około 10 minut.Po inkubacji rozbijamy komórki za pomocą homogenizatora; może to wymagać od 40 do 50 pociągnięć. Możemy sprawdzić, czy proces homogenizacji został zakończony, barwiąc alikwot komórek DOD błękitem trypanowym i obserwując go pod mikroskopem świetlnym. Powinno to wyglądać mniej więcej w ten sposób.Jest to pierwsze ujęcie po 50 przesunięciach tłoka. Jest to drugie ujęcie po 80 przesunięciach tłoka. Po homogenizacji komórek odwiruj je przy 20 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. W ten sposób otrzymamy surowy osad mitochondrialny, który będzie zawierał również jądra komórkowe i większe fragmenty komórek.Przed zebraniem osadu należy zważyć probówkę do zbierania w celu oszacowania późniejszej masy osadu, odlać i usunąć nadsącz, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Po odjęciu masy probówki na tym etapie można przystąpić do solubilizacji osadu, co zostanie przedstawione w następnym kroku. Aby zsolubilizować surowy osad mitochondrialny, należy w pierwszej kolejności utrzymać osad w lodzie i wymieszać go na wortexie z 35 µL lodowatego buforu do solubilizacji.W przypadku każdych 20 mg osadu, szczegółowe informacje dotyczące składników buforu znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Po wymieszaniu w wortexie i dodaniu buforu do solubilizacji, a przed dodaniem digitoniną, przenosimy resuspendowany osad do probówki odpowiedniej do wirowania przy wysokich prędkościach, a następnie dodajemy 20 µL 10% (w/v) digitoniny na 20 mg masy osadu i mieszamy, lekko uderzając w probówkę. Po dokładnym wymieszaniu inkubujemy osad mitochondrialny przez 5 do 10 minut na lodzie. W celu solubilizacji białek zamiast digitoniny można zastosować dodecylosiarczan sodu (DDM) lub Triton X 100.Wybór detergentu oraz jego ilość mogą wpływać na powstawanie suprakompleksów lub form multimerycznych kompleksów mitochondrialnych po inkubacji w lodzie. Po upłynnieniu osadu odwirujemy go przy 100 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie pobierzemy klarowny nadsącz. Teraz możemy przygotować nadsącz do naniesienia na żel gradientowy w celu przeprowadzenia natywnej elektroforezy gradientowej mitochondriów.Zalecamy stosowanie żelu gradientowego akrylamidowego od 5 do 13% z żelem nakładającym 3,5%. Do przygotowania żelu wykorzystamy mieszaninę akrylamidu i bis-akrylamidu zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu przygotowuje się z wyprzedzeniem i przechowuje w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu.Akrylamid i bisakrylamid to toksyczne substancje chemiczne, zarówno w formie proszku, jak i w formie ciekłej, dlatego podczas pracy z nimi należy zachować szczególną ostrożność. Mieszamy roztwór akrylamidu i bisakrylamidu z aalikwotem trzykrotnego buforu do żelu, składającego się z 1,5 molarnego kwasu 6-aminocyksoheksanowego oraz 75 milimolarnego TEMED w pH 7,0. Ilość roztworu akrylamidu i bisakrylamidu dodawana do buforu zależy od procentowej zawartości żelu, którą przygotowujemy w celu stworzenia żelu gradientowego.Przygotujemy jedną mieszaninę 4% i jedną mieszaninę 13%, natomiast żel koncentrujący będzie mieszaniną 3,5%. Należy pamiętać o dodaniu glicerolu do mieszaniny 13%. Po przygotowaniu wszystkich trzech mieszanin dodajemy do nich odpowiednią ilość siarczanu amonu i TEMED, a następnie wlewamy mieszaniny do komory odlewniczej do tworzenia gradientu.Lewa część komory zawiera mieszaninę 5%. Prawa część komory zawiera mieszaninę 13% z niewielkim magnetycznym mieszadłem. Przystępujemy do wlewania żelu poprzez otwarcie prawej części komory.Następnie natychmiast otwieramy lewą część komory i pozwalamy, aby roztwór 5% wymieszał się z roztworem 13%, tworząc gradient. Dodajemy niewielką ilość izopropanolu na górną powierzchnię żelu, aby po polimeryzacji uzyskać ostrą, prostą krawędź żelu. Około godziny później, gdy polimeryzacja żelu gradientowego zostanie zakończona, usuwamy izopropanol, wlewamy do urządzenia żel nakładający 3,5% i wkładamy grzebień do żelu.Żele będziemy składać i prowadzić w pomieszczeniu chłodniczym o temperaturze od około czterech do siedmiu stopni Celsjusza. Do prowadzenia tego żelu użyjemy dwóch różnych buforów. W komorze anodowej zastosujemy bufor zawierający 25 millimolar ole kwasu solnego o pH 7,0.Bufor katodowy będzie zawierać 50 mM Tris, 7,5 mM kwasu solnego, 0,02% (m/v) n-dodecyl-β-D-maltozydu (DDM) oraz 0,05% (m/v) deoksycholanu sodu o pH 7,0. Aby przygotować supernatant do nałożenia na właśnie przygotowany żel, dodaje się bufor do prób, aby uzyskać końcowe stężenie 5% (m/v) glicerolu i 0,01% (m/v) Ponto S; zazwyczaj dodajemy 10-kroć roztwór zapasu zawierający glicerol i Ponto S bezpośrednio do supernatantów.Teraz możemy przystąpić do naniesienia próbki na żel. Do poszczególnych studzienek żelu naniesiemy objętość zawierającą od 20 do 40 miligramów surowego białka mitochondrialnego na każdą ścieżkę. Bezpośrednio po naniesieniu próbki, elektroforezę prowadzimy przy napięciu 100 V.Po przedostaniu się próbki do żelu koncentrującego napięcie można zwiększyć do 500 V, ograniczając natężenie prądu do 15 mA. Chociaż zazwyczaj przeprowadzamy elektroforezę przez noc przy napięciu od 70 do 100 V, przerywamy ten proces, gdy wyraźna linia czerwonego barwnika zos zbliży się do czoła żelu. Po zakończeniu elektroforezy możemy analizować aktywność różnych kompleksów białkowych bezpośrednio w żelu.Czas inkubacji dla każdego testu zależy od wydajności solubilizacji białek oraz ilości materiału naniesionego do każdego dołka. Kompleksy pierwszy, czwarty i piąty zazwyczaj dają silniejsze sygnały niż kompleksy drugi i trzeci. Z tego powodu czas barwienia dla kompleksu drugiego i trzeciego powinien być dłuższy.Aby przetestować aktywność kompleksów, konieczne będzie zastosowanie specyficznych buforów dla każdego z nich. Skład poszczególnych buforów znajduje się w protokole pisemnym. Teraz wytniemy poszczególne ścieżki żelu, aby oddzielnie przeprowadzić testy aktywności in gel.W przypadku wszystkich kompleksów, z wyjątkiem kompleksu piątego, należy inkubować wycinek żelu w odpowiednich buforach przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji utrwalono żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15 do 45 minut. Utrwalony żel przechowuje się w 10% kwasie octowym.Tutaj widać, jak wygląda barwienie kompleksu I. W plastrze żelu widoczny jest jeden głęboko purpurowy prążek odpowiadający kompleksowi I. Przejrzyste żele umożliwiają wykonanie densytometrii aktywności kompleksów mitochondrialnych i przeprowadzenie analiz porównawczych.Po gęstej cytometrii zazwyczaj suszymy plastry żelu w celu długoterminowego przechowywania lub skanowania, aby uzyskać wysokiej jakości obraz kompleksu dwa, który barwi się na ten sam kolor fioletowy co kompleks trzy i kompleks cztery. Oba dają pomarańczowy lub żółtawy prążek barwienia. Oto przykłady aktywności barwienia dla kompleksów dwa, trzy i cztery.Właśnie pokazaliśmy, jak analizować aktywność kompleksów oksydacyjnych mitochondrialnych, które zostały wyektrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i rozdzielone za pomocą metody o wysokiej rozdzielczości, w tym elektroforezy w żelu natywnym. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie aktywności kompleksu mitochondrialnego w ludzkich komórkach macierzystych zarodkowych

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Poznaj analizę aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu natywnych żeli akryloamidowych. Ta metoda pozwala badać funkcje mitochondriów w biologii komórek macierzystych.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów