Name: Sondowanie aktywności kompleksu mitochondrialnego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj analizę aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu natywnych żeli akryloamidowych. Ta metoda pozwala badać funkcje mitochondriów w biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są obecnie wspierane przez grant zalążkowy California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RS1-00313. Dziękujemy dr Carli Koehler (UCLA) oraz członkom laboratorium Koehler za udzielenie porad i wskazówek w ramach tych i dodatkowych badań.

Wysokorozdzielcza elektroforeza w żelu natywnym (hrCNE) do analizy aktywności kompleksów mitochondrialnych w żelu
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) hodowano na monowarstwie naświetlonych ˠ lub potraktowanych mitomycyną C embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs), a następnie przeniesiono na Matrigel na 5 dni w pożywce warunkowanej przez MEF w standardowych warunkach. Aby usunąć zanieczyszczające MEF, hESCs ponownie wysiano na Matrigel i hodowano w pożywce warunkowanej przez MEF przez kolejne 3 dni. W celu potwierdzenia braku różnicowania hESCs zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną dla markerów pluripotencji Oct-4 oraz SSEA-4.
<ol>
<li>Przemyć komórki ciepłym 1x PBS, pH 7.4, a następnie przeprowadzić trypsynizację (1ml 1x trypsyny na dołek w płytce 6-dołkowej) przez 5 min. </li>
<li>Dodać równą objętość świeżego inhibitora trypsyny (1mg/ml w 1x PBS, pH 7.4). Zebrać komórki i odwirować przy 200g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 0,8 – 1,7ml (w zależności od wielkości osadu) lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (83mM sacharozy; 6,6mM imidazolu/HCl, pH 7.0) z dodatkiem świeżo przygotowanego 1´ koktajlu inhibitorów proteaz. Inkubować na lodzie przez 10 min.</li>
<li>Uhomogenizować komórki za pomocą homogenizatora Dounce'a (~40 – 50 pociągnięć). Alikwot uhomogenizowanych komórek zabarwić błękitem trypanu, aby sprawdzić kompletność homogenizacji pod mikroskopem świetlnym. </li>
<li>Odwirować przy 20 000g przez 10 min w 4°C, aby uzyskać surowy osad mitochondrialny, który zawiera również jądra i większe fragmenty komórek. Odlać i usunąć nadsącz, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Osad można przechowywać w -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie, jeśli jest to etap kończący pracę. UWAGA: Do izolacji i zbierania czystej frakcji błon mitochondrialnych można zastosować wirowanie różnicowe lub inne procedury oparte na gradientach. Szczegóły znajdują się w ref. 4. To alternatywne podejście pozwoli na oznaczenie aktywności kompleksów mitochondrialnych na mg białka mitochondrialnego zamiast na mg masy komórkowej lub liczbę komórek. W celu dokonania takiego porównania konieczne będzie oznaczenie stężenia białek mitochondrialnych po oczyszczeniu. W tym podejściu może być również wymagany inny bufor izolacyjny. W kwestii solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej należy zapoznać się z uwagą po kroku 6 poniżej. </li>
<li>Zsolubilizować surowy osad mitochondrialny na lodzie, mieszając w wirówce (vortex) z lodowatym buforem do solubilizacji (50mM NaCl, 50mM imidazolu/HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM kwasu 6-aminoheksanowego). Kwas 6-aminoheksanowy można zastąpić 1x koktajlem inhibitorów proteaz. Zużyć 35µl buforu do solubilizacji na 20mg masy osadu. Dodać 20µl 10% w/v digitoniny na 20mg masy osadu i wymieszać, delikatnie potrząsając probówką. Inkubować przez 5-10 min na lodzie. W celu solubilizacji białek digitoninę można zastąpić dodecyl-β-D-maltosydem lub Tritonem X-100. Wybór detergentu oraz jego ilość mogą wpływać na tworzenie się superkompleksów lub form multimerycznych kompleksów mitochondrialnych. Więcej informacji znajduje się w ref.1. UWAGA: Ilość detergentu wymagana do solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej odpowiada stosunkowi masy detergentu do białka w zakresie 2-6g/g. Optymalny stosunek do solubilizacji błon mitochondrialnych to 2,5g/g dla dodecyl-β-D-maltosydem, 3g/g dla Tritonu X-100 i 6g/g dla digitoniny. </li>
<li>Odwirować zsolubilizowany osad przy 100 000g przez 15 min w 4°C. Zebrać klarowny nadsącz.</li>
<li>Dodać bufor do nakładania do stężenia końcowego 5% w/v glicerolu i 0,01% w/v Ponceau S (użyć roztworu stokowego buforu do nakładania: 50% w/v glicerolu, 0,1% w/v Ponceau S).</li>
<li>Nanieść na dołki żelu objętość zawierającą 20-40mg surowego osadu mitochondrialnego na ścieżkę. Użyć żelu z gradientem akryloamidu (4-13%) z żelem koncentrującym (stacking gel) 3,5%. UWAGA: Przygotowanie żelu i warunki elektroforezy: Do przygotowania żelu należy użyć mieszaniny akryloamidu/bis-akryloamidu (AA/bisAA) 3 w następujący sposób: 48g akryloamidu i 1,5g bisakryloamidu (49,5% T, 3% C, gdzie T to całkowite stężenie AA i bisAA, a C to procentowy udział sieciującego (bisAA) w całkowitej ilości monomeru). Bufor do żelu (3´): 1,5M kwasu 6-aminoheksanowego; 75mM imidazolu, pH 7.0</li>
</ol>

<table style="padding-left: 60px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Żel gradientowy:</td>
<td>4%</td>
<td>13%</td>
<td>Żel nakładający:</td>
<td>3,5%</td>
</tr>
<tr>
<td>Mieszanina AA/bisAA 3</td>
<td>2 ml</td>
<td>6,5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0,6 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Bufor żelowy 3´</td>
<td>8,3 ml</td>
<td>8,3 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2,7 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
<td>14,7 ml</td>
<td>5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4,7 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Objętość całkowita</td>
<td>25 ml</td>
<td>25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>8 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>10% APS</td>
<td>139 µl</td>
<td>125 µl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>67 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>14 µl</td>
<td>12,5 µl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6,7 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Bufor anodowy: 25mM imidazol/HCl, pH 7.0 Bufor katodowy: 50mM tricyna, 7.5mM imidazol/HCl, 0.02% w/v dodecyl-β-D-maltozyd, 0.05% w/v deoksicholan, pH 7.0 Żele należy wlewać i prowadzić w pomieszczeniu chłodniczym (4-7 °C). Napięcie początkowe wynosi 100V. Po wejściu próbki w żel koncentrujący napięcie zwiększa się do 500V przy ograniczeniu natężenia prądu do 15mA (dla żeli o wymiarach 0.15 × 14 × 14 cm). Elektroforezę przerywa się po 3-4 h, gdy wyraźna linia czerwonego barwnika Ponceau S zbliża się do czoła żelu. Alternatywnie żel można prowadzić przez noc przy stałym napięciu 70-100V.
<ol>
<li>Testy aktywności w żelu. Czas inkubacji dla każdego testu zależy od wydajności solubilizacji białek oraz ilości materiału naniesionego do każdego dołka. Kompleksy I, IV i V zazwyczaj dają silniejsze sygnały niż kompleksy II i III.</li>
</ol>
Kompleks I (CI)
Inkubować plasterek żelu w buforze CI (5mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CI: Na każde 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4 dodać:
0,01 g NADH
0,25g NBT
Utrwal żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15-45 min. Utrwalony żel przechowuje się w 10% kwasie octowym.
Kompleks II (CII)
Inkubować wycinek żelu w buforze CII (20mM bursztynianu sodu; 0,2mM fenazyny metasiarczanu; 2,5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CII: Dodać na 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
200µl 1M bursztynianu sodu
80µl fenazyny metasiarczanu (250mM PMS rozpuszczony w DMSO)
0,25g NBT
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks III (CIII)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIII (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIII: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks IV (CIV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIV (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), 50µM cytochromu c z serca konia) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIV: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
0,1 g cytochromu c z serca konia
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks V (CV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CV (35mM Tris-base, 270mM glicyny, pH 8.3 w 25°C, 14mM MgSO4, 0.2% w/v Pb(NO3)2, 8mM ATP) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CV: Na 100ml roztworu dodać:

<table border="0">
<tbody >
<tr >
<td >Tris-base</td>
<td >0.424g</td>
</tr >
<tr >
<td >Glicyna</td>
<td >2.026g</td>
</tr >
<tr >
<td >MgSO4</td>
<td >0.345g</td>
</tr >
<tr >
<td >Pb(NO3)2</td>
<td >0.29g</td>
</tr >
</tbody >
</table >

Nie ma potrzeby korygowania pH (powinno wynosić 8.3) – nie należy używać kwasu ani zasady. Przefiltrować i dodać

<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>0.441g</td>
</tr>
</tbody>
</table>

Utrwal żel w 50% metanolu przez 30 min, a następnie przenieś do wody.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

W tym filmie opisaliśmy ekstrakcję kompleksów białek mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ich rozdział za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu natywnym (hrCNE) oraz następującą po tym analizę za pomocą testów aktywności katalitycznej w żelu. hrCNE rozdziela kompleksy białek błon mitochondrialnych z rozdzielczością porównywalną do elektroforezy w żelu Blue Native i jest metodą lepszą w przypadku testów aktywności w żelu. Technikę tę można zastosować nie tylko do ilościowego oznaczeni...

<table><tbody><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M bursztynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy 0,1M pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 i BP329-1</td><td>Wymieszać 68,4 ml 1M Na2HPO4 i 31,6 ml 1M NaH2PO4, aby przygotować bufor fosforanowy 0,1M o pH 7,2 w temperaturze 25 °C</td></tr><tr><td>1M trycyna, pH 7,0 (dostosowane NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>1M imidazol/HCl, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (m/v) dodecyl-b-D-maltozyd (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 1 ml w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>10% (m/v) digitonina (&amp;gt;50% czystości, stosowana bez rekrystalizacji)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 0,1&amp;#8211;1 ml w temperaturze &amp;#8211;20 °C. Przed użyciem należy podgrzać do 95 °C.</td></tr><tr><td>2M kwas 6-aminoheksanowy</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>przechowywać w temperaturze 4 °C</td></tr><tr><td>10x roztwór zapasowy Ponceau S/glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 i G6279-1L</td><td>0,1% Ponceau S, 50% glicerolu (m/v) w wodzie.</td></tr><tr><td>10% m/v deoksycholan sodu</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Rozpuścić w wodzie. Chronić przed światłem. Dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>250 mM fenazyno metosiarczan (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Rozpuścić w DMSO i podzielić na alikwoty. Przechowywać w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Nitro-błękit tetrazoliowy (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzydyna tetrahydrochlorowodorek (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa adenozyno-5&amp;rsquo;-trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Klasa I, minimum 99%</td></tr><tr><td>zredukowana forma beta-nikotynamid adenin dinukleotydu (NADH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca konia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Przechowywać w temperaturze &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik błękit trypanu 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x trypsyna (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria to organelle cytoplazmatyczne, które odgrywają główną rolę w metabolizmie i homeostazie komórkowej, regulacji sieci sygnałowej komórki oraz programowanej śmierci komórki. Mitochondria produkują ATP, regulują redoks stanu cytoplazmy i bilans Ca2+, katabolizują kwasy tłuszczowe, syntetyzują hem, nukleotydy, hormony steroidowe, aminokwasy oraz pomagają w montażu klastrów żelazowo-siarkowych w białkach. Mitochondria pełnią również istotną rolę w termogenezie. Mutacje genomu mitochondrialnego powodują wiele rodzajów schorzeń u ludzi. Akumulacja mutacji mtDNA koreluje ze starzeniem się organizmu i prawdopodobnie odgrywa istotną rolę w rozwoju nowotworów. Ze względu na ich kluczową funkcję we wszystkich typach komórek, działanie mitochondriów musi być również krytyczne dla komórek macierzystych. Dokonano znaczących postępów w rozumieniu żywotności, proliferacji i zdolności różnicowania się komórek macierzystych. Jednak funkcjonalna aktywność komórek macierzystych, w szczególności ich stan energetyczny, nie została jeszcze szczegółowo zbadana. Prawie nic nie wiadomo o właściwościach mitochondrialnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) oraz ich zróżnicowanych potomkach prekursorach. Jednym ze sposobów zrozumienia i oceny roli mitochondriów w funkcjonowaniu i potencjale rozwojowym hESC jest bezpośredni pomiar aktywności kompleksów oddechowych mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy wysokorozdzielczą elektroforezę w żelu natywnym (clear native gel electrophoresis) oraz następującą po niej wizualizację aktywności in situ w żelu jako metodę analizy pięciu kompleksów łańcucha oddechowego w hESC.

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Mitochondria są organellami cytoplazmatycznymi, które odgrywają główną rolę w metabolizmie i homeostazie komórkowej, regulacji sieci sygnalizacji komórkowej oraz ...

Mitochondria pełnią liczne role w fizjologii komórki, od metabolizmu i produkcji energii, przez programowaną śmierć komórki, aż po syntezę hormonów steroidowych. Pomimo znaczenia mitochondriów zarówno w podstawowych funkcjach komórkowych, jak i w patogenezie chorób, niewiele wiadomo o ich funkcji w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych oraz ich zróżnicowanym potomstwie. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów w ludzkich komórkach macierzystych można analizować za pomocą testów aktywności Ingel.Witajcie, nazywam się Ivan OV i pracuję w laboratorium Michaela Tetela w Katedrze Patologii i Medycyny Laboratoryjnej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oceny funkcji kompleksów oddechowych mitochondriów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Ta procedura oceny aktywności w żelu obejmuje izolację surowych frakcji mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, rozdział kompleksów mitochondrialnych układu fosforylacji oksydacyjnej za pomocą wysokorozdzielczej przejrzystej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oraz późniejszy pomiar aktywności w żelu.Zacznijmy z

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie aktywności kompleksu mitochondrialnego w ludzkich komórkach macierzystych zarodkowych

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Poznaj analizę aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu natywnych żeli akryloamidowych. Ta metoda pozwala badać funkcje mitochondriów w biologii komórek macierzystych.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów