Name: Pomiar naprawy pęknięć dwuniciowych DNA przy użyciu testu DR-white u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę DR-white do pomiaru naprawy pęknięć dwuniciowych DNA u Drosophila melanogaster. Protokół umożliwia rozróżnienie szlaków HR, NHEJ i SSA w organizmie wielokomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Metoda ta została opracowana w czasie, gdy J.R.L. był beneficjentem grantu badawczego AFAR przyznanego przez American Federation for Aging Research.&#160;Praca ta była również wspierana przez National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 i 1R15GM129628) dla J.R.L. Ryciny zostały opracowane przy wsparciu BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

1. Analiza DR-white
<ol>
	<li>Krzyżówki genetyczne (Rysunek 3A) 
	UWAGA: W celu zapoznania się ze standardowymi protokołami hodowli i genetyki Drosophila, należy odnieść się do publikacji &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; autorstwa Ralpha J. Greenspana17. Informacje o genotypach szczepów znajdują się w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Utrzymywać muchy w temperaturze 25 °C w 12-godzinnych cyklach światło/ciemność na standardowej pożywce dla Drosophila, posypanej aktywnymi drożdżami.</li>
		<li>Przygotować pięć fiolek do szoku termicznego poprzez skrzyżowanie 8–10 dziewiczych samic DR-white z 3–5 samcami niosącymi transgen I-SceI (Krzyżówka 1, Rysunek 3A) w każdej fiolce. 
		UWAGA: W zależności od zastosowania można wykorzystać różne transgeny I-SceI . W niniejszym protokole do indukcji szokiem termicznym wykorzystano transgen hsp70-I-SceI11. Aby zapobiec nieszczelnej ekspresji I-SceI w poprzednich pokoleniach, ważne jest, aby transgeny DR-white i I-SceI zostały połączone w jednej musze tylko w tym pokoleniu.</li>
		<li>Tego samego dnia przygotować butelki do namnażania szczepu y w. Będą one służyć jako muchy testerowe. Trzy butelki do namnażania są wystarczające dla około 60–80 krzyżówek testerowych.</li>
		<li>Hodować fiolki do szoku termicznego i butelki do namnażania y w w temperaturze 25 °C przez 3 dni.</li>
		<li>Trzeciego dnia przenieść muchy z fiolek do szoku termicznego oraz z butelek do namnażania y w na świeżą pożywkę, aby służyły jako zestaw zapasowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szok termiczny/indukcja DSB 
	UWAGA: Jeśli nie używa się transgenu I-SceI indukowanego szokiem termicznym, należy przejść do kroku 1.2.5, który zazwyczaj wykonuje się 3 dni po kroku 1.1.5.
	<ol>
		<li>Inkubować fiolki do szoku termicznego przez 3 h w 25 °C, aby upewnić się, że całe potomstwo przeszło przez przejście matczyno-zygotyczne.</li>
		<li>Poddać oryginalne fiolki szokowi termicznemu w kąpieli wodnej o temperaturze 38 °C przez 1 h. Należy upewnić się, że poziom wody sięga przynajmniej do dołu kuli bawełnianej, aby larwy nie wyczołgały się powyżej linii wody.</li>
		<li>Kontrolować temperaturę kąpieli wodnej co 15 min i utrzymywać ją w zakresie 38 ± 0.5 °C, ponieważ wyniki indukcji i naprawy zależą od czasu trwania i temperatury szoku termicznego.</li>
		<li>Przenieść fiolki z powrotem do 25 °C.</li>
		<li>Następnego dnia dodać do pożywki 1/3 złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonęła nadmiar wilgoci. Jeśli pożywka jest sucha, dodać do chusteczki laboratoryjnej około 100 µL wody. Do butelek do namnażania y w dodać kulkę bawełnianą.</li>
		<li>Hodować fiolki poddane szokowi termicznemu przez kolejne 6 dni w 25 °C lub do momentu rozpoczęcia eklozji much.</li>
		<li>Oczyścić fiolki zapasowe i butelki do namnażania 3 dni po przeniesieniu. Do zapasowych butelek do namnażania y w dodać kulkę bawełnianą około 4 dni po oczyszczeniu. 
		UWAGA: W razie potrzeby fiolki zapasowe można poddać szokowi termicznemu zgodnie z krokami od 1.2.1 do 1.2.6 i przetwarzać zgodnie z opisem poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzyżówki testerowe
	<ol>
		<li>Zbierać muchy poddane szokowi termicznemu, niosące transgeny DR-white i I-SceI, przez 4–5 dni po rozpoczęciu eklozji, aby zminimalizować błąd wynikający z etapu rozwoju. 
		UWAGA: Muchy poddane pomyślnemu szokowi termicznemu, niosące transgeny DR-white i I-SceI, wykazują mozaikowatość oczu z powodu procesów naprawy w stadium embrionalnym i larwalnym, które rozwinęły się w tkanki dorosłe. Zakres mozaikowatości nie zawsze koreluje z procesami naprawy w linii zarodkowej, a zatem nie powinien być czynnikiem decydującym przy wyborze much eksperymentalnych do krzyżówek testerowych (krok 1.3.3).</li>
		<li>Zbierać dziewicze samice y w przez 5 dni. Zbierać 5 dziewiczych samic na każdą przewidywaną liczbę próbek. Zbierać z zapasowych butelek do namnażania, gdy tylko rozpocznie się eklozja.</li>
		<li>Przygotować fiolki testerowe, krzyżując jednego samca poddanego szokowi termicznemu z 4–5 dziewiczymi samicami y w (Krzyżówka 2; Rysunek 3A). Samce należy wybierać losowo z połączonej kolekcji z kroku 1.3.1, aby zminimalizować błąd wynikający z etapu rozwoju. Hodować krzyżówki testerowe w 25 °C. 
		UWAGA: Aby uniknąć crossing-over między DR-white a I-SceI, najczęściej analizuje się linie zarodkowe samców; można jednak analizować również potomstwo żeńskie. W przypadku analizy potomstwa żeńskiego, fiolki testerowe dla Krzyżówki 2 przygotowuje się w stosunku 2:5 (samice:y w samce) i hoduje przez 5–6 dni (następny krok), aby zapewnić produktywność.</li>
		<li>Sprawdzić produktywność 4 dni po przygotowaniu fiolek testerowych, aby ocenić, kiedy należy je oczyścić. 
		UWAGA: Potwierdzić, że zniesiono wystarczającą liczbę jaj, aby zapewnić co najmniej 20 mierzalnych potomków, ale nie dopuścić do przeludnienia hodowli, gdyż muchy mogą utknąć w pożywce.</li>
		<li>Gdy fiolki testerowe będą gotowe (do 4–5 dni po ustanowieniu krzyżówek testerowych), usunąć muchy i dodać do pożywki 1/3 złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonęła nadmiar wilgoci. 
		UWAGA: Na tym etapie można zebrać samce, jeśli wymagane są dalsze analizy (np. genotypowanie molekularne).</li>
		<li>Hodować fiolki testerowe przez kolejne 5–6 dni w 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocenianie 
	UWAGA: Dla każdego warunku w każdym eksperymencie genetycznym (np. mutanty homozygotyczne i kontrole heterozygotyczne) przygotowuje się około 25 fiolek testerowych. Każdy eksperyment genetyczny powtarza się 2–3 razy, a dane z poszczególnych fiolek są łączone.
	<ol>
		<li>Oceniać potomstwo z Krzyżówki 2 (Rysunek 3A) przez około 9 dni po tym, jak pierwsze muchy zaczną przechodzić eklozję.</li>
		<li>Zanurzyć muchy w narkozie za pomocą CO2 lub poprzez przeniesienie much do pustej fiolki bez pożywki i zamrożenie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 min. 
		UWAGA: Jeśli muchy zostaną zamrożone, można je oceniać nawet kilka dni później.</li>
		<li>Umieścić muchy na podkładce do much i ocenić odpowiednie fenotypy (Rysunek 3A). Do zestawu danych włączyć tylko fiolki, w których oceniono co najmniej 20 much.
		<ol>
			<li>Aby ocenić, najpierw należy wyselekcjonować muchy niosące kasetę DR-white (wykorzystując fluorescencję białka czerwonego [RFP+] jako marker), a następnie ocenić kolor oczu i ciała.</li>
			<li>Transgen y+ powiązany z kasetą DR-white skutkuje pośrednim brązowym kolorem ciała, który nie jest w pełni typem dzikim. Aby odróżnić brak DSB/NHEJ (brązowe ciało;&#160;y+&#160;w-) od SSA (żółte ciało;&#160;y-&#160;w-), należy porównać muchy z potomstwem y w, które nie posiadają chromosomu DR-white (RFP-). Zdarzenia SSA będą miały taki sam żółty kolor jak te muchy. Muchy, które są ciemniejsze (bardziej brązowe) od nich, oceniać jako brak DSB/NHEJ. 
			UWAGA: Odchylenia od fenotypów opisanych na Rysunku 3A&#160; mogą sugerować kontaminację; taka fiolka nie powinna być oceniana. Choć można oceniać całe martwe muchy, muchy uszkodzone należy odrzucić, jeśli nie można określić ich fenotypu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza TIDE (Rycina 4)
<ol>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA)18
	<ol>
		<li>Zebrać poddane szokowi termicznemu muchy (lub larwy) niosące oba DR-biały i I-SceI transgen, jak w potomstwie z krzyżówki 1 (Rysunek 3A).</li>
		<li>Umieść pojedyncze muchy w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zamroź szokowo (np. w kąpieli z suchego lodu i etanolu lub w ciekłym azocie). 
		UWAGA: Podczas pracy z suchym lodem, ciekłym azotem, etanolem, izopropanolem i innymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz przestrzegać instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa. 
		PUNKT PRZERWY:&#160; Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C i przetworzyć później w razie potrzeby. W przypadku analizy much lub larw należy użyć jednej muchy lub larwy na próbkę. W przypadku analizy mniejszych tkanek (np. mózgów, tarczek imaginalnych) należy połączyć próbki, aby zwiększyć wydajność DNA.</li>
		<li>Każdą próbkę należy homogenizować w 50 µL Buforu A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]; 100 mM chlorku sodu; 0,5% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) przy użyciu homogenizatora elektrycznego.</li>
		<li>Inkubować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez 30 min.</li>
		<li>Do każdej próbki należy dodać 100 µL buforu B (1,4 M octanu potasu, 4,3 M chlorku litu) i krótko wymieszać, odwracając probówki. 
		UWAGA: W przypadku użycia całych much może być wymagana większa objętość w celu pełnej homogenizacji próbek. W takim przypadku należy zachować stosunek objętościowy Buforu A do Buforu B wynoszący 1:2.</li>
		<li>Inkubować próbki w lodzie przez co najmniej 30 min.</li>
		<li>Wirować próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść 125 µL klarownego supernatantu do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Należy unikać przenoszenia osadu.</li>
		<li>Do każdych 125 µL supernatantu dodać 100 µL 100% izopropanolu w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać, odwracając probówki.</li>
		<li>Wiruj próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odssać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu DNA. 
		UWAGA: Osad DNA może nie być widoczny na tym etapie. Należy zapamiętać orientację probówek podczas umieszczania ich w mikrocentryfudze i aspirować z przeciwległej strony miejsca, w którym spodziewa się obecności osadu.</li>
		<li>Przemyj osady 250 µL lodowatego 70% etanolu, a następnie krótko wymieszaj, delikatnie odwracając probówki.</li>
		<li>Odwiruj próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odssać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. 
		UWAGA: Osad może być bardziej widoczny po przemyciu etanolem. Jeśli nie, zobacz Uwaga do kroku 2.1.11.</li>
		<li>Pozostawić probówki niezakorkowane w temperaturze pokojowej, aby odparować pozostały etanol. Należy unikać nadmiernego wysuszenia osadu, ponieważ może on nie ulec całkowitej rekonstytucji.</li>
		<li>Należy dodać 20 µL wody wolnej od nukleaz i pozostawić osady do rekonstytucji przez noc w temperaturze 4 °C. 
		PRZERWA: Jeśli osad DNA nie rozpuścił się całkowicie, można dodać dodatkową ilość wody.</li>
		<li>Następnego dnia należy delikatnie odwrócić probówki i zmierzyć stężenie DNA. Jeśli próbki nie są przetwarzane natychmiast, należy przechowywać je w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: W przypadku ekstrakcji z pojedynczej muchy wydajność wynosi zazwyczaj około 100 ng/µL. Istotne jest pozyskanie próbek wysokiej jakości. A260/A280 absorbancja powinna mieścić się w przedziale od 1,7 do 2,0. Wartości poza tym zakresem sugerują obecność zanieczyszczeń, takich jak białka. A260/A230 powinna mieścić się w przedziale od 2,0 do 2,2. Wartości spoza tego zakresu wskazują na obecność zanieczyszczeń, takich jak etanol i sole buforowe. Próbki o niższej wydajności i słabej jakości mogą prowadzić do nieefektywnej amplifikacji PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
	<ol>
		<li>Amplifikować w obrębie Sce.white metodą PCR przy użyciu 100 ng gDNA oraz starterów DR-biały_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) i DR-biały_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) zgodnie z instrukcjami producenta. Należy dołączyć DR-biały próbka much kontrolnych (tj. DR-biały stado rodzicielskie, bez I-SceI transgen obecny). Zastosować następujące warunki cyklowania: 94 °C przez 3 min; {94 °C przez 30 s; touchdown w 66 °C (-0,5 °C / cykl) przez 30 s; 72 °C przez 30 s} x 16 cykli; {94 °C przez 30 s; 58 °C przez 30 s; 72 °C przez 30 s} x 20 cykli; 72 °C przez 5 min; utrzymywać w 12 °C. 
		UWAGA: W przypadku zastosowania innego odczynnika może być konieczna korekta warunków cyklicznych.</li>
		<li>Nanieś około 2 µL produktu PCR na diagnostyczny żel agarozowy 1% w buforze tris-octan-EDTA (TAE), aby potwierdzić amplifikację Sce.białyOczekiwana wielkość amplikonu wynosi około 1,7 kb.</li>
		<li>Oczyszczanie produktów PCR Sce.white amplikonów i zmierz stężenie DNA.</li>
		<li>Sekwencjonowanie oczyszczonego produktu PCR z użyciem startera DR-biały_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		UWAGA: Zazwyczaj sekwensujemy 40 ng oczyszczonego produktu PCR, jednak ilość ta może się różnić zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez serwis sekwenowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza TIDE 
	UWAGA: Większość błędów wynikających z użycia skryptu TIDE R ma swoje źródło w nieprawidłowym formatowaniu kodu.
	<ol>
		<li>Pobierz wymagane pakiety R (tj. sangerseqR i Biostrings) ze strony Bioconductor.org. Użyj paska wyszukiwania, aby zlokalizować najnowszą wersję każdego pakietu.</li>
		<li>Należy przeanalizować chromatogramy sekwencji w celu potwierdzenia ich wysokiej jakości. Analizie należy poddać wyłącznie chromatogramy z minimalnym tłem lub jego brakiem przed miejscem pęknięcia.</li>
		<li>Pobierz pliki śladów sekwencjonowania (z rozszerzeniem .ab1) i umieść wszystkie te pliki w jednym folderze na komputerze. Uprość nazwy plików z sekwencjami w maksymalnym stopniu (np. F1, Het2, Hom3), aby ułatwić edycję skryptów w kolejnych krokach.</li>
		<li>Otwórz skrypt TIDE w języku R (Plik uzupełniający 1) w zintegrowanym środowisku programistycznym (IDE) RStudio (patrz Tabela materiałów). W panelu Źródło (Source) zlokalizuj linię rozpoczynającą się od Control &#60;- (Plik uzupełniający 2A) i wprowadź nazwę pliku sekwencji kontrolnej dokładnie tak, jak została zapisana, wraz z rozszerzeniem .ab1, w cudzysłowie. 
		UWAGA: „sekwencja kontrolna” to sekwencja PCR z rodzicielskiego DR-biały stok bez I-SceI transgen lub indukcja.</li>
		<li>Zlokalizuj linię zaczynającą się od samplename &#60;- wpisz c( a następnie w nawiasach podaj nazwę pliku z sekwencją każdej próbki (Plik uzupełniający 2A). Uwzględnij rozszerzenie .ab1, każdą nazwę pliku umieść w osobnych cudzysłowach i oddziel nazwy plików przecinkami.</li>
		<li>Zapisz edytowany plik skryptu TIDE R w tym samym folderze, w którym znajdują się sekwencje przeznaczone do analizy. Nadaj plikowi prostą nazwę, aby uniknąć błędów w kolejnych krokach.</li>
		<li>W środowisku IDE przejdź do folderu TIDE, korzystając z karty Files w panelu Output (Plik uzupełniający 2B).</li>
		<li>Kliknij w Więcej rozwiń i wybierz Otwórz nowy terminal w tym miejscu (Plik uzupełniający 2C). W panelu Konsola (na dole po lewej stronie) otworzy się nowy terminal.</li>
		<li>W nowo otwartym Terminalu wpisz „R” i naciśnij Wprowadź (Plik uzupełniający 2D).</li>
		<li>Gdy program R zostanie uruchomiony w terminalu, uruchom skrypt R TIDE, wpisując source(&#34;TIDE_analiza.R&#34;) i naciśnij Wprowadź (Plik uzupełniający 2E). Terminal uruchomi skrypt i wygeneruje reprezentację graficzną (Plik uzupełniający 2F) oraz plik .csv zawierający surowe dane dla każdej próbki (Plik uzupełniający 2G i Plik uzupełniający 3). Pliki wynikowe są zapisywane w tym samym folderze co skrypt R i pliki z sekwencjami. 
		UWAGA: W przypadku ponownego uruchomienia tego samego skryptu R, wszelkie nowo wygenerowane pliki .csv nadpiszą pliki starsze. Jeśli wykonujesz wiele analiz na tych samych plikach, utwórz kopię folderu.</li>
		<li>Przeanalizuj dane, otwierając każdy plik .csv.
		<ol>
			<li>Zinterpretuj surowe dane jako proporcje indeli w sekwencji próbki. Konwersja genów w wyniku rekombinacji homologicznej z sekwencji rozpoznawanej przez I-SceI do sekwencji SacI typu dzikiego prowadzi do kanonicznej delecji o długości 23 bp; skrypt raportuje tę wartość HR w oddzielnym wierszu na dole wyniku (Plik uzupełniający 2G). Wartość 0-indel oznacza brak DSB lub NHEJ bez powstania indeli. Sumę wszystkich pozostałych wartości indeli należy przyjąć jako NHEJ z przetwarzaniem. Suma NHEJ z przetwarzaniem oraz HR stanowi całkowitą liczbę wykrywalnych zdarzeń naprawy DSB.</li>
			<li>Oblicz udziały poszczególnych ścieżek naprawy wśród wykrywalnych zdarzeń naprawy DSB, korzystając z następujących równań: 
			NHEJ z przetworzeniem proporcja = (NHEJ z przetworzeniem) / (NHEJ z przetworzeniem + HR) 
			proporcja HR = (HR) / (NHEJ z procesowaniem + HR) 
			UWAGA: W każdym eksperymencie genetycznym (np. mutanty homozygotyczne i kontrole heterozygotyczne) dla każdego stanu wykorzystuje się około 10–15 próbek. Każdy eksperyment genetyczny powtarza się 2–3 razy, a poszczególne dane są łączone.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.</li>
	<li>Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.</li>
	<li>Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.</li>
	<li>Figueroa-Gonz&#225;lez G, P&#233;rez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.</li>
	<li>Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.</li>
	<li>Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.</li>
	<li>Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.</li>
	<li>Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.</li>
	<li>Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.</li>
	<li>Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.</li>
	<li>Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.</li>
	<li>Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.</li>
	<li>Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.</li>
	<li>Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.</li>
	<li>Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.</li>
	<li>Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.</li>
	<li>McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.</li>
	<li>Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.</li>
	<li>Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.</li>
	<li>Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.</li>
	<li>Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.</li>
	<li>Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.</li>
	<li>Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.</li>
	<li>Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.</li>
	<li>Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.</li>
	<li>Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.</li>
	<li>Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów finansowych ani niefinansowych.

Wszechstronność systemu DR-white jest krytycznym czynnikiem przyczyniającym się do jego dotychczasowego i przyszłego wpływu na dziedzinę naprawy DNA. Po pierwsze, sekwencja integracji attB w konstrukcie reporterowym DR-white pozwala badaczom na ukierunkowanie reportera w liczne miejsca w genomie Drosophila21, przy czym kilka linii celowanych jest już dostępnych22. Po drugie, dostępność różnych transgenów I-SceI, takich jak ekspresja indukowana szokiem termicznym za pomocą promotora hsp70 (niniejsze badanie), ekspresja konstytutywna za pomocą promotora ubiquitin23 oraz ekspresja w linii zarodkowej przedmeiotycznej za pomocą promotora Bam24, zapewnia liczne konteksty rozwojowe i tkankowo swoiste do badania naprawy DSB. Niezależnie od użytego transgenu &#160;I-SceI, krzyżówki genetyczne muszą być starannie zaplanowane, aby upewnić się, że transgen I-SceI zostanie wprowadzony dopiero w ostatnim krzyżowaniu, co zapewni prawidłową indukcję DSB. Należy zauważyć, że częstotliwość naprawy może znacznie się różnić w zależności od lokalizacji genomicznej DR-white i/lub użytego transgenu I-SceI&#160;. Przyszłe eksperymenty mogłyby dodatkowo porównać lokalizacje genomiczne i transgeny I-SceI, aby ustalić, czy to kontekst genomiczny, czy swoistość tkankowa warunkuje naprawę DSB.
Szczególną zaletą testu DR-white oraz jego pochodnych jest możliwość identyfikacji naprawy DSBs poprzez rekombinację homologiczną, NHEJ z przetwarzaniem końców, a w większości przypadków także przez SSA. Choć system ten został zaprojektowany do fenotypowego wykrywania zdarzeń naprawy w linii zarodkowej, umożliwia on również analizę tkanek somatycznych za pomocą analizy algorytmicznej TIDE. Pomimo tych zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tego testu. Warto zauważyć, że test DR-white może niedoszacowywać częstotliwości HR. Podobnie jak w innych testach z reporterami genetycznymi wykorzystujących DSBs indukowane nukleazą, naprawa drogą HR z chromatydy siostrzanej (intersister HR) jest nieodróżnialna od zdarzenia bez DSB lub od NHEJ bez przetwarzania końców. Zatem przynajmniej część klasy No DSB/NHEJ może stanowić zdarzenia HR. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, należy zachować ostrożność przy wynikach porównujących czynniki genetyczne (takie jak linie mutantów). Inne ograniczenia testu obejmują brak możliwości oceny zdarzeń premeiotycznych, które nie doprowadziły do powstania żywotnego potomstwa. Na przykład zdarzenia DSB, które mogły nie zostać naprawione i skutkowały śmiercią komórki, nie zostaną odnotowane w potomstwie. Choć ogólna płodność może być jakościową miarą śmierci komórek linii zarodkowej, konieczne może być zastosowanie testów komórkowych (takich jak TUNEL). Dodatkowo, analiza skryptem R TIDE dostarcza jedynie proporcji wykrywalnych zdarzeń w populacji komórek. Aby określić konkretne sekwencje indeli, konieczne jest sekwencjonowanie pojedynczych zdarzeń naprawy przy użyciu multipleksowego sekwencjonowania DNA.
Test DR-white wywarł już ogromny wpływ na badania nad naprawą DSB. Jego zastosowanie pozwoliło zidentyfikować czynniki przyczyniające się do naprawy DSB u organizmów wielokomórkowych, w tym wiek25, płeć26, lokalizacja DSB22,26, lokalizacja sekwencji donora15, cykl komórkowy oraz typ tkanki26. Ponadto wykorzystaliśmy ten test do zidentyfikowania kilku białek, które również sterują wyborem ścieżki naprawy i/lub naprawą sekwencji zróżnicowanych u Drosophila, w tym Msh627, Blm28, Rif116 oraz CtIP16,29. Rzeczywiście, ugruntowane wykorzystanie Drosophila jako genetycznego organizmu modelowego z konserwowanymi białkami naprawy DNA zapewnia prosty, wielokomórkowy system do badania czynników genetycznych, komórkowych i organizmalnych, które przyczyniają się do naprawy DSB w złożonych kontekstach biologicznych.

Integralność genomu jest często wystawiana na próbę przez uszkodzenia DNA, wśród których szczególnie toksyczne są pęknięcia dwuniciowe (DSBs). Jeśli nie zostaną one naprawione, mogą prowadzić do utraty materiału genetycznego, przetasowań chromosomalnych oraz śmierci komórki1. W związku z tym komórki wyewoluowały wiele szlaków naprawy DSBs. Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) bezpośrednio liguje dwa końce DSB, co może prowadzić do powstania indeli w miejscu pęknięcia; SSA (single-strand&#160;annealing) wykorzystuje komplementarne sekwencje flankujące miejsce pęknięcia do jego naprawy, co skutkuje delecjami w miejscu pęknięcia; natomiast rekombinacja homologiczna (HR) wykorzystuje sekwencję homologiczną jako matrycę do naprawy2,3.
Historycznie badania nad naprawą DSB ograniczały się do testów biochemicznych4 lub systemów jednokomórkowych, takich jak bakterie5,6, drożdże7,8 oraz hodowle komórkowe ssaków9,10. Chociaż modele te miały kluczowe znaczenie dla identyfikacji głównych białek naprawczych i ich mechanizmów, brakuje im złożoności biologicznej organizmu wielokomórkowego. Drosophila melanogaster stała się popularnym wielokomórkowym systemem modelowym do badania naprawy DNA. Jednak wiele obecnie stosowanych testów jest dostosowanych do konkretnych szlaków naprawczych11; wykorzystuje duże aberracje chromosomalne, takie jak wycięcie elementu P12; lub wymaga czasochłonnych analiz molekularnych13. Test DR-white rozwiązuje te problemy, zapewniając prosty genetyczny reporter naprawy DNA u Drosophila14. Niniejsza praca przedstawia kompletny, praktyczny i szczegółowy protokół krok po kroku wykonywania testów genetycznych i molekularnych w celu pomiaru naprawy DSB w DNA z wykorzystaniem ugruntowanego testu DR-white.
Test wykorzystuje dwie bezpośrednie powtórzenia sekwencji Muszka owocówka biały (wgen, który warunkuje czerwony kolor oczu typu dzikiego (Rycina 1). Obie kopie są niefunkcjonalne: pierwsza, Sce.whitezawiera insercję przenoszącą sekwencję rozpoznawania meganukleazy I-SceI w obrębie miejsca SacI typu dzikiego i wprowadzającą przedwczesny kodon stop; drugi, iwhite, jest skrócony zarówno na końcu 5’, jak i 3’ i służy jako matryca dla naprawy HR. A Muszka owocówka żółty transgen (y+), który odpowiada za brązowy kolor ciała typu dzikiego, znajduje się pomiędzy tymi dwiema biały powtórzenia. Ponieważ DR-biały kaseta zostaje zintegrowana z y w tło mutantów, DR-biały muchy wykazują fenotyp dzikiego typu w postaci brązowego ciała oraz fenotyp mutanta w postaci białych oczu.
DSB można indukować w obrębie Sce.white poprzez krzyżowanie much DR-white z muchami niosącymi transgen I-SceI. Naprawę DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej można zmierzyć poprzez ocenę potomstwa z krzyżówki testowej. Naprawa drogą NHEJ prowadzi do fenotypu rodzicielskiego: brązowego ciała i białych oczu (Rycina 1A), natomiast naprawa drogą HR przywraca sekwencję white typu dzikiego, co skutkuje potomstwem o brązowym ciele i czerwonych oczach (Rycina 1B). Naprawa DSB drogą SSA lub crossing-over mitotyczny prowadzą do utraty pośredniczącego transgenu yellow, co skutkuje muchami o żółtym ciele i białych oczach (Rycina 1C). Aby przeanalizować wyniki naprawy w komórkach somatycznych, zaadaptowaliśmy algorytm Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) w celu wykrywania naprawy NHEJ z przetwarzaniem końców oraz naprawy HR specjalnie dla testu DR-white 15,16.
Test DR-white oferuje kilka zalet w porównaniu do wcześniej opracowanych testów naprawy DNA u Drosophila. Ponieważ pęknięcia są generowane i naprawiane w linii zarodkowej, wyniki naprawy można łatwo wykryć za pomocą analizy fenotypowej. Jednocześnie test ten jest niezwykle wszechstronny. Choć został on zaprojektowany przede wszystkim do pomiaru naprawy HR, może wykrywać wszystkie trzy szlaki naprawy. Opracowaliśmy również dwa dodatkowe, funkcjonalne matryce naprawcze (Rysunek 2). Matryca iwhite.mu zawiera 28 cichych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) i również daje potomstwo z czerwonymi oczami (Rysunek 2A), co ułatwia badania długości odcinków konwersji genowej (GCT) oraz naprawy HR między zróżnicowanymi sekwencjami14.&#160;Matryca iwhiteΔ9 zawiera delecję dziewięciu par zasad w miejscu SacI typu dzikiego i daje potomstwo z pomarańczowymi oczami (Rysunek 2B). Cecha ta pozwala badaczom śledzić naprawę HR z różnych matryc, co jest funkcją unikalną dla testu DR-white15.

<table><tbody><tr><td>Tłuczki 0,5 mL wolne od RNAzy/DNAzy</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Do homogenizacji próbek do ekstrakcji gDNA</td></tr><tr><td>Kulki bawełniane</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>do standardowej hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Inkubator chłodniczy Peltiera do Drosophila</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>do standardowej hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Linia Drosophila: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Linia Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>stworzona przez laboratorium LaRocque poprzez standardową rekombinację linii RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) z Bloomington Drosophila Stock Center; dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego</td></tr><tr><td>Linia Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>test DR-white zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego</td></tr><tr><td>Linia Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>test DR-white.mu zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego</td></tr><tr><td>Linia Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>donor iwhite&amp;Delta;9 zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego</td></tr><tr><td>Zatwory do butelek Drosophila Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>do standardowej hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny stereomikroskop (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>do standardowego &quot;przenoszenia much&quot; Drosophila i ich sortowania na podstawie fluorescencji</td></tr><tr><td>Podkładka do much Drosophila FlyStuff</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>do standardowego &quot;przenoszenia much&quot; Drosophila</td></tr><tr><td>Ręczniki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna MyBath 4L</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>do&amp;nbsp; szoku termicznego</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>Pożywka Nutri-fly Bloomington Formulation</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>do standardowej hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Bezprzewodowy homogenizator z tłuczkiem Pellet Pestle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Do homogenizacji próbek do ekstrakcji gDNA</td></tr><tr><td>Butelki polipropylenowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>do standardowej hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>do standardowej hodowli Drosophila, w tym do szoku termicznego</td></tr><tr><td>Starter/oligonukleotyd DR-white_8f</td><td>N/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydów</td><td>N/A</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Starter/oligonukleotyd DR-white_8a</td><td>N/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydów</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Starter/oligonukleotyd DR-white_9f</td><td>N/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydów</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Wersja 2023.06.1+524</td><td>Darmowa wersja do pobrania; dopuszczalna jest każda wersja R Studio, choć przedstawione dane analizowano przy użyciu&amp;nbsp; wersji 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>Pakiety R Studio: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Wersja 3.24)</td><td>Wersja 2.76.0</td><td>Skrypt R poprosi użytkownika o zainstalowanie tego pakietu</td></tr><tr><td>Pakiety R Studio: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Wersja 3.24)</td><td>Wersja 1.44.0</td><td>Skrypt R poprosi użytkownika o zainstalowanie tego pakietu</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>do standardowego &quot;przenoszenia much&quot; Drosophila</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean up&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar naprawy pęknięć dwuniciowych dna przy użyciu testu dr-white u drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Tradycyjne badania nad naprawą pęknięć obu nici DNA (DSB) są często ograniczone do analiz biochemicznych lub systemów jednokomórkowych (np. komórek, drożdży). Aby ułatwić badanie naprawy DSB w organizmie wielokomórkowym, stosujemy test DR-white u Drosophila melanogaster. Test DR-white jest prostym, a zarazem wszechstronnym testem reporterowym naprawy DSB, który zawiera pojedynczą sekwencję rozpoznawaną przez I-SceI, mogącą zostać przeciętą poprzez ekspresję meganukleazy I-SceI. Ekspresja I-SceI może być indukowana konstytutywnie, za pomocą szoku termicznego lub pod kontrolą innych promotorów, co umożliwia badanie naprawy specyficznej dla tkanki lub etapu rozwoju. Główną zaletą tego testu jest możliwość rozróżnienia wyników naprawy obejmujących rekombinację homologiczną (HR), niespecyficzne łączenie końców (NHEJ) oraz SSA (single-strand annealing). Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy protokół uznanego testu DR-white, w tym opis krok po kroku procesu indukowania DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej i fenotypowej analizy zdarzeń naprawczych poprzez ocenę potomstwa. Opisano w nim również molekularną analizę zdarzeń naprawczych za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowania oraz skryptu R TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition). Protokół ten stanowi przydatne narzędzie do badania genetycznych i molekularnych mechanizmów naprawy DNA w modelu organizmalnym.

Drosophila Wymagania białka Rad51 dla naprawy poprzez rekombinację homologiczną
Udane eksperymenty z linią zarodkową dają oczekiwane klasy fenotypowe przedstawione na Rysunku 3A oraz co najmniej 20 ocenialnych potomków na fiolkę. Nieoczekiwane fenotypy lub mniej niż 20 ocenialnych potomków wskazują na kontaminację lub niewystarczającą produktywność i powinny zostać wykluczone zgodnie z instrukcją w kroku 1.4.3. W analizie TIDE udane próbki generują amplikon o długości około 1,7 kb oraz chromatogramy z niewielkim tłem przed miejscem pęknięcia; DNA o niskiej wydajności lub kontaminowane, a także zaszumione chromatogramy są nieoptymalne i nie powinny być analizowane.
Podczas stosowania testu DR-white z indukowanym szokiem termicznym źródłem I-SceI, częstotliwość naprawy przez HR u much typu dzikiego wynosi 38,5 ± 1,2% (średnia ± SEM), natomiast SSA występuje w około 3,2 ± 0,35% (Rysunek 3B&#160; i Plik uzupełniający 4). Rad51 (kodowany przez homolog spnA u Drosophila) jest niezbędny do etapu inwazji nici w rekombinacji homologicznej14,19. Zatem utrata Rad51 powinna prowadzić do nieefektywnego przebiegu HR. Rzeczywiście, w tle DmRad51-/- naprawa HR jest zredukowana do 1,3 ± 0,4%, przy jednoczesnym wzroście naprawy SSA (34,5 ± 1,8%; Rysunek 3B&#160; i Plik uzupełniający 4)14. Jest to najprawdopodobniej spowodowane tym, że zdarzenia naprawcze skierowane na rekombinację homologiczną są naprawiane alternatywnie poprzez wyżarzanie pojedynczych nici sekwencji powtórzonych white.
Drosophila wkład CtIP w efektywną naprawę HR w tkankach somatycznych
Algorytm TIDE umożliwia pomiar wyboru ścieżki naprawy w komórkach somatycznych. W tle niezmodyfikowanym NHEJ z przetwarzaniem występuje w 59,0% wykrywalnych zdarzeń naprawczych, a HR w 41,0% (Rycina 4B&#160;i Plik uzupełniający 4). CtIP odgrywa istotną rolę w inicjacji naprawy HR, promując resekcję końców DNA20W związku z tym w DmCtIP-/- Wstęp, wybór ścieżki HR jest wyraźnie zmniejszony w komórkach somatycznych – z 41,0% u kontroli heterozygotycznych do 10,9% u mutantów homozygotycznych (Rysunek 4B i Plik uzupełniający 4)16Sugeruje to, że w Muszka owocówka, CtIP przyczynia się do naprawy przez HR, ale nie jest dla niej niezbędny.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Test reportera DSB DR-white oraz wyniki naprawy. Test Direct Repeat of white zawiera dwie niefunkcjonalne kopie genu white: Sce.white (z insercją o długości 23 bp zawierającą miejsce rozpoznawania I-SceI i wprowadzającą przedwczesny kodon stop) oraz iwhite (sekwencję donora uciętą z obu końców 5′ i 3′). Krzyżowanie much zawierających DR-white oraz transgen I-SceI powoduje powstanie specyficznego dla miejsca DSB, które można analizować fenotypowo lub molekularnie. Wynikowe fenotypy to (A) potomstwo z białymi oczami (y+ w−), co wskazuje na brak DSB, HR między siostrzanymi chromatydami lub NHEJ; (B) potomstwo z czerwonymi oczami (y+ w+), co wskazuje na intrachromosomalną HR, która przywraca sekwencję SacI typu dzikiego z donora iwhite; oraz (C) potomstwo z żółtym ciałem i białymi oczami (y− w−), co wskazuje na SSA lub mitotyczny CO. Rycina dostosowana z Do et al.14. Skróty: CO = crossover; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = pęknięcie dwuniciowe; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; SSA = wyżarzanie jednoniciowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Rycina 2: Warianty testu DR-white. (A) Test DR-white.mu zawiera 28 cichych SNP w sekwencji donora iwhite.mu, co powoduje 1,4% dywergencję sekwencji między powtórzeniami bezpośrednimi. Konwersja genów poszczególnych polimorfizmów różni się w zależności od zdarzeń HR i może być określona poprzez sekwencjonowanie. (B) DR-white z donorem iwhiteΔ9 pozwala odróżnić rekombinację międzyhomologiczną od wewnątrzchromosomalnej. HR z wewnątrzchromosomalnego donora iwhite przywraca sekwencję SacI typu dzikiego i daje potomstwo z czerwonymi oczami. HR z międzyhomologicznego donora iwhiteΔ9 daje potomstwo z pomarańczowymi oczami, ponieważ delecja 9 bp zmniejsza ekspresję genu white. Rycina dostosowana z Do i wsp.14 oraz Fernandez i wsp.15. Skróty: DSB = pęknięcie dwuniciowe; HR = rekombinacja homologiczna; SNP = polimorfizm pojedynczego nukleotydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Schemat doświadczalny wykrywania wyników naprawy DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej. (A) Krzyżówka 1 łączy reporter DR-white (lub jego pochodną) z transgenem I-SceI (w tym przykładzie na drugim chromosomie). Potomstwo zawierające zarówno test DR-white, jak i transgen I-SceI zachowuje zdarzenia naprawy w linii zarodkowej i tkankach somatycznych. Aby przeanalizować poszczególne zdarzenia naprawy w linii zarodkowej przedmeiotycznej, potomstwo niosące oba transgeny krzyżuje się z muchami testerami y w (Krzyżówka 2), a potomstwo ocenia się zgodnie z opisem w Rycini 1. (B) Poszczególne zdarzenia naprawy DSB w linii zarodkowej u much typu dzikiego (n = 106 linii zarodkowych) oraz u mutantów homozygotycznych DmRad51 (n = 46 linii zarodkowych). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 w dwuczynnikowej analizie ANOVA, a następnie w teście wielokrotnych porównań Sidaka. Słupki reprezentują średnie; słupki błędów reprezentują SEM. Dane zostały ponownie przeanalizowane z pracy Do et al.14. Skróty: ANOVA = analiza wariancji; CO = crossover; DSB = pęknięcie dwuniciowe; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; SEM = standardowy błąd średniej; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Rycina 4: Schemat eksperymentalny wykrywania wyników naprawy DSB przy użyciu metody Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Muchy posiadające DR-white oraz indukowany transgen I-SceI są analizowane poprzez ekstrakcję gDNA, amplifikację PCR w obrębie miejsca DSB, sekwencjonowanie metodą Sangera oraz analizę TIDE z wykorzystaniem skryptu R. (B) Reprezentatywne dane z mutantów DmCtIP-/-&#160; (n = 23) i heterozygotycznych kontroli DmCtIP+/-&#160; (n = 31). Wykrywalne zdarzenia naprawy są obliczane jako suma HR oraz NHEJ z przetwarzaniem, z wyłączeniem braku DSB/NHEJ bez indeli. ****P &#60; 0,0001 w teście dwuczynnikowej ANOVA z następującym po niej testem wielokrotnych porównań Sidaka. Słupki reprezentują średnie; słupki błędów reprezentują SEM. Dane zostały ponownie przeanalizowane na podstawie pracy Thomas et al.16. Skróty: ANOVA = analiza wariancji; DSB = pęknięcie dwuniciowe; gDNA = genomowe DNA; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = nieshomologiczne łączenie końców; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; SEM = standardowy błąd średniej; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt TIDE w języku R służący do identyfikacji insercji i delecji w chromatogramach sekwencji w stosunku do kontroli bez DSB. Nazwa pliku kontrolnego, nazwy plików próbek oraz sekwencja docelowa I-SceI, które może edytować użytkownik, są zaznaczone pod koniec skryptu. Wymagane dane wejściowe, pliki wyjściowe oraz interpretacja są opisane w sekcji 2.3. Wymagane są pakiety sangerseqR oraz Biostrings.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Krok po kroku: przewodnik ze zrzutami ekranu po przepływie pracy skryptu TIDE w języku R. Panele ilustrują czynności w oprogramowaniu opisane w sekcji 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Przykładowe wyniki TIDE i obliczenia zdarzeń naprawy. Wartość 0-indel oznacza brak DSB lub NHEJ bez indeli; osobny wiersz HR reprezentuje kanoniczny produkt delecji o długości 23 bp; a wszystkie pozostałe wartości procentowe indeli są sumowane jako NHEJ z przetwarzaniem. Całkowita wykrywalna naprawa jest obliczana jako suma HR oraz NHEJ z przetwarzaniem.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Surowe dane stanowiące podstawę rysunku 3B i rysunku 4B, uporządkowane w oddzielnych edytowalnych arkuszach. Dane te zostały poddane ponownej analizie na podstawie wcześniej opublikowanych badań cytowanych w odpowiednich legendach do rysunków.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Test DR-white jest wszechstronnym testem z reporterem genetycznym służącym do wykrywania wyników naprawy pęknięć dwuniciowych DNA u organizmu wielokomórkowego Drosophila melanogaster.

Pomiar naprawy pęknięć dwuniciowych DNA przy użyciu testu DR-white u Drosophila melanogaster

Tradycyjne badania nad naprawą pęknięć dwuniciowych (DSB) DNA są często ograniczone do analiz biochemicznych lub systemów jednokomórkowych (np. komórek, ...

Nasze laboratorium interesuje się dziedziną integralności genomu, koncentrując się na tym, w jaki sposób komórki naprawiają pęknięcia dwuniciowe DNA. W przeciwieństwie do innych testów naprawy DNA, test Drosophila DR-white mierzy naprawę pęknięć dwuniciowych w kontekstach wielokomórkowych, w tym w komórkach somatycznych i linii zarodkowej.Po zakończeniu krzyżówek genetycznych i indukcji pęknięć dwuniciowych należy pozwolić na wylęg potomstwa krzyżówki testowej. Począwszy od momentu pojawienia się pierwszych much, należy oceniać potomstwo przez około dziewięć dni. Muchy należy znieczulić dwutlenkiem węgla lub przenieść do pustej fiolki bez pożywki i zamrozić w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut. Muchy należy umieścić na podkładce do much. W celu oceny należy zidentyfikować muchy niosące bezpośrednią powtórkę kasety white lub DR-white, wykorzystując fluorescencję RFP. Należy ocenić kolor oczu i ciała. Transgen y-plus sprzężony z kasetą DR-white nadaje ciału pośredni brązowy kolor, który nie jest w pełni typem dzikim. Muchy te należy porównać z RFP-ujemnym potomstwem o żółtym ciele i białych oczach, pozbawionym chromosomu DR-white, aby odróżnić brak pęknięcia dwuniciowego lub niehomologiczne łączenie końców od annealingu jednoniciowego. Muchy o ciemniejszych, bardziej brązowych ciałach należy zaklasyfikować jako brak pęknięcia dwuniciowego lub niehomologiczne łączenie końców. Do zestawu danych należy włączyć tylko te fiolki, w których oceniono co najmniej 20 much.Do analizy molekularnej zdarzeń naprawczych należy zebrać muchy poddane szokowi termicznemu, niosące transgeny DR- white oraz I-SceI, podobnie jak w potomstwie z Krzyżowania 1. Pojedyncze muchy należy umieścić w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zamrozić szokowo w kąpieli z suchego lodu i etanolu. Każdą próbkę należy zhomogenizować w 50 µL buforu A przy użyciu homogenizatora elektrycznego. Następnie próbki inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Do każdej próbki należy dodać 100 µL buforu B i krótko wymieszać poprzez odwracanie probówek. Próbki inkubuje się na lodzie przez co najmniej 30 minut, a następnie wirować przy około 16 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 125 µL klarownego supernatantu należy przenieść do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, unikając pobrania osadu. Należy dodać 100 µL izopropanolu i krótko wymieszać poprzez odwracanie probówki. Próbki należy wirować przy około 16 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć pelletu DNA. Pellet należy przemyć 250 µL lodowatego 70% etanolu i delikatnie wymieszać poprzez odwracanie probówki. Próbki wirować przy około 16 000 g przez pięć minut w temperaturze 4 °C i ponownie odessać supernatant. Probówkę należy pozostawić otwartą w temperaturze pokojowej w celu odparowania resztkowego etanolu, unikając nadmiernego wysuszenia pelletu. Następnie należy dodać 20 µL wody wolnej od nukleaz i pozostawić pellet do rekonstytucji przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia należy delikatnie opukać probówkę, aby wymieszać zawartość, i zmierzyć stężenie DNA.Przeprowadzić amplifikację regionu Sce.white metodą PCR, wykorzystując 100 ng genomowego DNA oraz startery DR- white forward i reverse. Do reakcji należy włączyć genomowe DNA z muchy kontrolnej DR- white pozbawionej transgenu I-SceI, a następnie przeprowadzić reakcję zgodnie z odpowiednimi warunkami cyklu. Około 2 µL produktu PCR nanieść na żel 1% Tris-acetate-EDTA, aby potwierdzić amplifikację Sce.white. Po potwierdzeniu, że amplikon ma wielkość około 1,7 kb, należy oczyścić amplikony Sce.white. Zmierzyć stężenie DNA i przeprowadzić sekwencjonowanie oczyszczonego produktu PCR przy użyciu startera sekwencyjnego DR- white.Po pobraniu wymaganych pakietów R, przeanalizuj chromatogramy sekwencji i do dalszej analizy wybierz tylko te, które wykazują niewielki lub żaden szum tła przed miejscem pęknięcia. Pobierz pliki śladów sekwencji z rozszerzeniem .ab1. Umieść je wszystkie w jednym folderze komputerowym i maksymalnie uprość nazwy plików sekwencji. Otwórz skrypt R Tracking of Indels by DEcomposition (TIED) w zintegrowanym środowisku programistycznym RStudio. W panelu źródłowym znajdź linię zaczynającą się od control i wprowadź nazwę pliku sekwencji kontrolnej dokładnie tak, jak została zapisana, wraz z rozszerzeniem w cudzysłowie. Znajdź linię zaczynającą się od sample name i wprowadź nazwę pliku sekwencji dla każdej próbki w nawiasach, umieszczając każdą nazwę pliku w osobnych cudzysłowach i oddzielając je przecinkami. Następnie zapisz zmodyfikowany skrypt TIED R w tym samym folderze, w którym znajdują się sekwencje do analizy. W zintegrowanym środowisku programistycznym przejdź do folderu TIED, korzystając z karty Files w panelu wyjściowym. Kliknij menu rozwijane More i wybierz Open New Terminal Here. W nowo otwartym terminalu wpisz R i naciśnij Enter. Gdy program R zostanie uruchomiony, wykonaj skrypt TIED R, wpisując komendę source wraz z nazwą pliku skryptu, a następnie naciśnij Enter. Skrypt generuje reprezentację graficzną oraz plik wartości rozdzielonych przecinkami (CSV) zawierający surowe dane dla każdej próbki. Otwórz każdy plik CSV i zinterpretuj surowe dane jako proporcje indeli w sekwencji próbki. Na koniec zidentyfikuj kanoniczną delecję o długości 23 bp, raportowaną oddzielnie na dole wyników jako wartość rekombinacji homologicznej. Wartość 0 dla indeli interpretuj jako brak pęknięcia dwuniciowego lub łączenie końców niehomologicznych bez indeli, a pozostałe wartości indeli zsumuj, aby określić łączenie końców niehomologicznych z przetwarzaniem.Udane eksperymenty w linii zarodkowej dostarczyły oczekiwanych klas fenotypowych i co najmniej 20 ocenialnych potomków na fiolkę. U much typu dzikiego wykazujących indukowalną szokiem termicznym aktywność I-SceI, rekombinacja homologiczna wystąpiła w około 38,5% potomstwa, w porównaniu do 3,2% w przypadku przyłączania pojedynczych nici. W homozygotycznym tle mutanta DmRad51 naprawa poprzez rekombinację homologiczną została zredukowana do około 1,3%, przy jednoczesnym wzroście naprawy poprzez przyłączanie pojedynczych nici do około 34,5%. W komórkach somatycznych o tle niemutacyjnym niehomologiczne łączenie końców z przetwarzaniem stanowiło około 59% wykrywalnych zdarzeń naprawczych, a rekombinacja homologiczna 41%. W homozygotycznym tle mutanta DmCtIP wybór ścieżki rekombinacji homologicznej został zredukowany do 10,9%.Niniejszy protokół można zastosować do różnych tkanek, stadiów rozwojowych i lokalizacji genomowych w celu określenia czynników wpływających na naprawę. Ponadto test ten został zmodyfikowany w celu pomiaru wyników naprawy, takich jak długości śladów konwersji genowej oraz preferencje matrycy naprawczej. Ten test naprawy DNA może być wykorzystany do określenia różnych czynników zaangażowanych w naprawę przy użyciu mutantów genetycznych u Drosophila.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj metodę DR-white do pomiaru naprawy pęknięć dwuniciowych DNA u Drosophila melanogaster. Protokół umożliwia rozróżnienie szlaków HR, NHEJ i SSA w organizmie wielokomórkowym.

Pomiar naprawy pęknięć dwuniciowych DNA przy użyciu testu DR-white u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów