Generowanie komórek iPS z MEFS poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Ponad 50 lat temu wysunięto hipotezę, że nieuleczalnie zróżnicowane komórki, takie jak fibroblasty skóry, mogą zostać zmuszone do przyjęcia stanu pluripotencjalnego podobnego do embrionalnych komórek macierzystych. Podstawą tej koncepcji była obserwacja, że wszystkie typy komórek, z kilkoma drobnymi wyjątkami, mają ten sam kod genetyczny, a jedyną różnicą między typami komórek jest sposób odczytywania kodu. Ta zdolność do zmiany tożsamości komórkowej zróżnicowanej komórki na stan pluripotencjalny nazywana jest przeprogramowaniem komórkowym.

Po pół dekadzie badań wykazano niedawno, że wymuszona ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych może przeprogramować fibroblasty skóry tak, aby stały się pluripotencjalne. Wpływ tego odkrycia jest ogromny. Poza znaczeniem dla biologii podstawowej, przezwycięża ona również główne zastrzeżenia etyczne dotyczące stosowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w terapii transplantacyjnej.

Aby doszło do przeprogramowania, cztery geny kodujące czynniki transkrypcyjne OC cztery sox, dwa cmic i K cztery, muszą zostać zapakowane i umieszczone w kulturze tkankowej lentiwirusa. Pożywkę zawierającą oczyszczonego wirusa dodaje się następnie do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego dużą gęstość fibroblastów, a wewnątrz tej płytki dzieje się coś niesamowitego. Niewielka część fibroblastów zostaje zakażona wszystkimi czterema czynnikami transkrypcyjnymi przenoszącymi wirusy i zaczyna się różnicować.

Przechodzą drastyczne zmiany w swojej morfologii i proliferacji i zaczynają dzielić się na duże duchowe skupiska utworzonych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po dwóch do trzech tygodniach hodowli w warunkach embrionalnych komórek macierzystych, kolonie przeprogramowanych fibroblastów mogą być ręcznie izolowane i namnażane in vitro. Po oczyszczeniu komórki te można wykorzystać do wytworzenia chimerycznych myszy, w których pewien procent komórek pochodzi z tych zróżnicowanych fibroblastów, które mogą przyczyniać się do różnych tkanek myszy.

W dzwonkach, w których materiał genetyczny pierwotnych fibroblastów przyczynił się do powstania linii zarodkowej, kod genetyczny jest przekazywany następnemu pokoleniu, a następnie następnemu i następnemu. Chociaż stosowanie systemu dostarczania wirusów jest obecnie przeszkodą w zastosowaniach klinicznych, prawdopodobnie zostanie to przezwyciężone w krótkim czasie. W tym filmie członkowie laboratorium yin zademonstrują, w jaki sposób indukowane silne komórki macierzyste pochodzą z mysich fibroblastów embrionalnych.

Cześć, nazywam się Grant Welted i pracuję w laboratorium Rudolpha Jisha w Instytucie Badań Biomedycznych Whitehead w Cambridge w stanie Massachusetts. A ja jestem Tobias Bro brink również z ish lab. Dzisiaj pokażemy Państwu generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wprowadzenie czterech CDNA, OCT cztery, SOX, dwóch, CIC, KF, czterech przy użyciu lentiwirusów, które eksprymują te cztery CDNA z promotora Tet OCMV.

Pozwala to na precyzyjną kontrolę ekspresji tych czterech transgenów po zakażeniu mysich fibroblastów embrionalnych. Protokół, który dzisiaj pokazujemy, obejmuje postępowanie z lentiwirusem, który może zainfekować ludzkie komórki. Bardzo ważne jest, aby zawsze postępować zgodnie z procedurami bezpieczeństwa i skontaktować się z biurem bezpieczeństwa, zanim spróbujesz zrobić to samodzielnie.

Wygenerujmy więc kilka komórek IPS, aby wygenerować lentiwirusa, który przekształci mes w komórki IPS. 2 9 3 komórki muszą być transfekowane trzema plazmidami Paks dwa, które dostarczają wymaganych elementów genetycznych do pakowania wirusa. Szkielet wirusowy, który jest lentiwirusem FUW TE OCMV z jednym z czterech CD aids T cztery SOX dwa, KLA cztery lub CMIC PMDG, który wyraża glikoproteinę otoczki wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej lub VSV.

To sprawia, że wirus, który będzie generował wirusa atropowego. Dlatego należy przestrzegać odpowiednich procedur BL dwa plus. W tym konkretnym filmie tak naprawdę nie mamy do czynienia z zakaźnym wirusem, więc nie nosimy naszych typowych fartuchów i nie jesteśmy w naszym obiekcie BL two plus.

Przed transfekcją 2, 9 3 komórek rozmraża się z ciekłego azotu i hoduje do 90% płynności Co Komórki są następnie transfekowane genem FU i mają od 48 do 72 godzin na ekspresję wirusa, w którym to czasie pożywka kąpiąca komórki jest filtrowana za pomocą filtra 0,45 mikrona i zagęszczana za pomocą ultrawirowania po zagęszczeniu wirusa. Jesteśmy teraz gotowi do zainfekowania MES w celu wygenerowania klastrów IPS Podczas etapów przygotowania wirusa, pasaż fibroblastów embrionalnych myszy mniej niż trzy razy jest rozwijany do 90% płynności CO w 10-centymetrowych szalkach, około dwa razy 10 do sześciu komórek na szalkę. W tym konkretnym protokole eksperymentalnym używamy MES, które wyrażają RTTA, co ma kluczowe znaczenie dla ekspresji doksycykliny i GFP z endogennego locus OC cztery.

MES są GFP ujemne, ale prawdziwe komórki IPS stają się GFP dodatnie. Marker ten pozwala na metodę, za pomocą której można zidentyfikować przeprogramowane mes, odessać pożywkę hodowlaną z fibroblastów i przemyć 10 mililitrami hipisów, EDTA, odrzucić hipisowskie EDTA i dodać pięć mililitrów jednorazowej trypsyny i inkubować w temperaturze 37 stopni przez 10 minut. Trypsyna pomoże podnieść komórki z dna naczyń.

Teraz dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić komórki w zawiesinie pojedynczej komórki i przenieść do probówki o grubości 15 mil. Komórki te są następnie odwirowywane i granulowane. Po ponownym zawieszeniu osadu zlicza się liczbę komórek w zawiesinie, a stężenie dostosowuje się do ośmiu razy 10 do czterech komórek na promil.

10 milisów zawiesiny komórkowej przenosi się następnie do 10-centymetrowego naczynia pokrytego żelatyną. Inkubuj szalkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 po nocnej inkubacji, pożywka z naczynia fibroblastów jest odsysana i dodaje się 10 milicali pożywki zawierającej wirusa do metamfetaminy. Inkubuj komórki od czterech godzin do nocy w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.

Następnego dnia odessaj pożywkę z naczynia do obróbki strumieniowo-ściernej, a następnie dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki ESL. Na tym etapie komórki mogą zostać zamrożone, rozprężone lub przygotowane do zainicjowania przeprogramowania. Aby zainicjować przeprogramowanie, zastąp zwykłą pożywkę ESL pożywką zawierającą doksycyklinę, aby zainicjować ekspresję czterech genów.

Umieść te komórki w inkubatorze, zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie staną się wystarczająco duże, aby można je było pobrać. Kolonie powinny stać się widoczne po około tygodniu od rozpoczęcia przeprogramowania. Powinny stać się wystarczająco duże, aby można je było zebrać około 20 dnia.

Teraz, gdy minęło 20 dni, możemy śmiało wybrać kolonie IPS przed zebraniem kolonii. Należy pamiętać, aby zobaczyć wymaganą liczbę 24-dołkowych płytek pokrytych żelatyną z napromieniowanymi promieniami gamma DR cztery mity na jedną do dwóch godzin przed pobraniem. Należy karmić kolonie na płytkach, dodając świeżą pożywkę tuż przed pobraniem, dodać 50 mikrolitrów buforu HEPA do studzienek naczynia 96 Well z dnem V bezpośrednio przed pobraniem, umyć naczynie zawierające kolonie, które mają być zebrane raz, za pomocą PBS i dodać 10 ml PBS do naczynia Klastry komórek IPS można pobrać pod mikroskopem stereo lub odwróconym.

Zbierz kolonie za pomocą małej końcówki pipety i przenieś je do dołka w naczyniu z 96 dołkami zawierającym PBS w celu usunięcia skupisk. Wokół klastra rysowany jest okrąg z końcówką pipety, aby rozbić matematykę. Teraz przeprogramowane komórki można teraz wyekstrahować za pomocą pipetera wielokanałowego, do każdej dodaje się 20 mikrolitrów tripsiny.

Dobrze go przerurować w górę iw dół trzy razy, inkubować w temperaturze 37 stopni C przez cztery minuty. Po czterominutowej inkubacji do kolonii tripps dodaje się 100 mikrolitrów pożywki ES. Przepuść go w górę i w dół 10 razy i przenieś sześć klonów na raz.

Od naczynia z 96 dołkami do naczynia z 24 dołkami za pomocą końcówki w co drugiej pozycji w 12 miejscach komórki pipetera są następnie hodowane na 24-dołkowej płytce w inkubatorze 5% CO2 o temperaturze 37 centów, aż komórki osiągną płynność 80 do 90% Co, dopasowując delikatesy z komórkami ES, komórki pożywki będą prawdopodobnie gotowe do ekspansji w ciągu trzech do siedmiu dni Kilka dni później. Teraz, gdy komórki IPS zlewają się, odessaj pożywkę i całkowicie umyj komórki jednym milionem hipisów Usuń hipisów i dodaj 100 mikrolitrów jednorazowej trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji z trypsyną dodać 400 mikrolitrów pożywki ESL i zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół, a następnie wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.

Zawiesina jednokomórkowa o pojemności 500 mikrolitrów z 24-dołkowej płytki jest następnie przenoszona do pojedynczej studzienki na płytce sześciodołkowej i inkubowana w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aż komórki osiągną płynność 80 do 90% CO w płytce sześciodołkowej. W tym momencie możesz przystąpić do amplifikacji komórek do analizy południowej, blastów, zastrzyków, testów potworniaka lub testów różnicowania in vitro. I należy pamiętać o zamrożeniu zaworów magazynowych tych ogniw, aby nie stracić tego cennego zapasu ogniw IPS.

Właśnie pokazaliśmy, jak indukować pluripotencję w fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą indukowalnego systemu przeciwwirusowego. Więc dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.