Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Ponad 50 lat temu postawiono hipotezę, że komórki w pełni zróżnicowane, takie jak fibroblasty skóry, mogą zostać zmuszone do przejścia w stan pluripotencyjny, podobny do stanu embrionalnych komórek macierzystych. Podstawą tego konceptu była obserwacja, że wszystkie typy komórek, z kilkoma niewielkimi wyjątkami, posiadają ten sam kod genetyczny i że jedyną różnicą między typami komórek jest sposób odczytywania tego kodu. Zdolność do zmiany tożsamości komórkowej zróżnicowanej komórki na stan pluripotencyjny nazywana jest przeprogramowaniem komórkowym.

Po pięciu latach badań niedawno wykazano, że wymuszona ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych może przeprogramować fibroblasty skóry, nadając im pluripotencję. Znaczenie tego odkrycia jest ogromne. Poza istotnością dla biologii podstawowej, pozwala ono również przełamać główne zastrzeżenia etyczne dotyczące wykorzystania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w terapii przeszczepowej.

Aby doszło do przeprogramowania, cztery geny kodujące czynniki transkrypcyjne Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4 muszą zostać zapakowane i wprowadzone do hodowli tkankowej lentiwirusów. Następnie do naczynia z hodowlą komórkową zawierającą wysoką gęstość fibroblastów dodaje się pożywkę z oczyszczonym wirusem, po czym w naczyniu zachodzi niezwykłe zjawisko. Niewielka frakcja fibroblastów zostaje zainfekowana wszystkimi czterema wirusami przenoszącymi czynniki transkrypcyjne i zaczyna ulegać dedyferencjacjach.

Ulegają one drastycznym zmianom w morfologii i proliferacji, a następnie zaczynają dzielić się, tworząc duże sferoidalne skupiska pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po dwóch do trzech tygodniach hodowli w warunkach przeznaczonych dla embrionalnych komórek macierzystych, kolonie przeprogramowanych fibroblastów mogą zostać wyizolowane manualnie i powielone in vitro. Po oczyszczeniu komórki te mogą zostać wykorzystane do generowania myszy chimerycznych, w których określony procent komórek pochodzących z tych dedyferencjonowanych fibroblastów może przyczynić się do budowy różnych tkanek myszy.

W chimerach, w których materiał genetyczny pierwotnych fibroblastów wbudował się do linii zarodkowej, kod genetyczny jest przekazywany kolejnym pokoleniom. Choć wykorzystanie wirusowego systemu dostarczania stanowi obecnie przeszkodę w zastosowaniach klinicznych, prawdopodobnie zostanie to wkrótce rozwiązane. W tym filmie członkowie laboratorium Yin zaprezentują, w jaki sposób indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są otrzymywane z embrionalnych fibroblastów myszy.

Witajcie, jestem Grant Welted z laboratorium Rudolpha Jisha w Whitehead Institute for Biomedical Research w Cambridge w stanie Massachusetts. A ja jestem Tobias Bro brink, również z laboratorium Jisha. Dzisiaj zaprezentujemy proces generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wprowadzenie czterech cDNA: OCT four, SOX two, CIC oraz KF four, przy użyciu lentiwirusów wykazujących ekspresję tych czterech cDNA z promotora Tet OCMV.

Umożliwia to precyzyjną kontrolę ekspresji tych czterech transgenów po infekcji embrionalnych fibroblastów myszy. Protokół, który prezentujemy dzisiaj, wiąże się z obchodzeniem się z lentiwirusem, który może potencjalnie infekować komórki ludzkie. Jest kluczowe, aby zawsze przestrzegać procedur bezpieczeństwa i skontaktować się z biurem ds. bezpieczeństwa przed samodzielną próbą wykonania tej procedury.

Wygenerujmy zatem komórki iPS, aby wytworzyć lentiwirusy, które przekształcą komórki mezenchymalne w komórki iPS. Komórki 293 muszą zostać przetransfekowane trzema plazmidami: Pak스로 2, który dostarcza niezbędnych elementów genetycznych do pakowania wirusa; szkieletem wirusowym, którym jest lentiwirus FUW TE OCMV z jednym z czterech czynników CD aids T4, SOX 2, KLA 4 lub CMIC PMDG; oraz plazmidem wykazującym ekspresję glikoproteiny otoczki wirusa zapalenia pęcherzykowego stanu jamowego lub VSV.

W ten sposób powstaje wirus, który posłuży do generowania wirusa atropowego. W związku z tym należy przestrzegać odpowiednich procedur poziomu BSL-2+. W tym konkretnym filmie nie pracujemy z wirusem zakaźnym, dlatego nie mamy na sobie typowych fartuchów ochronnych i nie znajdujemy się w naszej placówce BSL-2+.

Przed transfekcją komórki 2, 9 3 są rozmrażane z ciekłego azotu i hodowane do 90% konfluencji. Następnie komórki są transfekowane genem FU i inkubowane przez 48 do 72 godzin w celu ekspresji wirusa; po tym czasie pożywka hodowlana jest filtrowana za pomocą filtra 0,45 mikrona i zagęszczana metodą ultrawirowania. Po zagęszczeniu wirusa jesteśmy gotowi do infekcji MES w celu generowania klastrów IPS. Podczas etapów przygotowania wirusa, embrionalne fibroblasty mysie o numerze pasażu mniejszym niż trzy są hodowane do 90% konfluencji w szalkach 10 centymetrowych, przy zastosowaniu około 2×10⁶ komórek na szalkę. W tym konkretnym protokole eksperymentalnym używamy MES wykazujących ekspresję RTTA, co jest kluczowe dla ekspresji doksycykliny oraz GFP z endogennego locus OC4.

Komórki MES są negatywne pod kątem GFP, natomiast prawdziwe komórki iPS stają się pozytywne pod kątem GFP. Marker ten umożliwia zastosowanie metody identyfikacji przeprogramowanych komórek MES. Odessać pożywkę hodowlaną z fibroblastów i przemyć 10 ml PBS-EDTA, odrzucić PBS-EDTA, dodać 5 ml trypsyny 1x i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Trypsyna pomoże odkleić komórki od dna naczyń.

Następnie dodaj 9 ml pożywki hodowlanej, aby resuspenderć komórki w formie zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Komórki te są następnie wirowane w celu uzyskania osadu. Po resuspensji osadu należy policzyć liczbę komórek w zawiesinie i dostosować ich stężenie do poziomu 8 × 10⁴ komórek/ml.

Następnie 10 ml zawiesiny komórkowej przenosi się do 10-centymetrowej płytki powlekanej żelatyną. Płytkę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po nocnej inkubacji medium z płytki z fibroblastami odsysa się i dodaje 10 ml medium zawierającego wirusa. Komórki inkubuje się od czterech godzin do całej nocy w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Następnego dnia odessaj pożywkę z płytki z fibroblastami, a następnie dodaj 10 ml świeżej pożywki ESL. Na tym etapie komórki można zamrozić, namnożyć lub przygotować do rozpoczęcia przeprogramowania. Aby zainicjować przeprogramowanie, zastąp zwykłą pożywkę ESL pożywką zawierającą doksycyklinę, aby wywołać ekspresję czterech genów.

Umieść te komórki w inkubatorze i zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie osiągną odpowiednią wielkość do pobrania. Kolonie powinny stać się widoczne mniej więcej tydzień po rozpoczęciu reprogramowania. Powinny osiągnąć wielkość umożliwiającą ich pobranie około 20. dnia.

Po upływie 20 dni można przystąpić do pobierania kolonii iPS przed selekcją poszczególnych kolonii. Należy pamiętać o przygotowaniu wymaganej liczby 24-dołkowych płytek pokrytych żelatyną z gamma-naświetlonym DR four myths na jedną do dwóch godzin przed pobieraniem. Przed samym pobieraniem należy zasilić kolonie na płytkach, dodając świeżą pożywkę. Bezpośrednio przed pobieraniem należy dodać 50 µL buforu HEPA do dołków V-kształtnej płytki 96-dołkowej. Płytkę zawierającą kolonie do pobrania należy jednorazowo przemyć PBS, a następnie dodać do niej 10 ml PBS. Agregaty komórek iPS można pobierać przy użyciu mikroskopu stereoskopowego lub odwróconego.

Za pomocą końcówki małej pipety pobierz kolonie i przenieś je do dołka płytki 96-dołkowej zawierającej PBS, aby usunąć skupiska. Końcówką pipety wykonaj ruchy okrężne wokół skupiska, aby rozbić agregaty komórek. Obecnie przeprogramowane komórki można wyekstrahować za pomocą pipety wielokanałowej, dodając 20 µL trypsyny do każdego dołka.

Przenieś zawiesinę w górę i w dół pipetą trzy razy, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery minuty. Po czterominutowej inkubacji dodaj 100 µL pożywki ES do kolonii. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, a następnie przenoś po sześć klonów naraz.

Przenieś komórki z naczynia 96-dołkowego do naczynia 24-dołkowego, używając końcówki w co drugiej pozycji pipety wielokanałowej (12-miejscowej). Następnie hoduj komórki na płytce 24-dołkowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2, aż osiągną 80-90% konfluencji, uzupełniając medium dla komórek ES. Komórki będą prawdopodobnie gotowe do pasażowania w ciągu trzech do siedmiu dni. Po kilku dniach, gdy komórki iPS osiągną konfluencję, odessij medium i przemyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS i dodaj 100 µl 1x trypsyny, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez 10 minut. Po inkubacji z trypsyną dodaj 400 µl medium ESL i resuspenduj komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Następnie 500 µL zawiesiny pojedynczych komórek z płytki 24-dołkowej przenosi się do jednego dołka płytki 6-dołkowej i inkubuje w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż komórki osiągną konfluencję na poziomie 80 do 90% w płytce 6-dołkowej. W tym momencie można przystąpić do amplifikacji komórek w celu analizy Southern, uzyskania blastocyst, iniekcji, testów teratoma lub testów różnicowania in vitro. Należy pamiętać o zamrożeniu zapasowych fiolek tych komórek, aby nie utracić tego cennego zasobu komórek iPS.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak indukowć pluripotencję w embrionalnych fibroblastach mysich przy użyciu indukowalnego systemu przeciwwirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa eksperymentach.