Name: Generowanie komórek iPS z MEFS poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Poznaj metodę generowania komórek iPS z fibroblastów zarodowych myszy przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół obejmuje transfekcję, infekcję i izolację kolonii pluripotentnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Krok 1:
Rozmrozić komórki 293 i wysiać je w celu produkcji lentiwirusa.
<ol>
<li>Przygotuj 9 ml pożywki DMEM+ w probówce 15-ml.</li>
<li>Wyjmij fiolkę z zamrożonymi zapasami komórek 293 z pojemnika z ciekłym azotem i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż większość (ale nie wszystkie) komórek zostanie rozmrożona.</li>
<li>Przenieś komórki z fiolki do zamrażania do probówki 15-ml z kroku 1.</li>
<li>Wiąrź przez 5 min przy 180g, a następnie odlej nadsącz.</li>
<li>Resuspenduj komórki w 10 ml pożywki DMEM+ i przenieś je na powlekaną żelatyną płytkę 100-mm. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 aż osiągną 80–90% konfluencji.</li>
<li>Pasażowanie komórek 293: przemyj komórki buforem PBS, odciągnij PBS, dodaj 4 ml 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA na płytkę 10-cm i inkubuj przez 1 min w 37°C.</li>
<li>Odspój komórki z płytek poprzez delikatne opukiwanie, resuspenduj w 10 ml pożywki DMEM+ i przenieś do probówki 15-ml. Wiąrź przez 5 min przy 180g, a następnie odciągnij nadsącz.</li>
<li>Dodaj odpowiednią objętość pożywki DMEM+ i rozbij skupiska komórek do postaci pojedynczej zawiesiny poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół.</li>
<li>Policz komórki i dostosuj ich stężenie do poziomu 8x105 komórek na ml za pomocą pożywki FP.</li>
<li>Zasieją komórki w ilości 8x106 komórek (10 ml) na płytkę hodowlaną 100-mm i inkubuj przez noc w 37°C, 5% CO2.</li>
</ol>
Krok 2:
Transfekcja komórek 293 plazmidami lentiwirusowymi i zbiór wirusa
<ol>
<li>Dla każdej płytki 10-cm użyj 10 µg wektora lentiwirusowego FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 lub c-Myc) wraz z 2,5 µg pMD-G i 7,5 µg pPax2.</li>
<li>Podczas odmierzania trzech plazmidów do probówki, dodaj 30 µl odczynnika do transfekcji Fugene 6 do drugiej probówki zawierającej 500 µl DMEM bez surowicy, wymieszaj delikatnie, opukując probówkę palcem, i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodawaj mieszaninę DNA kroplami do probówki z Fugene 6/DMEM, wymieszaj delikatnie, opukując probówkę palcem, i inkubuj przez 20 min.</li>
<li>Dodaj kompleks DNA/Fugene 6 kroplami do naczynia z komórkami 293 i inkubuj przez noc w 37°C, 5% CO2.</li>
<li>Następnego ranka: odessaj medium zawierające odczynnik do transfekcji, dodaj 5 ml świeżego medium do komórek ES i wprowadź komórki z powrotem do inkubatora.</li>
<li>W 48. i 72. godzinie po transfekcji pobierz medium z komórek 293 za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki 10-ml, przefiltruj je przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm i przelej do probówki 15-ml.</li>
<li>Skoncentruj nadsącz wirusowy za pomocą ultrawirowania. Resuspenduj pellet wirusowy w pożąganej objętości i przygotuj mieszaninę składającą się z równych części medium zawierającego lentiwirusy Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- oraz c-Myc-.</li>
<li>Podczas przygotowywania wirusa, doprowadź MEF Oct4-neo/rtTA lub Oct4-GFP/rtTA (pasaż &lt;3) do 90% konfluencji w płytkach 10-cm (2x106 komórek na płytkę).</li>
<li>Odessaj medium hodowlane i przemyj komórki 10 ml PBS.</li>
<li>Wylej PBS, dodaj 1 ml na płytkę 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubuj w 37°C przez 10 min.</li>
<li>Dodaj 9 ml medium hodowlanego, zresuspenduj komórki do postaci pojedynczych komórek i przenieś do probówki 15-ml.</li>
<li>Policz liczbę komórek i dostosuj stężenie do 8x104 komórek na ml. Przenieś 10 ml zawiesiny komórkowej (8x105 komórek) na płytkę 10-cm pokrytą żelatyną. Inkubuj płytkę przez noc w 37°C, 5% CO2.</li>
<li>Odessaj medium z płytki z fibroblastami i dodaj 10 ml medium zawierającego wirusa. Inkubuj komórki od 4 h do całej nocy w 37°C, 5% CO2.</li>
<li>Po 24 h odessaj medium z płytki z fibroblastami i dodaj 10 ml świeżego medium do komórek ES.</li>
<li>Zastąp zwykłe medium do komórek ES medium zawierającym doksycylinę, aby zainicjować ekspresję czterech genów; innymi słowy, rozpocznij reprogramowanie.</li>
<li>W przypadku użycia reportera Oct4-neo, rozpocznij selekcję lekową w dowolnym czasie między 6. a 9. dniem.</li>
<li>Wymieniaj medium codziennie, aż kolonie staną się wystarczająco duże, aby można było je pobrać. Kolonie powinny stać się widoczne mniej więcej tydzień po rozpoczęciu reprogramowania. Powinny osiągnąć rozmiar umożliwiający pobranie około 20. dnia.</li>
</ol>
Krok 3:
Zbieranie kolonii iPS
Dzień przed zbiorem:
<ol>
<li>Zasiać odpowiednią liczbę γ-naświetlonych MEF z linii DR4 na płytki 24-dołkowe powlekane żelatyną</li>
</ol>
Wybieranie klonów w dniu 1.:
<ol>
<li>Dokarm kolonie na płytkach 1-2 godziny przed ich pobraniem.</li>
<li>Dodaj 15 μl PBS do studni płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.</li>
<li>Przepłucz raz PBS płytkę zawierającą kolonie do pobrania, a następnie dodaj do niej 10ml PBS.</li>
<li>Pobieraj kolonie za pomocą małych końcówek do pipet o objętości 5μl (ustaw pipetę P20 na 4 μl). Przenieś kolonie do studni w płytce 96-dołkowej.</li>
<li>Dodaj 20 μl trypsyny do każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej (12-kanałowej). Pipetuj w górę i w dół 3 razy. Inkubuj w temperaturze 37°C przez 4 minuty.</li>
<li>Dodaj 100 μl pożywki ES do trypsynizowanych kolonii. Pipetuj w górę i w dół 10 razy. Przenieś po 6 klonów jednocześnie z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, używając końcówki w co drugiej pozycji 12-kanałowej pipety.</li>
<li>Hoduj komórki na płytce 24-dołkowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 aż do osiągnięcia konfluencji 80–90%, codziennie dodając pożywkę dla komórek ES. Komórki będą prawdopodobnie gotowe do pasażowania w ciągu 3-7 dni.</li>
</ol>
Krok 4
<ol>
<li>Ekspansja komórek iPS <ol>
<li>Odssać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS.</li>
<li>Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,1 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w 37°C przez 10 min.</li>
<li>Dodać 0,4 ml pożywki ES i zawiesić komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do dołka płytki 6-dołkowej, dodać 1,5 ml pożywki dla komórek ES i inkubować w inkubatorze w 37°C i 5% CO2, aż komórki osiągną 80–90% konfluencji w płytkach 6-dołkowych. W tym momencie przygotować zamrożony stok komórek w następujący sposób.</li>
</ol></li>
<li>Przygotowanie stoku zamrożonego <ol>
<li>Odssać pożywkę i przemyć komórki 2 ml PBS.</li>
<li>Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w 37°C przez 10 min.</li>
<li>Dodać 2 ml pożywki ES i zawiesić komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15-ml, policzyć liczbę komórek i odwirować komórki.</li>
<li>Odlać nadsącz, ponownie zawiesić komórki w pożywce ES do stężenia 2x106 komórek na ml.</li>
<li>Przygotować pożywkę do zamrażania komórek ES (20% DMSO w pożywce ES) i rozdzielić ją w ilości 0,5 ml na fiolkę.</li>
<li>Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do fiolek do zamrażania i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania komórek i przechowywać w -80°C przez noc; następnego dnia przenieść do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.</li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

W tym filmie demonstrujemy, jak wykorzystać indukowalny system lentiwirusowy do generowania pluripotencjalnych komórek iPS dodatnich pod względem GFP z MEF pochodzących od myszy Oct4-GFP/R26-M2rtTA oraz Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Procedura ta stanowi użyteczną metodę generowania komórek iPS, ponieważ pozwala na kontrolę ekspresji transgenu podczas procesu reprogramowania. Choć zastosowanie wirusów w generowaniu komórek iPS utrudnia ich wykorzystanie w warunkach klinicznych, procedura ta umożliwia udzielenie odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań biologicznych, które leżą u podstaw wciąż definiowanego procesu reprogramowania.

<table><tbody><tr><td>Hiclian doksycyklina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie komórek ips z mef poprzez wymuszoną ekspresję sox-2, oct-4, c-myc i klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotencję można indukować w zróżnicowanych komórkach mysich poprzez transdukcję wirusową Oct4, Sox2, Klf4 oraz c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). Opracowaliśmy strategię reprogramowania, w której te cztery czynniki transkrypcyjne są eksprymowane z wektorów lentiwirusowych indukowanych doksycykliną (dox) (Brambrink et al., 2008). Wykorzystując te indukowalne konstrukty, możemy otrzymywać indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) z embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs). W tym filmie przedstawiamy procedurę generowania indukowalnych lentiwirusów eksprymujących cztery czynniki transkrypcyjne oraz pokazujemy, jak zainfekować MEFs tymi wirusami w celu wytworzenia komórek iPS. Dzięki zastosowaniu indukowalnych lentiwirusów ekspresja czterech czynników jest kontrolowana poprzez dodanie doksycykliny do pożywki hodowlanej. Przewagą tego systemu nad tradycyjną infekcją retrowirusową jest możliwość włączania i wyłączania genów, co pozwala na szczegółową analizę kinetyki reprogramowania oraz wymagań dotyczących ekspresji genów.

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Pluripotencję można indukować w zróżnicowanych komórkach mysich poprzez transdukcję wirusową Oct4, Sox2, Klf4 oraz c-Myc (Takahashi i Yamanaka, 2006; Wernig i in., ...

Ponad 50 lat temu postawiono hipotezę, że komórki w pełni zróżnicowane, takie jak fibroblasty skóry, mogą zostać zmuszone do przejścia w stan pluripotencyjny, podobny do stanu embrionalnych komórek macierzystych. Podstawą tego konceptu była obserwacja, że wszystkie typy komórek, z kilkoma niewielkimi wyjątkami, posiadają ten sam kod genetyczny i że jedyną różnicą między typami komórek jest sposób odczytywania tego kodu. Zdolność do zmiany tożsamości komórkowej zróżnicowanej komórki na stan pluripotencyjny nazywana jest przeprogramowaniem komórkowym.Po pięciu latach badań niedawno wykazano, że wymuszona ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych może przeprogramować fibroblasty skóry, nadając im pluripotencję. Znaczenie tego odkrycia jest ogromne. Poza istotnością dla biologii podstawowej, pozwala ono również przełamać główne zastrzeżenia etyczne dotyczące wykorzystania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w terapii przeszczepowej.Aby doszło do przeprogramowania, cztery geny kodujące czynniki transkrypcyjne Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4 muszą zostać zapakowane i wprowadzone do hodowli tkankowej lentiwirusów. Następnie do naczynia z hodowlą komórkową zawierającą wysoką gęstość fibroblastów dodaje się pożywkę z oczyszczonym wirusem, po czym w naczyniu zachodzi niezwykłe zjawisko. Niewielka frakcja fibroblastów zostaje zainfekowana wszystkimi czterema wirusami przenoszącymi czynniki transkrypcyjne i zaczyna ulegać dedyferencjacjach.Ulegają one drastycznym zmianom w morfologii i proliferacji, a następnie zaczynają dzielić się, tworząc duże sferoidalne skupiska pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po dwóch do trzech tygodniach hodowli w warunkach przeznaczonych dla embrionalnych komórek macierzystych, kolonie przeprogramowanych fibroblastów mogą zostać wyizolowane manualnie i powielone in vitro. Po oczyszczeniu komórki te mogą zostać wykorzystane do generowania myszy chimerycznych, w których określony procent komórek pochodzących z tych dedyferencjonowanych fibroblastów może przyczynić się do budowy różnych tkanek myszy.W chimerach, w których materiał genetyczny pierwotnych fibroblastów wbudował się do linii zarodkowej, kod genetyczny jest przekazywany kolejnym pokoleniom. Choć wykorzystanie wirusowego systemu dostarczania stanowi obecnie przeszkodę w zastosowaniach klinicznych, prawdopodobnie zostanie to wkrótce rozwiązane. W tym filmie członkowie laboratorium Yin zaprezentują, w jaki sposób indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są otrzymywane z embrionalnych fibroblastów myszy.Witajcie, jestem Grant Welted z laboratorium Rudolpha Jisha w Whitehead Institute for Biomedical Research w Cambridge w stanie Massachusetts. A ja jestem Tobias Bro brink, również z laboratorium Jisha. Dzisiaj zaprezentujemy proces generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wprowadzenie czterech cDNA: OCT four, SOX two, CIC oraz KF four, przy użyciu lentiwirusów wykazujących ekspresję tych czterech cDNA z promotora Tet OCMV.Umożliwia to precyzyjną kontrolę ekspresji tych czterech transgenów po infekcji embrionalnych fibroblastów myszy. Protokół, który prezentujemy dzisiaj, wiąże się z obchodzeniem się z lentiwirusem, który może potencjalnie infekować komórki ludzkie. Jest kluczowe, aby zawsze przestrzegać procedur bezpieczeństwa i skontaktować się z biurem ds. bezpieczeństwa przed samodzielną próbą wykonania tej procedury.Wygenerujmy zatem komórki iPS, aby wytworzyć lentiwirusy, które przekształcą komórki mezenchymalne w komórki iPS. Komórki 293 muszą zostać przetransfekowane trzema plazmidami: Pak스로 2, który dostarcza niezbędnych elementów genetycznych do pakowania wirusa; szkieletem wirusowym, którym jest lentiwirus FUW TE OCMV z jednym z czterech czynników CD aids T4, SOX 2, KLA 4 lub CMIC PMDG; oraz plazmidem wykazującym ekspresję glikoproteiny otoczki wirusa zapalenia pęcherzykowego stanu jamowego lub VSV.W ten sposób powstaje wirus, który posłuży do generowania wirusa atropowego. W związku z tym należy przestrzegać odpowiednich procedur poziomu BSL-2+. W tym konkretnym filmie nie pracujemy z wirusem zakaźnym, dlatego nie mamy na sobie typowych fartuchów ochronnych i nie znajdujemy się w naszej placówce BSL-2+.Przed transfekcją komórki 2, 9 3 są rozmrażane z ciekłego azotu i hodowane do 90% konfluencji. Następnie komórki są transfekowane genem FU i inkubowane przez 48 do 72 godzin w celu ekspresji wirusa; po tym czasie pożywka hodowlana jest filtrowana za pomocą filtra 0,45 mikrona i zagęszczana metodą ultrawirowania. Po zagęszczeniu wirusa jesteśmy gotowi do infekcji MES w celu generowania klastrów IPS. Podczas etapów przygotowania wirusa, embrionalne fibroblasty mysie o numerze pasażu mniejszym niż trzy są hodowane do 90% konfluencji w szalkach 10 centymetrowych, przy zastosowaniu około 2×10⁶ komórek na szalkę. W tym konkretnym protokole eksperymentalnym używamy MES wykazujących ekspresję RTTA, co jest kluczowe dla ekspresji doksycykliny oraz GFP z endogennego locus OC4.Komórki MES są negatywne pod kątem GFP, natomiast prawdziwe komórki iPS stają się pozytywne pod kątem GFP. Marker ten umożliwia zastosowanie metody identyfikacji przeprogramowanych komórek MES. Odessać pożywkę hodowlaną z fibroblastów i przemyć 10 ml PBS-EDTA, odrzucić PBS-EDTA, dodać 5 ml trypsyny 1x i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Trypsyna pomoże odkleić komórki od dna naczyń.Następnie dodaj 9 ml pożywki hodowlanej, aby resuspenderć komórki w formie zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Komórki te są następnie wirowane w celu uzyskania osadu. Po resuspensji osadu należy policzyć liczbę komórek w zawiesinie i dostosować ich stężenie do poziomu 8 × 10⁴ komórek/ml.Następnie 10 ml zawiesiny komórkowej przenosi się do 10-centymetrowej płytki powlekanej żelatyną. Płytkę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po nocnej inkubacji medium z płytki z fibroblastami odsysa się i dodaje 10 ml medium zawierającego wirusa. Komórki inkubuje się od czterech godzin do całej nocy w temperaturze 37°C i 5% CO2.Następnego dnia odessaj pożywkę z płytki z fibroblastami, a następnie dodaj 10 ml świeżej pożywki ESL. Na tym etapie komórki można zamrozić, namnożyć lub przygotować do rozpoczęcia przeprogramowania. Aby zainicjować przeprogramowanie, zastąp zwykłą pożywkę ESL pożywką zawierającą doksycyklinę, aby wywołać ekspresję czterech genów.Umieść te komórki w inkubatorze i zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie osiągną odpowiednią wielkość do pobrania. Kolonie powinny stać się widoczne mniej więcej tydzień po rozpoczęciu reprogramowania. Powinny osiągnąć wielkość umożliwiającą ich pobranie około 20. dnia.Po upływie 20 dni można przystąpić do pobierania kolonii iPS przed selekcją poszczególnych kolonii. Należy pamiętać o przygotowaniu wymaganej liczby 24-dołkowych płytek pokrytych żelatyną z gamma-naświetlonym DR four myths na jedną do dwóch godzin przed pobieraniem. Przed samym pobieraniem należy zasilić kolonie na płytkach, dodając świeżą pożywkę. Bezpośrednio przed pobieraniem należy dodać 50 µL buforu HEPA do dołków V-kształtnej płytki 96-dołkowej. Płytkę zawierającą kolonie do pobrania należy jednorazowo przemyć PBS, a następnie dodać do niej 10 ml PBS. Agregaty komórek iPS można pobierać przy użyciu mikroskopu stereoskopowego lub odwróconego.Za pomocą końcówki małej pipety pobierz kolonie i przenieś je do dołka płytki 96-dołkowej zawierającej PBS, aby usunąć skupiska. Końcówką pipety wykonaj ruchy okrężne wokół skupiska, aby rozbić agregaty komórek. Obecnie przeprogramowane komórki można wyekstrahować za pomocą pipety wielokanałowej, dodając 20 µL trypsyny do każdego dołka.Przenieś zawiesinę w górę i w dół pipetą trzy razy, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery minuty. Po czterominutowej inkubacji dodaj 100 µL pożywki ES do kolonii. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, a następnie przenoś po sześć klonów naraz.Przenieś komórki z naczynia 96-dołkowego do naczynia 24-dołkowego, używając końcówki w co drugiej pozycji pipety wielokanałowej (12-miejscowej). Następnie hoduj komórki na płytce 24-dołkowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2, aż osiągną 80-90% konfluencji, uzupełniając medium dla komórek ES. Komórki będą prawdopodobnie gotowe do pasażowania w ciągu trzech do siedmiu dni. Po kilku dniach, gdy komórki iPS osiągną konfluencję, odessij medium i przemyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS i dodaj 100 µl 1x trypsyny, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez 10 minut. Po inkubacji z trypsyną dodaj 400 µl medium ESL i resuspenduj komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Następnie 500 µL zawiesiny pojedynczych komórek z płytki 24-dołkowej przenosi się do jednego dołka płytki 6-dołkowej i inkubuje w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż komórki osiągną konfluencję na poziomie 80 do 90% w płytce 6-dołkowej. W tym momencie można przystąpić do amplifikacji komórek w celu analizy Southern, uzyskania blastocyst, iniekcji, testów teratoma lub testów różnicowania in vitro. Należy pamiętać o zamrożeniu zapasowych fiolek tych komórek, aby nie utracić tego cennego zasobu komórek iPS.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak indukowć pluripotencję w embrionalnych fibroblastach mysich przy użyciu indukowalnego systemu przeciwwirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa eksperymentach.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie komórek iPS z MEFS poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Opisujemy tutaj protokół generowania iCM za pomocą retrowirusowego dostarczania Gata4, Tbx5 i Mef2c w konstrukcji policistronicznej. Protokół ten daje stosunkowo jednorodną populację przeprogramowanych komórek o zwiększonej wydajności i jakości, co jest cenne dla przyszłych badań nad przeprogramowaniem iCM.

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Poznaj metodę generowania komórek iPS z fibroblastów zarodowych myszy przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół obejmuje transfekcję, infekcję i izolację kolonii pluripotentnych.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Przeglądaj więcej filmów