Name: Obrazowanie genów reporterowych bioluminescencji in vitro i in vivo ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie proliferacji komórek po transplantacji w modelu mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podziękowania kierujemy do dr. Tima Doyle'a oraz Stanford Center for In Vivo Imaging za pomoc w obrazowaniu bioluminescencyjnym. Dziękujemy również dr Ngan Huang za udostępnienie techniki współwstrzykiwania komórek macierzystych z roztworem macierzy. Na koniec dziękujemy dr. Steve'owi Feltowi za pomoc w opiece weterynaryjnej nad zwierzętami.

<ol>
<li>Konstrukcja podwójnego genu reporterowego z fuzją<ol>
<li>W celu przeprowadzenia obrazowania bioluminescencyjnego ludzkich embrionalnych komórek macierzystych należy najpierw uzyskać komórki stabilnie wyrażające gen reporterowy lucyferazy, taki jak lucyferaza świetlikowa, pod kontrolą promotora konstytutywnego, np. Ubikwityny lub EF1a.</li>
<li>Niniejszy protokół koncentruje się na zastosowaniach genu reporterowego, dlatego nie przedstawiono tu szczegółowych procedur jego tworzenia. Jednak ogólna strategia naszego laboratorium polega na wykorzystaniu wektora z konstruktem podwójnej fuzji zawierającego lucyferazę świetlikową (fluc) i wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (egfp), rozdzielone sekwencją łącznikową (spacerem) w pCDNA 3.1+.</li>
<li>Krótko mówiąc, nasz gen podwójnej fuzji znajdował się pierwotnie poniżej promotora cytomegalovirus w pCDNA 3.1(+), zatem fragment o długości 3,3 kbp wycięto za pomocą trawienia enzymami NdeI i NotI, a następnie podano ligację końców tępych do miejsca wielokrotnego klonowania w samoinaktywującym (SIN) wektorze lentiwirusowym, pod kontrolą promotora Ubikwityny. </li>
</ol></li>
<li>Transdukcja lentiwirusowa<ol>
<li>hESC można transdukować 3-5 dni po pasażowaniu przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 (miano wirusa około 10⁷ inkubowane z 10⁶ komórkami).</li>
<li>Rozmrożony zapas wirusa można dodać bezpośrednio do świeżej pożywki hESC.</li>
<li>Wymień pożywkę po 12 i 24 godzinach.</li>
<li>Po 48 h wydajność transdukcji można ocenić jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie można zastosować FACS do izolacji zainfekowanych komórek. </li>
</ol></li>
<li> hodowla hESC i wprowadzenie do konfiguracji obrazowania<ol>
<li>Hoduj hESC wykazujące pozytywny wynik dla lucyferazy w warunkach bezkarmiących (feeder-free). Zazwyczaj stosujemy standardowy protokół WiCell i używamy płytek 6-dołkowych pokrytych Matrigelem o zredukowanej zawartości czynników wzrostu, stosując albo pożywkę kondycjonowaną, albo komercyjną pożywkę bezkarmiącą.</li>
<li>Aby wykryć komórki pozytywne pod kątem lucyferazy, należy przygotować sondę reporterową D-lucyferynę. W tym celu przygotuj alikwoty lucyferyny w objętości 1-1,5 mL o końcowym stężeniu 45 mg/mL. Alikwoty przechowuj w temperaturze -20°C, gdy nie są używane, i unikaj wystawiania na światło, przykrywając je ręcznikiem papierowym poza magazynowaniem.</li>
<li>Do wizualizacji komórek pozytywnych pod kątem lucyferazy używamy systemów obrazowania IVIS 50 oraz IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Ten drugi system zawiera zintegrowany aparat do podawania izofluranu i komorę indukcyjną do tymczasowej anestezji małych zwierząt. </li>
</ol></li>
<li>In vitro obrazowanie bioluminescencyjne hESC<ol>
<li>W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego in vitro ważne jest zachowanie warunków sterylnych. Dlatego system obrazowania powinien być sterylny, najlepiej znajdować się w pomieszczeniu do hodowli komórek.</li>
<li>Przed obrazowaniem usuń pożywkę komórkową i dodaj tylko tyle PBS, aby przykryć komórki. Na przykład dodaj 1 mL PBS do każdego dołka płytki 6-dołkowej zawierającej Twoje hodowle hESC.</li>
<li>Stosunek D-lucyferyny do PBS powinien wynosić 1:100, zatem dodaj 10 µL rozmrożonej D-lucyferyny do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
<li>Odczekaj jedną minutę, a następnie wykonaj zdjęcie, stosując czas ekspozycji 1 sekundy. Jeśli sygnał jest słaby, wydłuż interwał ekspozycji i spróbuj ponownie.</li>
<li>Sygnał bioluminescencyjny odzwierciedla liczbę komórek, zatem można przeprowadzić testy ilościowe korelujące sygnał z różną liczbą komórek. </li>
</ol></li>
<li>Przygotowanie myszy i wstrzykiwanie komórek do obrazowania in vivo<ol>
<li>Obrazowanie genu reporterowego zapewnia wysokoprzepustową, niedrogą i czułą metodę śledzenia komórek po transplantacji w ciągu dni, tygodni, a nawet miesięcy. Jest to szczególnie istotne, ponieważ transplantowane komórki macierzyste często tworzą potworniaki, są odrzucane przez układ odpornościowy gospodarza lub po prostu obumierają.</li>
<li>Najprostszą metodą obrazowania tworzenia potworniaków in vivo jest wstrzyknięcie hESC wyrazających gen reporterowy lucyferazy świetlikowej w grzbiet myszy SCID i pozyskanie obrazów bioluminescencyjnych za pomocą systemu IVIS.</li>
<li>Gdy będziesz gotowy do transplantacji komórek, użyj dispazy lub kolagenazy, aby poluzować komórki, przemyj je kilka razy i zawieś w mieszaninie 1:1 Matrigelu o zredukowanej zawartości czynników wzrostu oraz DMEM. Zazwyczaj najpierw mieszamy komórki z schłodzonym DMEM, a następnie dodajemy Matrigel. Do każdego miejsca wstrzyknięcia podskórnego wstrzykujemy 200 000 komórek zawieszonych w objętości 50-100 µL mieszaniny Matrigel/DMEM. Liczbę komórek można dostosować w zależności od zastosowania. Pamiętaj, aby przed wstrzyknięciem trzymać wszystko w lodzie.</li>
<li>Gdy komórki będą gotowe, poddaj mysz anestezji, umieszczając ją w komorze indukcyjnej z włączonym przepływem izofluranu. Po 1-5 minutach mysz zasypia i może zostać umieszczona na stole operacyjnym przy ciągłym podawaniu izofluranu.</li>
<li>Ponieważ futro naturalnie autofluoryzuje i może przesłaniać obraz bioluminescencyjny, należy usunąć włosy z grzbietu myszy. Najłatwiejszym sposobem jest użycie golarki elektrycznej, ale można również zastosować żele do depilacji. Następnie przemyj skórę alkoholem w celu sterylizacji.</li>
<li>Następnie nabierz zawiesinę komórkową do strzykawki. Najlepiej sprawdzają się igły o rozmiarze od 23 do 27 G, ponieważ nie zapychają się komórkami. Jeśli igła jest zbyt duża (&lt;23 G), kanał igły może pozostawić duży otwór, przez który komórki mogą wyciekać na zewnątrz.</li>
<li>Wstrzyknij komórki pod skórę w grzbiet myszy. Ponieważ skóra jest dość luźna, użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć i rozciągnąć obszar, w który chcesz wstrzyknąć. Wstrzyknij bezpośrednio pod skórę, uważając, aby nie przebić jej zbyt głęboko. Staraj się również nie wysuwać igły z miejsca wstrzyknięcia podczas naciskania tłoka: zapobiegnie to powstaniu otworu w skórze, przez który komórki mogłyby wyciekać w przypadku ponownej próby wstrzyknięcia.</li>
<li>Po wstrzyknięciu komórek odczekaj kilka godzin, aby mysz obudziła się i mogła się poruszać, zanim ponownie poddasz ją anestezji do obrazowania bioluminescencyjnego. Pozwala to uniknąć toksyczności izofluranu. </li>
</ol></li>
<li>In vivo obrazowanie bioluminescencyjne transplantowanych komórek<ol>
<li>W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego całego zwierzęcia wykonujemy wstrzyknięcie domięśniowe D-lucyferyny w dawce 375 mg/kg masy ciała. Przed wstrzyknięciem zważ zwierzę, aby obliczyć dawkę.</li>
<li>Wstrzyknij D-lucyferynę do otrzewnej, nieco obok linii środkowej. Uważaj, aby nie wbić igły zbyt głęboko, ponieważ możesz uszkodzić organy wewnętrzne. Jeśli mysz zacznie się budzić, umieść ją ponownie w komorze indukcyjnej i odczekaj minutę lub dwie. U myszy maksymalna bioluminescencja występuje zazwyczaj 15-40 min po wstrzyknięciu.</li>
<li>Pamiętaj o umieszczeniu matowego czarnego papieru w komorze obrazującej, aby pomóc w absorpcji światła nieemitowanego przez hESC. Umieść mysz (grzbietem do góry) w komorze obrazującej z izofluranem, na czarnym papierze. Zacznij od czasu ekspozycji 10 sekund. Jeśli sygnał jest nasycony, spróbuj skrócić czas ekspozycji; jeśli jest zbyt słaby, wydłuż go.</li>
<li>Gdy czas ekspozycji sygnału zostanie zoptymalizowany dla danej myszy, zacznij wykonywać zdjęcia w odstępach minutowych, aż sygnał osiągnie maksimum. Najlepiej zrobić to, używając oprogramowania do obrazowania w celu zaznaczenia „obszarów zainteresowania (ROI)”, które obejmują miejsca wstrzyknięcia. Monitorując intensywność sygnału w każdym ROI, można łatwo określić, kiedy sygnał zaczyna spadać, co wskazuje na osiągnięcie maksymalnej intensywności. Maksymalny sygnał powinien zostać przyjęty jako końcowa dana.</li>
<li>Po uzyskaniu satysfakcjonujących obrazów usuń mysz z izofluranu i pozwól jej obudzić się w klatce. Zazwyczaj mysz powinna obudzić się w ciągu 15 minut.</li>
<li>Obrazowanie bioluminescencyjne genu reporterowego można powtarzać codziennie, co tydzień i co miesiąc, dopóki hESC przeżyją w organizmie zwierzęcia. Sygnał z rozwijającego się potworniaka będzie rósł wykładniczo w czasie, zazwyczaj w skali tygodni, w miarę proliferacji hESC.</li>
<li>Po uzyskaniu pożąganego przebiegu czasowego obrazów bioluminescencyjnych zwierzę może zostać uśpione, a przekroje tkanek wykorzystane do badań histologicznych.</li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Passier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cardiomyocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures.</a> Stem Cells. 23, 772-780 (2003).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Baharvand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+adherent+culture+conditi%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi.</a> Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> BMC Neurosci. 4, (2007).</li>
<li>Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Insulin-producing+Islet-like+Clusters+from+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 17, 17- (2007).</li>
<li>Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+hurdles+for+the+transplantation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+role+of+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).</li>
<li>Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging%3A+looking+at+problems%2C+seeing+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions.</a> Science. 302, 605-608 (2003).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature medicine. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Bhaumik, S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+Renilla+luciferase+reporter+gene+expression+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).</li>
<li>Tisi, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+thermostable+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Analyica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a thermostable firefly luciferase.</a> Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22.+Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Embryonic+Stem+Cell+Misbehavior+and+Suicide+Gene+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation.</a> Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+reporter+genes+for+molecular+imaging+of+transplanted+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells.</a> Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells%3A+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).</li>
<li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Level+Sustained+Transgene+Expression+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Using+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors.</a> Stem Cells. 21, 111-117 (2003).</li>
<li>Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+hematopoietic+cells+differentiated+from+human+embryonic+stem+cell-derived+CD45%28neg%29PFV+hemogenic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors.</a> Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem cells. 26, 119-126 (2008).</li>
<li>Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.</li>
</ol>

W porównaniu z innymi metodami, takimi jak PET i MRI, bioluminescencja charakteryzuje się ograniczoną rozdzielczością przestrzenną i mniejszą penetracją tkanek ze względu na stosunkowo niską energię emitowanych fotonów (2-3 eV); z tych powodów nie była ona dotychczas stosowana u dużych zwierząt. Jednak bioluminescencja ma tę zaletę, że jest tania, wysokoprzepustowa i nieinwazyjna, co czyni ją wysoce pożądaną w badaniach in vivo nad śledzeniem komórek macierzystych u małych zwierząt. Geny reporterowe niebioluminescencyjne...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;modyfikowane podłoże Eagle&amp;rsquo;podłoże DMEM</td><td></td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&amp;#8482; Macierz błony podstawnej</td><td>o obniżonej zawartości czynników wzrostu (opcjonalnie: bez czerwieni fenolowej)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka podtrzymująca mTeSR1 dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych</td><td></td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS)</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny świetlika</td><td></td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenazy IV</td><td></td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 30 mg kolagenazy typu IV w 30 ml pożywki DMEM-F12. Przefiltrować sterylnie i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Wypalane pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe traktowane do hodowli tkanek</td><td></td><td>Produkty z tworzyw sztucznych Techno</td><td>92006</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

Odkrycie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) znacząco zwiększyło liczbę narzędzi dostępnych dla naukowców z dziedziny medycyny zainteresowanych medycyną regeneracyjną. Jednak bezpośrednie wstrzykiwanie hESCs oraz komórek z nich zróżnicowanych do żywych organizmów było dotychczas utrudnione przez znaczną śmiertelność komórek, tworzenie się potworniaków oraz odrzut immunologiczny gospodarza. Zrozumienie zachowania hESC in vivo po transplantacji wymaga zastosowania nowoczesnych technik obrazowania w celu podłużnego monitorowania lokalizacji, proliferacji i żywotności hESC. Obrazowanie molekularne dostarczyło badaczom wysokoprzepustowej, niedrogiej i czułej metody śledzenia proliferacji komórek in vivo w ciągu dni, tygodni, a nawet miesięcy. Postęp ten znacznie poszerzył wiedzę na temat czasowo-przestrzennej kinetyki przyjmowania przeszczepu, proliferacji i tworzenia potworniaków przez hESC u żywych osobników.

Istotnym postępem w obrazowaniu molekularnym było rozszerzenie nieinwazyjnych testów genów reporterowych z biologii molekularnej i komórkowej na wielomodalne platformy obrazowania in vivo. Geny reporterowe te, kontrolowane przez zaprojektowane promotory i enhansery wykorzystujące aparat transkrypcyjny komórki gospodarza, są wprowadzane do komórek za pomocą różnych metod wektorowych i niewektorowych. Po dostaniu się do komórki geny reporterowe mogą być transkrybowane konstytutywnie lub tylko w określonych warunkach biologicznych bądź komórkowych, w zależności od zastosowanego typu promotora. Transkrypcja i translacja genów reporterowych w białka bioaktywne są następnie wykrywane za pomocą czułej, nieinwazyjnej aparatury (np. kamer CCD) przy użyciu sond generujących sygnał, takich jak D-lucyferyna.

Aby uniknąć konieczności stosowania światła wzbudzającego do śledzenia komórek macierzystych in vivo, co jest wymagane w przypadku obrazowania fluorescencyjnego, systemy obrazowania genów reporterowych bioluminescencyjnych wymagają jedynie egzogenicznie podanej sondy w celu wywołania emisji światła. Luczyferaza świetlika, pochodząca z gatunku Photinus pyralis, koduje enzym katalizujący przemianę D-lucyferyny w optycznie aktywny metabolit, oksylucyferynę. Aktywność optyczną można następnie monitorować za pomocą zewnętrznej kamery CCD. Stabilnie transdukowane komórki, które posiadają konstrukt reporterowy w swoim DNA chromosomowym, przekażą DNA konstruktu reporterowego komórkom potomnym, co umożliwia podłużny monitoring przeżycia i proliferacji hESC in vivo. Ponadto, ponieważ do generowania sygnału niezbędna jest ekspresja produktu genu reporterowego, sygnał bioluminescencyjny będą emitować jedynie żywe komórki macierzyste i potomne; komórki apoptotyczne lub martwe nie będą go wytwarzać.

W tym filmie zostaną opisane konkretne materiały i metody niezbędne do śledzenia proliferacji komórek macierzystych oraz tworzenia potworniaków za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Odkrycie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) znacząco zwiększyło liczbę narzędzi dostępnych dla naukowców medycznych zainteresowanych regeneracyjną...

W warunkach in vivo tworzenie potworniaków jest złotym standardem określania pluripotencji komórki lub jej zdolności do tworzenia wszystkich trzech listków zarodkowych. Potworniaki stanowią również istotną przeszkodę w transplantacji komórek macierzystych, a obecnie niewiele wiadomo o ich powstawaniu w kontekście kinetyki wzrostu. Po wszczepieniu niezróżnicowanych komórek do środowiska gospodarza, rozwój genów reporterowych bioluminescencyjnych, transdukcja genów oraz zastosowanie ultraszybkiej fotografii z użyciem urządzeń CCD (charge coupled device) umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę lokalizacji, migracji, proliferacji i różnicowania komórek in vivo.W tym filmie zaprezentujemy szczegółowy protokół skutecznego śledzenia proliferacji przeszczepionych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w żywej myszy. Witajcie, jestem Kit Wilson z laboratorium Josepha Wu w Katedrach Medycyny i Radiologii na Uniwersytecie Stanforda. Dzisiaj przedstawimy procedury obrazowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, zarówno in vitro, jak i po transplantacji do żywej myszy.Procedury te obejmują następujące etapy: obrazowanie bioluminescencyjne ludzkich embrionalnych komórek macier

in-vitro-vivo-bioluminescence-reporter-gene-imaging-human-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie genów reporterowych bioluminescencji in vitro i in vivo ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę obrazowania bioluminescencyjnego in vivo genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych wstrzykniętych do mózgu myszy. Proces obejmuje wstrzyknięcie lucyferyny, przygotowanie obrazowania i wykrywanie sygnałów bioluminescencyjnych z przeszczepionych komórek w miejscu...

Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie proliferacji komórek po transplantacji w modelu mysim.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów